المؤلفين أشكر أدلين دوللي للصور من يزدرع على فبرونيكتين، اريك Theveneau لإجراء مناقشات مفيدة ومرفق الحيوان من معهد كوري. CM هو زميل ما بعد الدكتوراه لمنطقة إيل دي فرانس (دومين من أجل المصلحة فيل الجذعية القطب)، جامعة باري سود (الملحق Temporaire كوت ENSEIGNEMENT آخرون للبحوث)، والوكالة الوطنية للبحوث لا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة باري سود (Attractivite 2011)، والمركز الوطني للبحوث العلميه (برنامج العمل Thematique آخرون Incitative سور)، والرابطة من أجل لا مناهضة بحوث السرطان جنيه منحة SFI20101201882، الدوري الفرنسي الدرجة مناهضة جنيه للسرطان، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (الوكالة الوطنية للبحوث برنامج لا بلان).

تجارب الامتثال التنظيم الوطنية والأوروبية لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية ومع المبادئ المعمول بها دوليا من استبدال، والحد من والصقل. 1. إعداد أطباق فبرونيكتين المغلفة-14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 500 مل من 10 ملغ / مل ثقافة الصف فبرونيكتين المخفف في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري البلاستيكية القياسية (Ø 40 × 11 مم). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة: في حالة استخدام الأطباق الزجاجية أو coverslips الزجاج للتصوير لاحقة، واستخدام 100 ملغ / مل حل فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال برنامج تلفزيوني مع 500 مل من 1X PBS/0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مع برنامج تلفزيوني 1X والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى استخدام (عادة لمدة 24-48 ساعة). </li></ol> 2. تشريح إإكسبلنتس NC &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3/4 عادي البرمائيات متوسطة (NAM) (110 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 1 ملي كا (NO 3) 2، 1 ملم MgSO 4، 0.1 ملي EDTA، 1 مم 3 NaHCO، 0.2x برنامج تلفزيوني، 50 ملغ / مل جنتاميسين 10،15). لا تبقي أكثر من 1 في الاسبوع للتشريح، المحل في 4 درجات مئوية. أقدم حركة عدم الانحياز يمكن أن تستخدم لإعداد أطباق تشريح المغلفة الاغاروز (أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 60 ملم أطباق بتري لتشريح، المغلفة مع 10 مل من 2٪ الاغاروز في 3/4 حركة عدم الانحياز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أدوات تشريح: ماصات باستور البلاستيك، شنت أرقى دبوس الحشرات على حامل دبوس (انظر الجدول مواد للمرجعية)، وهي &quot;سكين الحاجب&quot; (المصنوع من شعر الحاجب جزءا لا يتجزأ من البارافين في غيض من ماصة باستير الزجاج 16)، واثنين من الغرامة ملقط تشريح، ماصة P1000 ونصائح، المجسام مجهر مع التكبير 40X-8 إلى 50، مصدر الضوء الساطع مع أدلة الألياف البصرية. يجب أن تبقى جميع الأدوات تشريح نظيفة، وبعد كل تجربة، وشطف لهم مرتين مع الماء المقطر، مرة واحدة وايال 100٪ من الإيثانول واسمحوا الجافة. تخزين بعيدا عن الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق تشريح مع حركة عدم الانحياز جديدة تقريبا إلى الأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على X. المورق الأجنة وفقا للاجراءات المتبعة 10 والسن منهم حتى بلوغهم المرحلة العصيبة 16 (وفقا لNieuwkoop وفابر الجدول التنموية 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المرحلة 16 الأجنة في طبق تشريح باستخدام البلاستيك ماصة باستير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة ضمن نطاق مجهر. إزالة الغشاء المحي مع اثنين من أزواج من ملقط. يجب الحرص على عدم تلف جزء الظهري للأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حتى وصلت إلى مرحلة الأجنة 17 لبدء تشريح. المرحلة 17 من المناسب منذ تم تعيين بوضوح قمة العصبية وبصرف النظر عن الأنبوب العصبي، وعلى النقيض من المراحل السابقة. بعد المرحلة 17، NC يبدأ الهجرة والاختلاط مع اللحمة المتوسطة المحيطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر حفرة صغيرة في الاغاروز مع ملقط لجعل مكانة لأجنة من أجل الحفاظ علىلهم أثناء تشريح. مكان واحد الجنين حتى الجانب الظهري. ملاحظة: الصلصال يمكن استخدامها للحفاظ على الأجنة بدلا حفر حفرة في الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجزء الجانبي من حظيرة العصبية الأمامي مع سكين الحاجب ودبوس الحشرات. الحرص على عدم ذهاب عميق جدا في الجنين: تهدف إلى خفض خلال 2-3 طبقات الخلية (لم تصل عميقة كما في المعى البدائي!) أثناء