Les auteurs remercient Adeline Dolly pour les photos de expiant sur la fibronectine, Eric Theveneau pour des discussions utiles et dans les animaleries de l&#39;Institut Curie. CM est un stage postdoctoral de la Région Ile de France (Domaine d&#39;Intérêt Majeur souches Pole), Université Paris Sud (Attaché Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche), et l&#39;Agence Nationale de la Recherche. Ce travail a été financé par l&#39;Université Paris Sud (Attractivité 2011), le Centre National de la Recherche Scientifique (Programme d&#39;Action Thématique et Incitative), Association pour la Recherche contre le cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le cancer, et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

Les expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l&#39;échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement. Une. Préparation de plats fibronectine 14 <ol><li> Introduire à la pipette 500 ml de 10 mg / ml de fibronectine culture primaire dilué dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de Petri en plastique standard (Ø 40 x 11 mm). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: si vous utilisez des plats en verre ou des lamelles de verre pour l&#39;imagerie ultérieure, utiliser un / ml solution fibronectine de 100 mg. </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x. </li><li> Remplacer PBS avec 500 ml de 1 x PBS contenant 0,1% albumine de sérum bovin (BSA). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x. </li><li> Remplissez avec PBS 1x et conserve à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation (généralement pendant 24-48 h). </li></ol> 2. Dissection des explants NC &lt;ol&gt; <li> Préparer 3/4 normale amphibie moyen (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM d&#39;EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycine 10,15). Ne gardez pas plus de 1 semaine pour la dissection, conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtu (ci-dessous). </li><li> Préparer 60 mm boîtes de Pétri pour la dissection, revêtues avec 10 ml d&#39;agarose à 2% dans 3/4 NAM. </li><li> Récupérer des outils de dissection: pipettes Pasteur en plastique, une broche plus beaux insectes monté sur support de broche (voir le tableau des matériaux pour la référence), un &quot;couteau de sourcil&quot; (en poils de sourcils inclus dans la paraffine à l&#39;extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre 16), deux beaux pinces à dissection, P1000 pipette et des conseils, un stéréoscope binoculaire avec un grossissement 8-40X à 50, une source de lumière brillante avec des guides de fibres optiques. Tous les outils de dissection doivent être maintenus propres, après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l&#39;eau distillée, une fois with 100% d&#39;éthanol et laisser sécher. Conserver à l&#39;abri de la poussière. </li><li> Remplissez le plat de dissection avec NAM frais presque au sommet. </li><li> Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard 10 et les vieillir jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent neurula étape 16 (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement 17). </li><li> Placez étape 16 embryons dans le plat de dissection à l&#39;aide de la pipette Pasteur en plastique. </li><li> Effectuer toutes les étapes ultérieures dans le cadre du champ binoculaire. Retirer la membrane vitelline avec deux paires de pinces. Veillez à ne pas endommager la partie dorsale de l&#39;embryon. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que les embryons ont atteint le stade 17 pour commencer la dissection. Etape 17 est approprié depuis la crête neurale est clairement mis à part le tube neural, contrairement aux étapes précédentes. Après l&#39;étape 17, NC commence la migration et se mêlant à la mésenchyme environnant. </li><li> Creusez un petit trou dans l&#39;agarose avec des pinces pour faire un créneau pour les embryons afin de maintenireux au cours de la dissection. Placez un embryon dorsale vers le haut. Remarque: la pâte à modeler peut être utilisé pour maintenir les embryons de creuser un trou à la place dans l&#39;agarose. </li><li> Faire une incision dans la partie latérale du pli neural antérieur avec le couteau à sourcils et l&#39;axe d&#39;insecte. Veillez à ne pas aller trop loin dans l&#39;embryon: viser à couper à travers 2-3 couches de cellules (jamais atteindre le plus profond que le archenteron!). Pendant tout le processus de dissection, ne laissez jamais les tissus disséqués pour entrer en contact avec l&#39;interface air-liquide depuis X. tissus embryonnaires laevis sont lysées par la tension superficielle. </li><li> Faire un deuxième incision parallèle dans la partie la plus dorsale du pli de neurones en utilisant les mêmes instruments. </li><li> Si nécessaire, tourner le plat autour de 90 °. Faire une troisième incision avec le couteau perpendiculaire à sourcils et l&#39;axe d&#39;insecte, à la face postérieure des deux premières incisions. Le NC est une masse épaisse de cellules sous la couche externe pigmentée de l&#39;ectoderme, latéraldans le tube neural. </li><li> Utilisez la pointe du couteau de sourcil de détacher la couche pigmentée de l&#39;ectoderme NC sous-jacent, à partir du troisième bord de l&#39;incision. </li><li> Utiliser le côté du couteau de sourcil pour détacher le tissu NC partir de la troisième incision. Le tissu NC est plutôt grisâtre, tandis que le mésoderme céphalique sous-jacente est blanc. Séparez délicatement le NC du mésoderme. </li><li> Détachez le tissu NC antérieure de la vésicule optique, et couper à ce niveau pour libérer l&#39;expiant. Comme un contrôle de premières expériences, contrôle l&#39;expression de snail2 (un marqueur NC canonique) dans certains explants par hybridation in situ est recommandée. </li></ol> 3. Les explants de placage sur la fibronectine <ol><li> Remplissez le plat de fibronectine avec modification Danilchick moyen (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K gluconate de 4,5 mM, Na gluconate de 32 mM, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, ajuster le pH à 8,3 avec 1 M Bicine <sup&gt; 18). </li><li> Transférer les explants dans le plat de la fibronectine revêtu à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. Ne laissez jamais les explants de toucher l&#39;interface air-liquide. Tout d&#39;abord, la pipette du liquide dans la pointe, puis les explants, puis certains nouveau liquide. Ne pas permettre à l&#39;air dans la pointe tout en transférant les explants dans le plat de fibronectine. Une fois la pointe est à l&#39;intérieur du liquide de la boîte de fibronectine, laisser les explants vont lentement par gravité, ou pousser très doucement. Évitez d&#39;éjecter les explants trop vite. </li><li> Placez 10-30 explants dans le plat à l&#39;aide du couteau de sourcil. Éviter les parois de la capsule, qui ne sont pas adéquats pour l&#39;imagerie ultérieure. </li><li> Essayez de ne pas déplacer l&#39;antenne jusqu&#39;à ce que les explants ont attaché sur la fibronectine (cela prend environ 15-30 min). Si nécessaire, déplacez le plat très attentivement. </li><li> Placer le plat dans un incubateur réfrigéré (entre 15-20 ° C, pour le graphique de température voir 17). Lorsqu&#39;il est placé à 15 ° C, les cellules are la migration en général de manière efficace et de diffusion après 6 heures d&#39;incubation (ce calendrier peut varier entre les expériences). </li></ol> 4. Greffage explants dans des embryons d&#39;accueil <ol><li> Coupez une lamelle de verre bien en très petits morceaux à l&#39;aide de pinces grossières. La taille des pièces doit être d&#39;environ 1,5 mm 2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince. </li><li> Préparation de l&#39;embryon hôte: disséquer l&#39;hôte NC à 3/4 NAM comme décrit dans 3) avec un soin particulier à ne pas endommager l&#39;embryon hôte tout en enlevant la membrane vitelline et la dissection du NC. La tension du tissu tend à augmenter la taille de l&#39;ablation: laisser l&#39;embryon hôte soigne partiellement tout en disséquant le donneur d&#39;embryon. </li><li> Dans un autre plat d&#39;agarose revêtues ou dans une autre partie du même plat, disséquer l&#39;expiant NC de l&#39;embryon donneur tel que décrit dans le protocole 3. Transférer la greffe NC dans le plat contenant l&#39;hôte avec soin, comme décrit dansProtocole 3. </li><li> Placer immédiatement l&#39;expiant NC sur la zone d&#39;ablation hôte en utilisant une pince. L&#39;explantation devrait fixer partiellement. Placer un morceau de lamelle de verre sur l&#39;embryon greffé à maintenir la greffe en place. Choisir un morceau de verre plus grand que l&#39;embryon pour éviter de l&#39;endommager. L&#39;embryon sera un peu aplatie. </li><li> Attendez au moins 15-20 minutes, puis retirez délicatement la lamelle. Que l&#39;embryon récupérer pendant 10 min et la pipette avec précaution dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, en utilisant la pipette Pasteur en plastique. </li></ol>

