Yazarlar yararlı tartışmalar ve Institut Curie&#39;nin Hayvan Tesisi için fibronektin, Eric Theveneau üzerinde eksplant resimler için Adeline Dolly teşekkür ederim. CM Bölge Ile de France (Domaine d&#39;Interet Majeur Pole Stem), Universite Paris Sud (Ataşesi TEMPORAIRE d&#39;Enseignement et de Recherche) ve Agence Nationale de la Recherche bir doktora sonrası adam. Bu çalışma Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Aksiyon thématique ve teĢvik sur Programı), Dernek dökün la Recherche contre le Kanser Grant SFI20101201882, Ligue contre le Kanser ve Agence Nationale de la tarafından finanse edildi Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programı Blanc).

Deneyler bilimsel amaçlı ve değiştirme, azaltma ve arıtma uluslararası yerleşik ilkeleri ile kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin ulusal ve Avrupa yönetmeliğe uygun. 1.. Fibronektin kaplı kaplar 14 hazırlanması <ol><li> Standart bir plastik Petri tabağı (çap: 40 x 11 mm) içine 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde sulandırılmış 10 mg / ml kültürü dereceli fibronektin Pipet 500 ml. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Not: sonraki görüntüleme için cam yemekleri veya cam lamelleri kullanarak, eğer bir 100 mg / ml fibronektin çözümü kullanın. </li><li> 1x PBS ile üç kez durulanır. </li><li> 1x PBS/0.1% Bovine Serum Albumin (BSA), 500 ml PBS ile değiştirin. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 1x PBS ile doldurun ve (genellikle 24-48 saat) kullanılıncaya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol> 2. NC Eksplantlarından diseksiyonu &lt;ol&gt; <li> Hazırlama 3/4 Normal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 X PBS, 50 mg / ml ) 10,15 gentamisin. 4 ° C&#39;de diseksiyonu, mağaza için en fazla 1 hafta devam etmeyin Eski NAM agaroz kaplı diseksiyon yemekler (aşağıda) hazırlanması için kullanılabilir. </li><li> 3/4 NAM içinde% 2 agaroz 10 ml ile kaplanmış diseksiyon için 60 mm Petri kapları, hazırlayın. </li><li> Diseksiyon araçları toplamak: plastik Pasteur pipet, bir güzel böcek pin pin tutucu (referans için malzemeler tabloya bakınız), (bir cam Pasteur pipet 16 ucundaki parafin gömülü kaş saç ile yapılan) bir &quot;kaş bıçak&quot;, iki ince üzerine monte diseksiyon forseps, P1000 pipet ve ipuçları, 50 büyütme 8-40X ile bir dürbün steroskop, optik lifler kılavuzları ile parlak bir ışık kaynağı. Tüm kesme aletleri temiz tutulmalı, her deneyden sonra, distile su ile iki kez wi yıkayın% 100 etanol inci ve kurumaya bırakın. Tozdan uzak saklayın. </li><li> Neredeyse tepesine taze NAM diseksiyon çanak doldurun. </li><li> X&#39;i elde standart prosedürler 10 ve onlar (Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17) neurula aşamasına 16 olana kadar onları yaş göre embriyolar laevis&#39;den. </li><li> 16 embriyolar plastik Pasteur pipet kullanarak diseksiyon çanak içine sahne yerleştirin. </li><li> Binoküler kapsamında sonraki tüm adımları uygulayın. Forseps iki çift vitellin membran çıkarın. Embriyoların dorsal kısmını zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Embriyolar diseksiyon başlamak aşamada 17 ulaşana kadar bekleyin. Sinir ucu açık bir şekilde daha erken aşamalarında aksine, nöral borudan ayrılmış olduğu için Aşama 17 uygundur. 