عملية تشريح كاملة، أبدا السماح للأنسجة تشريح للدخول في اتصال مع واجهة الهواء السائل منذ X. والأنسجة الجنينية هي lysed المورق كتبها التوتر السطحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق مواز الثاني في أكثر الظهرية جزء من العصبية أضعاف باستخدام نفس الأدوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتحويل طبق حوالي 90 درجة. جعل شق عمودي الثالث مع سكين الحاجب ودبوس الحشرات، في الجانب الخلفي من شقوق الأولين. وNC هو كتلة سميكة من الخلايا تحت الطبقة الخارجية من الأديم الظاهر المصطبغة، الوحشيإلى الأنبوب العصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض من سكين الحاجب لفصل طبقة الأديم الظاهر المصطبغة من NC الأساسية، بدءا من حافة شق ثالث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام جانب سكين الحاجب لفصل الأنسجة NC بدءا من شق ثالث. الأنسجة NC هو رمادي بدلا من ذلك، في حين أن الأديم المتوسط ​​رأسي الأساسي هو الأبيض. فصل بعناية NC من الأديم المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأنسجة NC الأمامية من الحويصلة البصرية، وقطع على هذا المستوى لتحرير ازدراع. كعنصر تحكم عن التجارب الأولى، والتحقق من التعبير snail2 (أ NC علامة الكنسي) في بعض إإكسبلنتس بواسطة التهجين في الموقع ويوصى. </li></ol> 3. طلي إإكسبلنتس على فيبرونكتين] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعبئة في طبق المغلفة فبرونيكتين مع التعديل Danilchick متوسطة (MDM، كلوريد الصوديوم 53 ملي، Na2CO 3 5 ملم، K غلوكونات 4.5 ملم، 32 ملم غلوكونات الصوديوم، MgSO 4 1 ملم، و CaCl 2 1 ملم، 0.1٪ BSA، وضبط درجة الحموضة إلى 8.3 مع 1 M Bicine <sup&gt; 18). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين باستخدام ماصة P1000. لم تسمح لل explants للمس واجهة الهواء السائل. الأولى، ماصة بعض السائل إلى الحافة، ثم لل explants، ثم بعض السائل مرة أخرى. لا تسمح لأي طرف في الهواء أثناء نقل لل explants في طبق المغلفة فبرونيكتين. مرة واحدة غيض داخل السائل من صحن المغلفة فبرونيكتين، والسماح لل explants يذهب ببطء عن طريق الجاذبية، أو دفع بلطف شديد. تجنب إخراج لل explants سريع جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 10-30 إإكسبلنتس في الطبق باستخدام سكين الحاجب. تجنب جوانب الطبق، والتي هي غير كافية للتصوير اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليس محاولة لتحريك الطبق حتى تعلق لل explants على فبرونيكتين (يستغرق حوالي 15-30 دقيقة). إذا لزم الأمر، قم بتحريك الطبق بعناية فائقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق في الحاضنة المبردة (بين 15-20 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الرسم البياني لنرى 17). عندما وضعت في 15 درجة مئوية، وخلايا عه عادة المهاجرة بكفاءة ونثر بعد 6 ساعة من الحضانة (قد تختلف هذا التوقيت بين التجارب). </li></ol> 4. تطعيم إإكسبلنتس في الأجنة المضيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ساترة الزجاج غرامة الى قطع صغيرة جدا باستخدام ملقط الخشنة. حجم القطع يجب أن يكون ما يقرب من 1.5 مم 2. تزج القطع في طبق بتري تحتوي على 3/4 حركة عدم الانحياز أو برنامج تلفزيوني باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجنين المضيف: تشريح خارج NC المضيفة في 3/4 كما هو موضح في حركة عدم الانحياز 3) مع عناية خاصة لا تضر الجنين المضيف أثناء إزالة الغشاء المحي وتشريح NC. التوتر الأنسجة يميل إلى زيادة حجم الاجتثاث: لندع الجنين المضيف شفاء جزئيا في حين تشريح الجنين المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في طبق المغلفة الاغاروز آخر أو في جزء آخر من نفس الطبق، تشريح خارج يزدرع NC من الجنين المانحة كما هو موضح في البروتوكول 3. نقل الكسب غير المشروع NC في طبق يحتوي على المضيف مع الرعاية، كما هو موضح فيبروتوكول 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الفور يزدرع NC على منطقة ذاب المضيف باستخدام ملقط. ازدراع يجب إرفاق جزئيا. وضع قطعة من الزجاج ساترة على الجنين المطعمة للحفاظ على الكسب غير المشروع في المكان. اختيار قطعة من الزجاج أكبر من الجنين لتجنب الإضرار بها. فإن الجنين يكون قليلا بالارض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 15-20 دقيقة على الأقل، ثم إزالة بلطف ساترة. دعونا الجنين استرداد لمدة 10 دقيقة أخرى وماصة بعناية في طبق نظيف مليئة 3/4 حركة عدم الانحياز، وذلك باستخدام البلاستيك ماصة باستير. </li></ol>