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Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li><li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification.">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis.">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li><li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues.">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d&#39;embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d&#39;exciser la crête neurale, à l&#39;étape 17 et pas plus tard. Après l&#39;étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne p...

La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation. Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l&#39;embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu&#39;ils ont atteint leur destination finale, ils se différencient en une vaste gamme de produits dérivés, par exemple les neurones, les cellules gliales, les os, le cartilage et les cellules pigmentées 1-5. En raison de leur contribution à de nombreux types de cellules et de tissus embryonnaires, les défauts à toute étape du développement des cellules NC, de l&#39;induction de la différenciation finale, peut provoquer des syndromes congénitaux nommés neurocristopathies 6. Emanipulation Xperimental de la NC en développement à différents stades - Spécification, EMT, de migration et de différenciation - permettra d&#39;améliorer notre compréhension de neurocristopathies et permettre la conception de stratégies thérapeutiques potentielles. L&#39;embryon de Xenopus laevis est un modèle de choix pour étudier le développement NC. Un grand nombre d&#39;embryons sont faciles à obtenir, et la fécondation externe donne accès aux toutes premières étapes du développement. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement X. laevis développement embryonnaire. Gain de fonction et knockdown gène sont faciles à effectuer par micro-injection de cellules individuelles de début blastulas. Tissus embryonnaires peuvent être coupés pour réassociation in vitro 7-11 ou tests de back-greffes 12,13. Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer prémigratoire crânienne NC dans X. laevis neurulas fin, avant la migration. Ces explants peuvent être cultivées sur fibronectine coateplaques d pour étudier la migration et la différenciation en contrôlées in vitro conditions expérimentales. NC explants peuvent également être greffés sur des embryons normaux de l&#39;hôte ou manipulées pour étudier leur migration et la différenciation in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4759-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bovine Serum Albumine. Fraction V</td>
			<td style="width:71px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">04-100-811-C</td>
			<td>Lower quality grade may&#160; be suitable for this application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stainless Steel Insect Pins. Size 000</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td align="right" style="width:119px;">26001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l&#39;os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d&#39;étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l&#39;expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d&#39;accueil pour l&#39;étude de la migration et la différenciation NC in vivo.

Lorsque plaqué sur la fibronectine, les explants de la crête neurale attachent rapidement (15-30 min) et l&#39;expiant propage à plat dans 2 heures (figure 1A). Après 3-6 cellules h commencent à se disperser. À 24 heures à 15 ° C, de nombreuses cellules ont commencé à migrer loin de l&#39;explant (Figures 1B et 1C). Jaune rend les cellules très lumineux sous contraste de phase (figure 1B). protubérances cellulaires (filopodes et lamellipodes...

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Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d&#39;étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

13.1K vues.  Centre Universitaire.  Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation. 

Vidéo: Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Recherche

Biologie

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.