17 sahne sonra, NC göç ve çevredeki mezenşimin ile karışmasının başlar. </li><li> Korumak amacıyla embriyolar için bir niş yapmak için forseps ile agaroz küçük bir delik kazmakdiseksiyonu sırasında onları. Tek embriyo dorsal yüzü yukarı yerleştirin. Not: modelleme kil yerine agaroz bir delik kazma embriyolar korumak için de kullanılabilir. </li><li> Kaş bıçak ve böcek iğne ile anterior nöral kıvrımın yan kısmında bir kesi yapmak. Derin embriyonun içine de gitmek için dikkatli olun: 2-3 hücre tabakası (! Archenteron olarak derin ulaşmak asla) kesti hedefliyoruz. Bütün diseksiyon işlemi sırasında kesilmiş dokuları X yana hava-sıvı arayüzü ile temas girmesine izin hiçbir laevis embriyonik dokular, yüzey gerilimi ile lize edilmiştir. </li><li> Sinir daha dorsal kısmında paralel ikinci bir kesi aynı araçları kullanarak kat olun. </li><li> Gerekirse, 90 ° etrafındaki çanak çevirin. İlk iki kesiler arka tarafında, kaş bıçak ve böcek iğne ile üçüncü dikey kesi olun. NC lateral, ektoderm pigmentli dış tabakasının altında hücreleri kalın bir kütledirnöral tüp. </li><li> Üçüncü yarık kenarından başlayarak temel nc pigmentli ektoderm tabaka ayırmak için kaş bıçak ucu kullanın. </li><li> Üçüncü kesi başlayarak NC dokuyu ayırmak için kaş bıçak tarafını kullanın. Yatan sefalik mezoderm beyaz ise NC doku, oldukça grimsi olduğunu. Dikkatle mezodermden NC ayrı. </li><li> Optik vesicle itibaren öne NC doku ayırmak ve eksplant boşaltmak için bu düzeyde kesti. In situ hibridizasyon ile, bazı eksplantlarında snail2 ifadesi (bir standart işaretleyici NC) kontrol ilk deneyler, bir kontrol olarak, tavsiye edilir. </li></ol> 3. FİBRONEKTİN üzerine kaplama Eksplantlarındaki <ol><li> Dolgu fibronektin kaplı tabak Modifiye Danilchick Ortamı (MDM, 53 mM NaCl, 5 mM Na2CO 3, K Glukonat 4.5 mM, 32 mM Na Glukonat, MgSO 4 1 mM CaCl2, 1 mM, BSA% 0.1 ile, pH ayarlamak 1 M bisin ile 8.3 &#39; <sup&gt; 18). </li><li> P1000 pipet kullanarak fibronektin kaplı çanak içine eksplantlarının aktarın. Eksplantlar hava-sıvı arayüzü dokunmasına izin vermeyin. İlk olarak, daha sonra bir sıvı tekrar, eksplantlar, daha sonra ucu içine bir sıvı pipetle. Fibronektin kaplı çanak içine eksplantlarm aktarılırken ucu içine herhangi bir hava izin vermeyin. Ucu fibronektin kaplı yemeğin sıvı içinde sonra, eksplantlan yavaş yavaş yerçekimi tarafından aşağı gidelim, ya da çok hafifçe itin. Çok hızlı eksplantlarının fırlatıp kaçının. </li><li> Kaş bıçak kullanarak çanak 10-30 eksplantlarının yerleştirin. Sonraki görüntüleme için yeterli değildir yemeğin tarafı, kaçının. </li><li> Eksplant (yaklaşık 15-30 dakika sürer) fibronektin takılı kadar çanağı hareket çalışın. Gerekirse, çok dikkatli çanağı hareket. </li><li> (Sıcaklık grafik 17 görmek için 15-20 ° C arasında) bir soğutmalı inkübatör tabak yerleştirin. 15 ° C&#39;de yerleştirilir, hücreler are genellikle verimli bir şekilde göç ve inkübasyon 6 saat sonra, saçılma (bu zamanlama deneyler arasında değişebilir). </li></ol> 4. Ana embriyolara eksplantlarındaki Aşılama <ol><li> Kaba forseps kullanarak çok küçük parçalar halinde ince bir cam lamel kesti. Parçalarının büyüklüğü yaklaşık 1.5 mm2 olmalıdır. Forseps kullanarak 3/4 NAM veya PBS içeren bir Petri kabı içine parçaları daldırın. </li><li> Ev sahibi embriyo Hazırlanması: vitellin membran kaldırılması ve NC diseksiyon sırasında ev sahibi embriyo zarar vermemek için özel bakım) ile 3 açıklandığı gibi 3/4 NAM içinde ana NC teşrih. Donör embriyo diseksiyon sırasında ev sahibi embriyo kısmen iyileşmek istiyorum: doku gerginlik ablasyon boyutunu artırmak eğilimindedir. </li><li> Protokol 3&#39;te tarif edildiği gibi bir agaroz kaplı tabak içinde veya aynı çanak başka bir yerinde, donör embriyo NC eksplant teşrih. Açıklandığı gibi, dikkatle konağı içeren çanak içine NC grefti aktarınProtokolü 3. </li><li> Hemen forseps kullanarak ev sahibi ablasyon alanı üzerine NC eksplant yerleştirin. Eksplant kısmen eklemek gerekir. Yerine greft korumak için aşılanmış embriyo üzerine cam lamel bir parça koyun. Hasar görmelerini önlemek için embriyo daha büyük bir cam parçası seçin. Embriyo basık biraz olacaktır. </li><li> En az 15-20 dakika bekleyin, sonra yavaşça lamel kaldırmak. Embriyo başka bir 10 dakika boyunca geri olsun ve dikkatli bir şekilde plastik Pasteur pipeti kullanılarak, 3/4 NAM dolu temiz bir tabak içine pipetle. </li></ol>