<ol>
	<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Stuhlmiller, T. J., Garc&#237;a-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction.">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates.">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li><li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration:+lessons+from+Xenopus+embryos.">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li><li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies.">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li><li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization.">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li><li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation.">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li><li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction.">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals.">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li><li>Sadaghiani, B., Thi&#233;baud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo,+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy.">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li><li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity.">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li><li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos.">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+Xenopus+laevis+(Daudin):+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis.">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , (1994).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beads+on+the+run:+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays.">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li><li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin.">Integrin &#945;5&#946;1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li><li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+RhoU/Wrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration.">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Kashef, J., K&#246;hler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases.">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li><li>Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis.">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Neural+Crest+Induction,+Melanocyte+Specification,+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs..">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs..</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration.">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration.">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration.">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li><li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2.">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li><li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration.">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li><li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification.">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis.">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li><li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues.">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول تقنية سهلة لازدراع premigratory الجمجمة NC في اكس الأجنة المورق. الأجنة المستخدمة في مثل هذه التجارب تحتاج إلى أن تكون قوية وتلتئم بشكل جيد. تجاهل أي دفعة من الأجنة غير صحية. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الأجنة في درجات حرارة مختلفة (من 12 إلى 18-20 درجة مئوية)، من أجل استئصال قمة العصبية في المرحلة 17 وليس في وقت لاحق. بعد المرحلة 17، قد تكون مختلطة مع قمة العصبية الأديم المتوسط ​​رأسي ولا يمكن إزالتها تماما. الأنسجة القيطم تلتئم بسرعة ومن ثم تفقد التصاق بهم إلى الأنسجة الأخرى. من المهم أن تعمل بسرعة ووضع إإكسبلنتس قمة العصبية في المضيف بمجرد أن يتم رفعه فإنه من الجهة المانحة. فيما يتعلق في تجارب المختبر، ويمكن الحصول على أطباق الثقافة فبرونيكتين الملوثة بالبكتيريا أو الفطريات بعد بضعة أيام. استخدام المواد والحلول المضادات الحيوية ونظيفة أو معقمة كلما كان ذلك ممكنا. هو الأمثل هذا الإجراء وأو قمة العصبية في الجمجمة. في الواقع، هذه الفئة من السكان الخلية ويعرف جيدا والمترجمة في المرحلة 17 الأجنة القيطم. للأسف، وهذا النموذج ليس مناسبا لإجراء مثل هذه التجارب على الجذع NC. أجنة الطيور هي أكثر مناسبة لأولئك الذين يرغبون في التلاعب مثل جذع السكان الخلية NC. لل explants الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من السلوك NC، سواء في الجسم الحي في المختبر. يتم حفظها البرنامج التنموي الجزيئي NC إلى حد كبير في الفقاريات 19. التنمية الضفدع هو نموذج قوي لدراسة الفقاريات NC EMT، والهجرة والتمايز. X. الخلايا الجنينية المورق تحتوي على صفار بما يكفي للسماح بقائهم على قيد الحياة في المختبر لعدة أيام دون إضافة أي المغذيات الخارجية. وبالتالي، يمكن أن الدراسات في المختبر اختبار تأثير عوامل النمو المختلفة أو المركبات الكيميائية، في مستنبت بسيطة وتسيطر عليها بالكامل. وكانت مثل هذه التجاربتهدف إلى تحليل EMT والهجرة، بما في ذلك دراسة آثار الكيماوي جاذبة أو الكيماوي طارد، تفعيل أو عرقلة مسارات الإشارات، الخ 14،20-24 يمكن أيضا أن هذا النهج أن تستخدم لتحسين تصميم بروتوكولات التمايز الموجهة NC. في سياق وضع بروتوكولات للطب التجديدي، والحصول على أنواع الخلايا المشتقة من NC المتنوعة في المختبر يمكن أن تستخدم في فحص المخدرات لفهم وعلاج neurocristopathies 25،26. ودبرت التنمية NC بواسطة تفاعل معقد بين الخلايا وائح الحكم الذاتي وإشارات من الأنسجة المحيطة بها. التلاعب التجريبية في التعبير الجيني، سواء في NC المانحة أو في الجنين المضيف، والسماح الخلية التمييز الحكم الذاتي من جوانب الحكم الذاتي noncell التنمية NC. الجمع بين المكسب من وظيفة وتدق إلى أسفل النهج لهذا البروتوكول للثقافة في المختبر والمجراة في تطعيم تم استخدام بنجاحد 14،21،23،27-36. هذه التقنية يمكن تكييفها لتطعيم الأنسجة الأخرى في الأجنة المضيفة واختبار للهجرة والتمايز إمكاناتها. على سبيل المثال، استخدمنا المحفزة الأديم الظاهر سقف blastocoel (في &quot;الغطاء الحيواني&quot;) للبحث عن مفتاح النسخي الحد الأدنى من أجل التنمية NC. درسنا تأثير اثنين من عوامل النسخ، pax3 وzic1، على التزام NC والتطور اللاحق. كانت مطلية القبعات الحيوان مع pax3 وzic1 مكاسب من وظيفة على فبرونيكتين في المختبر أو backgrafted في الأجنة المضيفة. وجدنا أن الخلايا Pax3/Zic1-induced تهاجر والتفريق مثل حسن النية الخلايا NC على حد سواء في التجارب المختبرية والأجنة المضيفة 12. وتشارك العديد من الآليات الجزيئية التي تتحكم NC EMT والهجرة أيضا في نشر المنتشر في سرطان 37. ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير بسيطة ورخيصة وefficiأداة الأنف والحنجرة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين في استكشاف الآليات الأساسية لهذه السلوكيات الخلية الرئيسية.

قمة العصبية (NC) هي الخلايا الجنينية عابرة السكان أن يخرج من الأنبوب العصبي في نهاية تكون العصيبة في أجنة الفقاريات. الأحداث إشارات والوراثية التي تتحكم في مواصفات NC تبدأ في وقت مبكر تكون المعيدة. يتم تحديد NC على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية التي كتبها إشارات من الأنسجة المحيطة الظهرية. في نهاية تكون العصيبة، والخلايا NC الخضوع لظهارة الانتقال إلى اللحمة المتوسطة (EMT) والهجرة على نطاق واسع في الجنين التالية الطرق النمطية من خلال الاستجابة لتوجيه العظة المحيطة. بمجرد أن وصلت إلى وجهتها النهائية، فإنها تفرق في مجموعة واسعة من المشتقات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية والعظام والغضاريف، والخلايا الصباغية 1-5. بسبب مساهمتها في العديد من أنواع الخلايا والأنسجة الجنينية، والعيوب في أي خطوة من تطوير خلايا NC، من الحث على التمايز النهائي، يمكن أن يسبب أعراض الخلقية اسمه neurocristopathies 6. Eالتلاعب xperimental من NC النامية في مراحل مختلفة - مواصفات، EMT، والهجرة، والتمايز - من شأنها تحسين فهمنا للneurocristopathies والسماح تصميم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. والمورق القيطم الجنين هو نموذج من خيار لدراسة تطوير NC. أعداد كبيرة من الأجنة من السهل الحصول عليها، والإخصاب الخارجي يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى من التنمية. العديد من الأدوات المتاحة لمعالجة تجريبيا اكس. المورق التطور الجنيني. مكسب من وظيفة وضربة قاضية الجينات هي سهلة لأداء microinjecting بواسطة الخلايا الفردية من blastulas في وقت مبكر. ويمكن خفض الأنسجة الجنينية في المختبر لإعادة الترابط 7-11 أو ترقيع العودة المقايسات 12،13. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح خارج premigratory NC في الجمجمة X. المورق neurulas في وقت متأخر، قبل الهجرة. يمكن تربيتها هذه إإكسبلنتس على فبرونيكتين-coateلوحات د لدراسة الهجرة وتمايز في التحكم في ظروف تجريبية المختبر. ويمكن أيضا أن المطعمة إإكسبلنتس NC في الأجنة المضيفة العادي أو التلاعب بها لدراسة هجرتها والتمايز في الجسم الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4759-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bovine Serum Albumine. Fraction V</td>
			<td style="width:71px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">04-100-811-C</td>
			<td>Lower quality grade may&#160; be suitable for this application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stainless Steel Insect Pins. Size 000</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td align="right" style="width:119px;">26001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

