Die Autoren danken Adeline Dolly für die Bilder der Explantation auf Fibronektin, Eric Theveneau für hilfreiche Diskussionen und der Tierhaltung des Institut Curie. CM ist ein Postdoc der Region Ile de France (Domaine d&#39;Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche) und Agence Nationale de la Recherche. Diese Arbeit wurde von der Université Paris Sud (Attractivite 2011), dem Centre National de la Recherche Scientifique (Aktion thematique Incitative et sur-Programm), Verband pour la Recherche contre le Cancer Zuschuss SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, und Agence Nationale de la finanziert Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programm Blanc).

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verfeinerung entsprechen. 1. Vorbereitung der Fibronektin-beschichteten Schalen 14 <ol><li> Pipette 500 ml von 10 mg / ml Kulturqualität Fibronektin in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) verdünnt in ein Standard-Kunststoff-Petrischale (Ø 40 x 11 mm). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Wenn Sie Glasschalen oder Glasdeckgläser für die anschließende Bildverarbeitung, mit einem 100 mg / ml Fibronektin-Lösung. </li><li> Dreimal mit 1x PBS spülen. </li><li> Ersetzen PBS mit 500 ml 1x PBS/0.1% Rinderserumalbumin (BSA). Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Dreimal mit 1x PBS spülen. </li><li> Füllen Sie mit 1x PBS und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung (in der Regel für 24 bis 48 h). </li></ol> 2. Dissection der NC-Explantate &lt;ol&gt; <li> Vorbereitung 3/4 Normale Amphibie Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 mg / ml GENTAMYCIN 10,15). Nicht mehr als 1 Woche halten nicht zum Sezieren, Lagerung bei 4 ° C Ältere NAM können zur Herstellung Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden. </li><li> Vorbereitung 60 mm Petrischalen für die Präparation mit 10 ml einer 2% Agarose in 3/4 NAM beschichtet. </li><li> Sammeln Dissektionswerkzeuge: Kunststoff Pasteur Pipetten, auf Stifthalter (siehe Tabelle für Referenzmaterialien), ein &quot;Augenbraue Messer&quot; (mit Augenbraue Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette 16 eingebettet ist), zwei feine montierten feinsten Insektenstift Dissektion Pinzette, Pipette und Tipps P1000, ein Fernglas Stereoskop mit Vergrößerung 8-40x bis 50, eine helle Lichtquelle mit optischen Fasern Guides. Alle Werkzeuge sezieren sollte sauber gehalten werden, nach jedem Versuch, spülen sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal with 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub. </li><li> Füllen Sie die Schale mit frischen Präparation NAM fast an die Spitze. </li><li> Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren 10 und älter werden, bis sie Neurulastadium 16 zu erreichen (nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungs Tabelle 17). </li><li> Zeigen Stufe 16 Embryonen in die Dissektion Gericht mit der Plastik-Pasteurpipette. </li><li> Führen Sie alle folgenden Schritte im Rahmen des binokularen Umfang. Entfernen der Dottermembran mit zwei Zangenpaaren. Achten Sie darauf, den dorsalen Teil der Embryonen schädigen. </li><li> Warten Sie, bis die Embryonen Stufe 17 erreicht, um die Präparation beginnen. Stufe 17 ist angebracht, da der Neuralleiste ist deutlich vom Neuralrohr gesetzt, im Gegensatz zu früheren Phasen. Nach der Stufe 17, beginnt NC Migration und Vermischung mit dem umgebenden Mesenchym. </li><li> Graben Sie ein kleines Loch in der Agarose mit einer Pinzette, eine Nische für den Embryonen, um aufrecht zu erhaltensie während der Präparation. Legen Sie ein Embryo dorsalen Seite nach oben. Hinweis: Knetmasse kann verwendet werden, um die Embryonen statt graben ein Loch in die Agarose zu halten. </li><li> Einen Einschnitt in der seitlichen Teil des vorderen neuronalen fach mit der Augenbraue Messer und Insektenstift. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief in den Embryo zu gehen: Ziel ist es, durch 2-3 Zellschichten (zu erreichen nie so tief wie die Archenteron!) Geschnitten. Während der gesamten Dissektion Prozess, niemals zulassen, die seziert Gewebe in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. eingeben laevis embryonalen Gewebe durch die Oberflächenspannung lysiert. </li><li> Machen Sie eine zweite parallele Schnitt in der mehr dorsalen Teil des neuronalen fach mit den gleichen Instrumenten. </li><li> Wenn nötig, schalten Sie das Gericht um 90 °. Stellen Sie eine dritte senkrecht Schnitt mit der Augenbraue Messer und Insektenstift, an der hinteren Seite der ersten zwei Einschnitte. Die NC ist eine dicke Masse von Zellen unter dem pigmentierten Außenschicht des Ektoderms, Seitenzum Neuralrohr. </li><li> Verwenden Sie die Spitze der Augenbraue Messer, um das pigmentierte Ektodermschicht von der zugrunde liegenden NC lösen, ab dem dritten Einschnitt Rand. </li><li> Verwenden Sie die Seite der Augenbraue Messer, um die ab dem dritten Einschnitt NC Gewebe zu lösen. Die NC-Gewebe ist eher gräulich, während die zugrunde liegenden Kopf Mesoderm ist weiß. Sorgfältig trennen die NC aus dem Mesoderm. </li><li> Nehmen Sie den NC Gewebe vorne aus der Augenblase, und auf dieser Ebene geschnitten, um die Explantation zu befreien. Als Kontrolle für die ersten Experimente, die Überprüfung snail2 Ausdruck (eine kanonische NC-Marker) in einigen Explantate durch in situ-Hybridisierung wird empfohlen. </li></ol> 3. Plating Explantate auf Fibronektin <ol><li> Füllen Sie das Fibronektin-beschichtete Schale mit modifizierten Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, 5 mM Na2CO 3, K-Gluconat 4,5 mM, Na-Gluconat 32 mM MgSO 4 1 mM CaCl 2 1 mM, BSA 0,1%, pH-Wert einstellen auf 8,3 mit 1 M Bicin <sup&gt; 18). </li><li> Übertragen Sie die Explantate in den Fibronektin-beschichtete Schale mit einem P1000 Pipette. Lassen Sie niemals die Explantate auf die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zu berühren. Zunächst Pipette etwas Flüssigkeit in die Spitze, dann die Explantate, dann einige wieder flüssig. Nehmen Sie keine Luft nicht zulassen in die Spitze während der Übertragung der Explantate in den Fibronektin-beschichtete Schale. Sobald die Spitze innerhalb der Flüssigkeit des Fibronektin-beschichtete Schale, lassen Sie die Explantate langsam nach unten gehen durch die Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft. Vermeiden Auswerfen der Explantate zu schnell. </li><li> Zeigen 10-30 Explantate in die Schüssel mit der Augenbraue Messer. Vermeiden Sie die Seiten der Schüssel, die nicht ausreichend für die anschließende Bild sind. </li><li> Versuchen Sie nicht, die Antenne zu bewegen, bis die Explantate wurden auf der Fibronektin angebracht (es dauert ca. 15-30 min). Wenn nötig, verschieben Sie die Schüssel sehr sorgfältig. </li><li> Die Schale in einem Kühlbrutschrank (zwischen 15-20 ° C, Temperatur-Diagramm siehe 17). Bei 15 ° C platziert, Zellen are in der Regel effizient Migration und Streu nach 6 h Inkubation (dieser Zeitpunkt kann zwischen den Experimenten variieren). </li></ol> 4. Pfropfen Explantate in Host-Embryonen <ol><li> Schneiden Sie ein feines Deckglas in sehr kleine Stücke mit groben Pinzette. Die Größe der Stücke sollten etwa 1,5 mm 2 betragen. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette. </li><li> Vorbereitung der Host-Embryo: sezieren die Gastgeber in NC 3/4 NAM wie in 3) mit besonderer Sorgfalt nicht beschrieben, um den Host Embryo schädigen beim Entfernen der Dotterhaut und Zerlegung der NC. Die Gewebespannung neigt dazu, die Größe der Ablation zu erhöhen: Lassen Sie die Host-Embryo teilweise heilen, während der Zerlegung des Spenders Embryo. </li><li> In einem anderen Agarose-beschichtete Schale oder in einem anderen Teil der gleichen Schüssel, sezieren die NC Explantation vom Spender Embryo in Protokoll 3 beschrieben. Übertragen Sie die NC-Transplantat in die Schale mit den Host mit Sorgfalt, wie inProtokoll Nr. 3. </li><li> Sofort legen die NC Explantat auf den Host-Bereich mit einer Pinzette abgetragen. Die Explantation sollte teilweise zu befestigen. Legen Sie ein Deckglas auf den Embryo gepfropft, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo nicht zu beschädigen. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht sein. </li><li> Warten Sie mindestens 15-20 Minuten, dann entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Lassen Sie den Embryo wieder für weitere 10 min pipettieren und sorgfältig in ein sauberes Geschirr mit 3/4 gefüllt NAM, mit der Plastik-Pasteurpipette. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, um premigratory Schädel NC in X. laevis Embryonen Explantation. Die für die Experimente verwendeten Embryonen müssen robust sein und auch zu heilen. Verwerfen Charge von ungesunden Embryonen. Darüber hinaus wachsen Embryonen bei verschiedenen Temperaturen (von 12 bis 18-20 ° C), um Neuralleiste in Stufe 17 und nicht später herauszuschneiden. Nach der Stufe 17 kann Neuralleiste, die mit Kopf Mesoderm gemischt werden und kann nicht vollständig entfernt wer...

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente embryonalen Zellpopulation, die aus dem Neuralrohr Ende Neurulation in Wirbeltierembryonen entsteht. Die Signal-und genetischen Ereignissen, die NC-Spezifikation steuern so früh wie Gastrulation. Die NC ist an der Grenze zwischen der neuralen und nicht-neuralen Ektoderm durch Signale von umliegenden Gewebe Rücken angegeben. Am Ende der Neurulation, NC-Zellen durchlaufen eine Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) und Migration weitgehend im Embryo folgenden stereo Routen durch die Reaktion auf Umgebungsführungs Signale. Sobald sie ihr Ziel erreicht haben, unterscheiden sie sich in einer Vielzahl von Derivaten, z. B. Nervenzellen, Gliazellen, Knochen, Knorpel und pigmentierten Zellen 1-5. Durch ihren Beitrag zu vielen Zelltypen und embryonalen Geweben, Mängel bei jedem Schritt der NC-Zellen Entwicklung, von der Induktion bis zur endgültigen Differenzierung, können angeborene Syndrome genannt neurocristopathies 6 verursachen. Experimental Manipulation der Entwicklungs NC in verschiedenen Stadien - Spezifikation, EMT, Migration und Differenzierung - wird unser Verständnis der neurocristopathies verbessern und die Gestaltung der potenziellen therapeutischen Strategien. Die Xenopus laevis Embryo ist ein Modell der Wahl, um NC-Entwicklung zu untersuchen. Eine große Anzahl von Embryonen sind leicht zu erhalten, und externe Befruchtung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Entwicklung. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell manipulieren X. laevis embryonalen Entwicklung. Gene gain-of-function-und Zuschlags sind leicht zu Mikroinjektion einzelnen Zellen des frühen blastulas durchzuführen. Embryonale Gewebe können für die in vitro Reassoziation 7-11 oder Back-Pfropfen Assays 12,13 geschnitten werden. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man sezieren premigratory Schädel NC in X. laevis spät neurulas, vor der Migration. Diese Explantate auf Fibronektin-coate kultiviert werdend Platten zu Migration und Differenzierung in vitro-Studie bei Versuchsbedingungen gesteuert. NC-Explantate können auch in normalen oder manipuliert Host Embryonen gepfropft, um ihre Migration und Differenzierung in vivo zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4759-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bovine Serum Albumine. Fraction V</td>
			<td style="width:71px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">04-100-811-C</td>
			<td>Lower quality grade may&#160; be suitable for this application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stainless Steel Insect Pins. Size 000</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td align="right" style="width:119px;">26001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente dorsalen Neuralrohr Zellpopulation, die ein Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) am Ende Neurulation erfährt wandert ausgiebig gegen verschiedene Organe und unterscheidet in viele Arten von Derivaten (Neuronen, Glia, Knorpel und Knochen, pigmentierte und endokrine Zellen). In diesem Protokoll beschreiben wir, wie Sie die premigratory Schädel NC von Xenopus laevis Embryonen zu sezieren, um die NC-Entwicklung in vivo und in vitro zu untersuchen. Der Frosch-Modell bietet viele Vorteile, die frühe Entwicklung zu studieren, reichlich Chargen verfügbar sind, Embryonen entwickeln sich schnell, in vivo Gewinn und Verlust der Funktion Strategien ermöglichen Manipulation der Genexpression vor NC-Dissektion in den Geber-und / oder Host-Embryonen. Die NC-Explantate auf Fibronectin ausplattiert und in vitro-Studien verwendet werden. Sie kann für mehrere Tage in einem serumfreien definierten Medium kultiviert werden. Wir beschreiben auch, wie NC-Explantate zurück pfropfenin Wirts Embryonen für Studium NC Migration und Differenzierung in vivo.

Wenn auf Fibronektin zogen, legen die Neuralleiste Explantate schnell (15-30 min) und der Explantation breitet sich flach innerhalb von 2 h (Abb. 1A). Nach 3-6 Stunden Zellen beginnen sich zu zerstreuen. Nach 24 h bei 15 ° C, haben viele Zellen begonnen, von dem Explantat (Fig. 1B und 1C) zu migrieren. Eigelb macht Zellen sehr unter Phasenkontrast (Abbildung 1B) hell ist. Handy Vorsprünge (filopodes und lamellipodes) eindeutig nach Phalloidin-Färbung...

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Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

13.2K Aufrufe.  Centre Universitaire.  Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung. 

Serie: Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Forschung

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissektion der

Zusammenfassung

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