<ol>
	<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Stuhlmiller, T. J., Garc&#237;a-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction.">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates.">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li><li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration:+lessons+from+Xenopus+embryos.">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li><li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies.">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li><li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization.">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li><li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation.">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li><li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction.">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals.">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li><li>Sadaghiani, B., Thi&#233;baud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo,+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy.">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li><li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity.">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li><li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos.">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+Xenopus+laevis+(Daudin):+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis.">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , (1994).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beads+on+the+run:+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays.">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li><li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evolution+of+the+neural+crest:+An+overview.">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li><li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin.">Integrin &#945;5&#946;1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li><li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+RhoU/Wrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration.">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Kashef, J., K&#246;hler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases.">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li><li>Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis.">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Neural+Crest+Induction,+Melanocyte+Specification,+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs..">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs..</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration.">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration.">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration.">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li><li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2.">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li><li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration.">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li><li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification.">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis.">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li><li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues.">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol X. laevis embriyoların premigratory kranial NC eksplantasyona kolay bir teknik anlatılmaktadır. Bu tür deneyler için kullanılan embriyo sağlam olması ve iyileştirmek gerekir. Sağlıksız embriyoların herhangi bir toplu atın. Buna ek olarak, ve daha sonraki bir aşamada 17 nöral tepe tüketim için, (12 ile 18-20 ° C) çeşitli sıcaklıklarda embriyolar büyür. 17 sahne sonra, nöral krest sefalik mezoderm ile karıştırılabilir ve tamamen kaldırılamaz. Ksenopus dokuları...