قمة العصبية (NC) هو السكان الخلية الظهرية الأنبوب العصبي عابرة أن يخضع لظهارة الانتقالية إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في نهاية تكون العصيبة، على نطاق واسع يهاجر نحو مختلف الأجهزة، ويميز في العديد من أنواع المشتقات (الخلايا العصبية، الدبقية، الغضاريف والعظام، والخلايا الصباغية والغدد الصماء). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تشريح الجمجمة NC premigratory من الأجنة القيطم المورق، من أجل دراسة تطوير NC في الجسم الحي في المختبر. نموذج الضفدع توفر العديد من المزايا لدراسة التطور المبكر؛ هي دفعات وفيرة والأجنة تتطور بسرعة، في الجسم الحي الربح والخسارة من وظيفة تسمح استراتيجيات التلاعب في التعبير الجيني قبل NC في تشريح المانحة و / أو الأجنة المضيفة. لل explants NC يمكن مطلي على فبرونيكتين وتستخدم لفي الدراسات المختبرية. أنها يمكن تربيتها لعدة أيام في وسط المصل خالية محددة. نحن أيضا تصف كيفية الكسب غير المشروع إإكسبلنتس NC العودةفي الأجنة المضيفة لدراسة الهجرة NC والتمايز في الجسم الحي.

عندما مطلي على فبرونيكتين، لل explants قمة العصبية إرفاق بسرعة (15-30 دقيقة) وازدراع ينتشر داخل شقة 2 ساعة (الشكل 1A). بعد 3-6 ساعة تبدأ في الخلايا مبعثر. في 24 ساعة عند 15 درجة مئوية، وقد بدأت العديد من الخلايا لتهاجر بعيدا عن ازدراع (الأرقام 1B و 1C). صفار يجعل الخلايا مشرق جدا تحت النقيض من المرحلة (الشكل 1B). نتوءات الخلية (filopodes وlamellipodes) واضحة للعيان بعد تلطيخ phalloidin من الهيكل الخلوي الأكتين (الشكل 1C). للتجربة تطعيم مثلي، تم حقن الأجنة المانحة مع GFP مرنا من أجل متابعة الخلايا المطعمة في الجنين المضيف غير المسماة. وقد ذاب في الجمجمة NC على جانب واحد من المضيف؛ 30-60 دقيقة بعد عملية جراحية تعافى الكسب غير المشروع، لتحل محل المضيف ذاب الجمجمة NC (الشكل 1D، 2 ساعة بعد التطعيم). وبعد بضع ساعات، هاجروا الخلايا GFP إيجابيةالخروج من ازدراع واتبعت طرق الهجرة النمطية للخلايا NC نحو مواقع القحفي بطني (الشكل 1E). في الضفادع الصغيرة، وضعت هياكل القحفي NC-مشتقة (الشكل 1G). عندما ذاب الجمجمة NC، وهذه الهياكل في عداد المفقودين، مما أدى إلى تقصير وجه مع العين المجاورة للغدة الاسمنت (الشكل 1H، السهام الحمراء). في الضفادع الصغيرة المطعمة، ساهمت خلايا NC المانحة إلى هياكل القحف الوجهي، مما أدى إلى وجهه مورفولوجيا العادي (أرقام 1F و1I، الأسهم الخضراء). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51118/51118fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51118/51118fig1.jpg" /> الشكل 1. في المختبر والمجراة في السلوك من explanted NC الجمجمة. AC) &#160; وكان تشريح Premigratory NCالخروج من مرحلة الجنين 17 العصيبة ومطلي على طبق المغلفة فبرونيكتين. A) 2 ساعة بعد الطلاء، وتولى ازدراع وانتشارها. B) 24 ساعة بعد الطلاء، وخلايا هاجروا بكفاءة على فبرونيكتين. C) أقدام صفاحية وأرجل كاذبة خيطية وينظر بشكل واضح في الخلايا المهاجرة NC المسمى مع phalloidin (الأخضر) المرحلة DI) العصيبة 17 GFP + المسمى اتخذ premigratory NC من الجنين حقن GFP والمطعمة مرة أخرى إلى الجنين المضيف، الذي تم ذاب الجمجمة NC في مرحلة 17 - 18. D) بعد ساعتين من التطعيم، وقد شفى ازدراع. هاجروا الخلايا EF) المطعمة NC بنشاط وتعبئة تيار الفك السفلي كما هو مبين في مرحلة الشرغوف 31 و 41. المرحلة G) مراقبة 41 الشرغوف. H) الذوبان في نورث كارولاينا و أدى إلى الفشل الكبير في الوجه والعين التنمية (H: نلاحظ أن GLAN الأسمنتد تطور المجاورة للعين، وذلك بسبب عدم وجود خلايا NC ملء المناطق الفك، السهام الحمراء. . مقارنة للسيطرة الشرغوف في G) F، I) وفي المقابل، واستعادة الخلايا المطعمة NC العين والتنمية هياكل القحفي (F، I، الأسهم الخضراء) AC، أشرطة النطاق = 100 مم؛ DI، مقياس بار = 1 ملم دال، عرض الظهرية. EI وجهات نظر الجانب. تم تعديل هذا الرقم من Milet وآخرون 12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51118/51118fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation at JoVE.com

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

تشريح<em&gt; القيطم المورق</em&gt; العصبية كريست ل<em&gt; في المختبر</em&gt; يزدرع الثقافة أو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; زرع

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

13.2K Views.  Centre Universitaire.  يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إ?...

Video: Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

الطريقة الثقافة القوارض باستخدام الأجنة الجامع للثقافة الدوار زجاجة من نوع النظام

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...