Sinir ucu (NC), embriyonun içinde nörülasyon sonunda nöral tüpünden çıkan geçici bir embriyonik hücre popülasyonu. NC şartname kontrol sinyalizasyon ve genetik olaylar gibi erken gastrulasyon olarak başlar. NC çevreleyen dorsal dokulardan gelen sinyaller tarafından nöral ve nöral olmayan ektoderm arasındaki sınırda belirtildi. Nörülasyon sonunda, Kuzey hücreleri epitel-to-mezenşimin geçiş (EMT) geçmesi ve yol gösterici ipuçları çevreleyen yanıt vererek kalıplaşmış yolları takip embriyo yoğun göç. Onların nihai hedefe ulaştığında, onlar türevleri, örneğin nöronlar, glia, kemik, kıkırdak, ve pigmentli hücrelerin 1-5 geniş bir diziye ayırt. Çünkü birçok hücre tipleri ve embriyonik dokular, NC hücreleri gelişme herhangi bir aşamasında kusurları, indüksiyon nihai farklılaşma katkıları, neurocristopathies 6 adlı konjenital sendromlara neden olabilir. Dşartname, EMT, göç, ve farklılaşma - - farklı aşamalarında gelişen NC Xperimental manipülasyon neurocristopathies anlayışımızı geliştirmek ve potansiyel tedavi stratejileri tasarımı sağlayacaktır. Xenopus laevis embriyo NC gelişimini incelemek için tercih edilen bir modeldir. Embriyoların çok sayıda elde etmek kolay, ve dış döllenme gelişme ilk adımlardan erişim sağlar. Birçok araç deneysel X işlemek için kullanılabilir embriyo gelişimini laevis. Kazanç fonksiyon-ve demonte gen erken blastulas bireysel hücrelerin microinjecting gerçekleştirmek kolaydır. Embriyonik dokular in vitro tekrar birleşme 7-11 veya sırt-aşılama deneyleri 12,13 için kesilebilir. Bu protokol, biz X. premigratory kranial NC teşrih nasıl açıklar önce göç geç neurulas, laevis&#39;den. Bu eksplantlar, fibronektin boru hattlar üzerinde kültürlenebiliriçinde göç ve farklılaşma çalışma d plakalar vitro deney koşullarında kontrol edilir. NC eksplantlan in vivo olarak göç ve farklılaşma çalışma normal veya manipüle ana embriyolara aşılanabilirler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4759-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bovine Serum Albumine. Fraction V</td>
			<td style="width:71px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">04-100-811-C</td>
			<td>Lower quality grade may&#160; be suitable for this application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stainless Steel Insect Pins. Size 000</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td align="right" style="width:119px;">26001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

Nöral krest (NC) nörülasyon sonunda epitel-to-mezenşimin geçiş (EMT) uğrar geçici bir dorsal nöral tüp hücre nüfusu, çeşitli organlara doğru yoğun göç ve türevlerinin birçok türleri (nöronlar, glia içine ayırır kıkırdak ve kemik, pigmentli ve endokrin hücreler). Bu protokol, in vivo ve in vitro NC gelişimini incelemek amacıyla, Xenopus laevis embriyolardan premigratory kafatası NC incelemek nasıl açıklar. Kurbağa modeli, erken gelişimini incelemek için birçok avantaj sunuyor; bol partiler embriyolar in vivo kazanç ve fonksiyon stratejileri kaybı öncesinde donör ve / veya ana embriyoların NC diseksiyon gen ifadesinin değiştirilmesine izin verir, hızla geliştirmek mevcuttur. NC Eksplantlar fibronektin üzerine kaplanmıştır ve in vitro çalışmalar için de kullanılabilir. Bir serumsuz ortam içinde tanımlanmış birkaç gün boyunca kültürlenebilir. Biz de Kuzey Carolina eksplantlarının geri greft nasıl açıklarin vivo NC göç ve farklılaşma çalışmak için ana embriyolara.

Fibronektin üzerinde kaplama yaparken, nöral krest eksplantlar hızla (15-30 dakika) takın ve eksplant 2 saat (Şekil 1A) dahilinde düz yayılır. 3-6 saat hücreler dağılmaya başlar sonra. 15 ° C&#39;de 24 saat sonra, hücreler, bir çok uzak eksplant (Şekil 1B ve 1C) göç etmeye başlamıştır. Sarısı faz kontrast (Şekil 1B) altında hücreleri çok parlak yapar. Hücre çıkıntıların (filopodes ve lamellipodes) aktin hücre iskeletin...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation at JoVE.com

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Bu protokol Xenopus laevis neurulas gelen premigratory kranial sinir kret (NC) teşrih nasıl açıklanır. Bu eksplantlar, fibronektin ve in vitro kültürlenmiş üzerine kaplanır, ya da arka ana embriyolara aşılanabilirler. Bu teknik NC epitel-to-mezenşimin geçiş, göç, ve farklılaşma mekanizmaları eğitim veriyor.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

13.2K Görüntüleme.  Centre Universitaire.  Bu protokol Xenopus laevis neurulas gelen premigratory kranial sinir kret (NC) teşrih nasıl açıklanır. Bu eksplantlar, fibronektin ve in vitro kültürlenmiş üzerine kaplanır, ya da arka ana embriyolara aşılanabilirler. Bu teknik NC epitel-to-mezenşimin geçiş, göç, ve farklılaşma mekanizmaları eğitim veriyor. 

Video: Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Biyoloji

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Diseksiyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler