نشكر كاساندرا براينت لأداء التجربة معهد التمويل الدولي وكارول بوخنر لها الاستعراض التقني الخبير.

1. عينة إعداد واختيار الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكواشف من التعبئة والتغليف والسماح لكل بند أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد الكواشف وتمييع الأمصال المريض وفقا لإدراج الاتجاه. ملاحظة: يتم barcoded الشرائح NOVA لايت ويمكن دمجها بسهولة في النظم الآلية بالاشتراك مع مختبر نظام المعلومات LIS. يوضح هذا الإجراء تجهيز الشريحة دليل؛ مختبرات إنتاجية عالية، ومع ذلك، قد تختار لمعدات تجهيز الشريحة الآلي. </li></ol> 2. إضافة الضوابط وعينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 قطرة من السيطرة الإيجابية و1 قطرة من المراقبة السلبية إلى الآبار الشريحة المناسبة. ماصة 20-25 ميكرولتر من مصل المريض المخفف إلى الآبار المتبقية. معالجة شريحة واحدة في المرة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة (ق) في وعاء تلطيخ مع منشفة ورقية مبللة في القاع. تغطية الحاويات واحتضان الشريحة (ق) لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: سيتم الظروف الرطبةمنع الركيزة من الجفاف. جفاف الآبار يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ مصطنعة. خلال هذه الفترة الحضانة، فإن الأجسام المضادة المناهضة للاسلحة النووية في مصل المريض ربط المستضدات للخلايا التي يتم إصلاحها على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، شطف المصل باستخدام تيار لطيف من غسل العازلة. من أجل تجنب الإضرار الركيزة ومنع انتقال أكثر من عينات بين الآبار، وزاوية الشريحة قليلا لتجنب توجيه تيار مباشرة على الآبار. الاستفادة من غسل العازلة الزائدة ووضع الشريحة في جرة Coplin تحتوي على غسل العازلة لحوالي 5 دقائق. </li></ol> 3. إضافة نيون الاقتراني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحدا تلو الآخر، وإزالة الشرائح من غسل العازلة والاستفادة بلطف لإزالة غسل العازلة الزائدة. تطبيق 1 قطرة من المكورات فلوري (FITC المسمى مفتش مكافحة الإنسان) على كل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في حاوية مرطب، وتأكد من استبدال تلطيخغطاء الحاوية. ملاحظة: للحصول على اختبار ANA، فمن المستحسن استخدام وسيلة محددة المكورات مفتش لكرة القدم. والمكورات هو الحساسة للضوء، وسوف غطاء حماية الشرائح من التعرض للضوء، بالإضافة إلى الحفاظ على البيئة مرطب. خلال هذه الفترة الحضانة، فإن المكورات ربط الأجسام المضادة المناهضة للاسلحة النووية المريض التي منضما إلى مستضدات الخلية. هذه المكورات نتائج ملزمة بحضور مضان في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف وغسل الشريحة كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة على منشفة ورقية وتطبيق تصاعد المتوسطة في خط متواصل إلى الحافة السفلى من ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل شريحة من غسل العازلة والاستفادة من الشريحة بلطف لإزالة غسل العازلة الزائدة. لمس الحافة السفلية من الشريحة إلى حافة ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بلطف الشريحة على ساترة في مثل هذه الطريقة التي المتوسطة المتزايدة على ساترة يتدفق إلى الحافة العلوية من الشريحة دون تشكيل فقاعة الهواء. ملاحظة: التعاونverslipping، بما في ذلك استخدام كمية الأمثل للتصاعد المتوسطة، هو الاسلوب الذي يأخذ الممارسة لاتقان. </li></ol> 4. تحديد النتائج الإيجابية والسلبية دليل تفسير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الشرائح مع المجهر الفلورسنت، وتقع في غرفة مظلمة. تنفيذ مسح البئر بالكامل مع الهدف 20X 25X أو لتقييم توزيع الخلايا وتوحيد مضان </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى الهدف 40X لجعل التفسير النهائي بشأن الإيجابية والنمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ننظر إلى الضوابط الإيجابية والسلبية. الإيجابية الصف باستخدام مقياس الدرجات تفاعل من 1 إلى 4 + +. ملاحظة: سيطرة سلبية قد لا تظهر مظلمة تماما، ولكن في كثير من الأحيان عرض مضان غير محدد مستوى منخفض. فإن السيطرة الإيجابية عرض التفاح مشرق مضان أخضر في النواة (الشكل 1). </li></ol> التفسير الآلي ملاحظة: في additiإلى تفسير مختصر، تحميل الشرائح وتفحص بواسطة NOVA مشاهدة الآلي الإسفار مجهر أو غيرها من أداة التصوير الرقمي الآلي؛ لا غرفة مظلمة هو ضروري. بعد إنشاء المشروع عن طريق تحديد نوع الشريحة المناسبة، يكتسب الصك ومخازن عالية الدقة الصور الرقمية من الخلايا في كل بئر. بالإضافة إلى ذلك، عرض NOVA يقيس شدة الضوء الفلورسنت، ويصنف النتائج بأنها إيجابية أو سلبية، ويوفر نمط الاعتراف للعينات الإيجابية. يتم عرض الصور من قبل المشغل على جهاز الكمبيوتر عالية الدقة، مما يتيح للالتفسير النهائي، ومراجعة وتأكيد NOVA عرض نتيجة. يمكن أن تتولد تقارير عن النتائج المؤكدة. وينبغي استخدام المجهر الرقمي بالتعاون مع فني مختبر من ذوي الخبرة لأنه معد للمساعدة في تفسير النتائج.

<ol>
	<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Tan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+nuclear+antigens+(ANA):+Their+immunobiology+and+medicine.">Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.</a> Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).</li><li>Sack, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+detection+using+indirect+immunofluorescence+on+HEp-2+cells.">Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells.</a> Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells+and+anti-DFS70+antibodies+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+significance+of+the+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern+on+HEp-2+cells+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+phenotypes+of+patients+with+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+a+routine+ANA+referral+cohort.">Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort.</a> Clin Dev Immunol. , (2013).</li><li>Mariz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody+positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Muro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+as+an+autoantigen.">The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen.</a> J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).</li><li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block.">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li><li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies.">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li><li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis/scleroderma+overlap+syndrome.">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li><li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

المؤلفين غابرييلا Lakos، كاساندرا براينت، كارول بوخنر، وآنا اسلامي هم موظفون من INOVA التشخيص.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

الأجسام المضادة للنواة المدى (ANA) يصف مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة التي تتفاعل مع مكونات نواة الخلية بما في ذلك الحمض النووي والبروتينات وribonucleoproteins 1، 2. الخلية التهاب الكبد-2، مجموعة البروتين الأصلي مع مئات من المستضدات، يوفر ركيزة مثالية للكشف عن ANA 1. الكشف عن ANA في مصل الدم البشري هو أداة مهمة لفحص أمراض النسيج الضام، ومعهد التمويل الدولي هو الأسلوب مرجعية لANA اختبار 1. مؤخرا، تم استبدال معهد التمويل الدولي على التهاب الكبد-2 في الخلايا المناعية بعض المختبرات مع مستضد محددة وأساليب متعددة. بسبب المخاوف من نتائج سلبية كاذبة وانعدام الشفافية للأطباء، والكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم شكلت فرقة العمل التي خلصت إلى أن معهد التمويل الدولي باستخدام خلايا التهاب الكبد-2 يجب أن يكون &quot;المعيار الذهبي&quot; لفحص ANA 1. نظرا لطبيعة الشخصية للANA الفحص ونوعية التهاب الكبد-2 الخلايا فيtegral إلى تقارير دقيقة واثقة من النتائج. وجود عدد كبير من الخلايا الإنقسامية، مورفولوجيا الخلايا الأمثل، confluency كافية، والتعبير عن مستضدات ذات الصلة أهمية خاصة. يقدم معهد التمويل الدولي والتعرف على نمط كأداة مهمة للمساعدة في تشخيص المريض. فهم أهمية أنماط مختلفة تمكن الأطباء والعاملين في المختبرات المناسبة لأداء اختبار المتابعة لتأكيد التشخيص. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث متجانسة نمط ANA بحضور مكافحة dsDNA والأجسام المضادة أو لونين، وربما تترافق مع الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) 3. من الجانب الآخر، وصفت مؤخرا أن يسمى كثيفة نمط الأرقط غرامة (DFS) التي ينظر اليها عادة في ما يصل إلى 12٪ من عينات روتينية، ومعظمها ارتبطت الأجسام المضادة للDFS70. هذه الأجسام المضادة، عندما وجدت في عزلة (دون أخرى ANA بأمراض محددة) لا يرتبط مع الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية &lt;سوب&gt; 4-9. الاختبار التأكيدي بذلك عن الأجسام المضادة لمكافحة DFS70 يمكن أن تساعد في الحد من غير الضروري اختبار رد الفعل، وتقديم وفورات كبيرة في التكاليف، وتخفيف القلق المريض. بالنظر إلى أن معهد التمويل الدولي هو أول منهجية الفحص للكشف عن الأجسام المضادة الخط، فإنه من الأهمية بمكان أن يفهم كيف للمستخدم اختيار الكواشف وركائز الأنسجة يمكن أن تؤثر على النتائج. منذ تقنية معهد التمويل الدولي هو ذاتي بطبيعتها، فمن المهم أن الكواشف المستخدمة توفير أعلى نوعية النتائج. هذا الهدف من هذا البروتوكول الفيديو هو تعريف المستخدم مع الخطوات الصحيحة اللازمة لأداء الأسلوب معهد التمويل الدولي، والأنماط الشائعة المرتبطة ANA، وإدخال التطورات الجديدة التي يمكن تبسيط سير العمل وتوحيد النتائج المختبرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم في بيان موقف اختبار ANA ينص على استخدام IIF كأسلوب المعيار الذهبي لفحص ANA 1. على الرغم من أن معهد التمويل الدولي هو اختبار الفحص ممتازة في أيدي الخبراء، والصعوبات التقنية لمعالجة وقراءة الشرائح معهد التمويل الدولي - مثل تجهيز العمل المكثف الشرائح، قراءة دليل، والحاجة إلى ذوي الخبرة والتقنيين المدربين واستخدام غرفة مظلمة - جعل الأسلوب معهد التمويل الدولي من الصعب احتواؤها في سير العمل، والمختبرات الآلي الحديثة. الخطوة الأولى والحاسمة تجاه جودة عالية ANA الفحص هو تجهيز الشريحة حذرا. هذا الإجراء هو العمل المكثف، ويتطلب الفهم الكامل لهذه العملية، وكذلك الانتباه إلى التفاصيل والخبرة. يتم تنفيذ القراءة الشريحة بواسطة المجهر الفلورسنت في غرف مظلمة، ويتم ذلك عن طريق التقنيين المدربين الذين معتادا على أنماط مختلفة، في سياق دورة الخليةومورفولوجية البيني وتقسيم الخلايا. شريطة أن معهد التمويل الدولي هو أول أداة فحص خط التنمية الزراعية والريفية، وفهم الخطوات لتنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية. مؤخرا، تم تطوير أنظمة التصوير الرقمي للقراءة الآلية من الشرائح معهد التمويل الدولي. هذه الأنظمة، مثل NOVA مشاهدة الآلي نيون مجهر، وقد صممت لتبسيط سير العمل الروتينية معهد التمويل الدولي. عرض NOVA يكتسب ومخازن عالية الدقة الصور الرقمية من الآبار، وبالتالي فصل الحصول على الصور من التفسير؛ وينظر إلى الصور وتفسيرها على شاشات الكمبيوتر عالية الدقة. فإنه يخزن الصور كمرجع في المستقبل، وتدعم تفسير المشغل من خلال توفير البيانات الفلورسنت شدة الضوء على الصور. كما أنه يصنف مبدئيا النتائج بأنها إيجابية أو سلبية، ويوفر نمط الاعتراف للعينات الإيجابية. وباختصار، فإنه يلغي الحاجة إلى غرفة مظلمة، وبأتمتة ويبسط readi معهد التمويل الدولينانوغرام / تفسير سير العمل. الأهم من ذلك، لأنه يزيد من الاتساق بين القراء والقراءات. علاوة على ذلك، مع استخدام الشرائح barcoded، يتم استبعاد أخطاء النسخ من خلال توفير إمكانية التتبع وتحديد عينة إيجابية المريض. هذا يؤدي إلى زيادة تكامل البيانات وسلامة المريض. الهدف العام من هذا الفيديو هو للتدليل على الإجراء معهد التمويل الدولي، بما في ذلك تجهيز الشريحة، والتعرف على أنماط معهد التمويل الدولي المشترك، وإدخال التطورات الجديدة إلى تبسيط ومواءمة هذه التقنية.

عند تقييم نتائج تلطيخ خلية لالتهاب الكبد-2، خمسة أنماط النووية الكبرى هي الأكثر شيوعا: متجانسة، الأرقط، السنترومير، نويي، والنقاط النووية. هذه الأنماط هي نتيجة الأجسام المضادة ملزمة للهيئات المكونة محددة من النواة. على الرغم من أن اختبار ANA غير محددة لهياكل النووية، ويمكن أيضا أن يلاحظ أنماط حشوية المرتبطة الأجسام المضادة ضد الهياكل حشوية. في بعض الحالات، قد يكون العديد من الأجسام المضادة الموجودة في العينة، ويمكن أن تظهر الصورة باعتبارها نمط مختلط. هناك غيرها، لاحظ كثير من الأحيان أقل، وغالبا ما أنماط محددة دورة الخلية التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأسلوب معهد التمويل الدولي؛ مؤخرا، وقد وصفت ما يسمى كثيفة نمط الأرقط مع غرامة أهمية سريرية خاصة في بعض الأمصال إيجابية ANA. نمط متجانس لتحديد نمط متجانس، تفحص جيدا وتحديد الإنقسامية أو الفاصلالخلايا. لونين مكثف من الخلايا الإنقسامية (الشكل 2، البرتقال السهم) يسلك الصلبة، مضان موحدة والتي غالبا ما تكون أكثر وضوحا مما كانت عليه في خلية يستريح nuclei.In نمط متجانس، ويستريح الخلايا المعرض موحدة، مضان منتشر للنواة بأكملها (الشكل 2، السهم الأبيض). هذا النمط مميزة وغالبا ما يكون نتيجة لأجسام مضادة لمكافحة dsDNA و10. نمط الأرقط في نمط الأرقط الخشنة، تظهر الخلايا الإنقسامية أي تلطيخ للمناطق الكروموسومات المختصرة (الشكل 3، البرتقال السهم). الخلايا الحبيبية مضان يستريح تظهر في جميع أنحاء نواة بأكملها. والتنقيط النووية يمكن تعريفها بأنها الخشنة أو الغرامة. نمط التنقيط الخشنة وغالبا ما يكون نتيجة لمكافحة-SM ومكافحة RNP 11. في نمط الأرقط غرامة، تظهر الخلايا يستريح التنقيط الغرامة أو منتشر في جميع أنحاء نوى، وعادة في زي دistribution (الشكل 4، السهم الأبيض). نمط الأرقط غرامة وغالبا ما يكون نتيجة لمكافحة SSAand مكافحة SSB 12. الكثيفة مبقع الجميلة نمط من المسلم به الآن أن كثيفة نمط الأرقط غرامة (DFS) هو أمر شائع في الفحوصات الروتينية، وبقدر 12٪ من العينات إيجابية لمكافحة الأجسام المضادة DFS70. ومع ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة، عندما وجدت في عزلة، لا يرتبط مع الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية 4 -6. هذه الأجسام المضادة هي السائدة في الأفراد والمرضى واضعة أمراض لا علاقة لها التنمية الزراعية والريفية 6 صحية. الاختبار التأكيدي لأجسام مضادة لمكافحة DFS70 يمكن أن تساعد في الحد من غير الضروري اختبار رد الفعل، وتقديم وفورات كبيرة في التكاليف، وتخفيف القلق المريض. منذ نمط DFS من الصعب تحديد وANA الإيجابية يمكن أن يسبب القلق لكل من المرضى والأطباء، فمن المستحسن للغاية لإجراء اختبار تأكيدي بعد identi<html> fying نمط موح من الأجسام المضادة المقاومة للDFS70 لتوضيح الأهمية السريرية لANA positivty 5،6. في هذا النمط، والخلايا الإنقسامية (الشكل 5 والبرتقالي السهم) تظهر تلطيخ إيجابية الأرقط من لونين الطورية، في حين يستريح نواة الخلية (الشكل 5، السهم الأبيض) المعرض بقع غرامة وزعت بشكل موحد في جميع أنحاء النواة. السنترومير نمط لتحديد نمط السنترومير، مسح الآبار وتحديد الإنقسامية أو تقسيم الخلايا. في الخلايا الإنقسامية (الشكل 6، البرتقال السهم)، وهذه البقع تصبح منفصلة مرتبطة ارتباطا وثيقا في ما غالبا ما يوصف بأنه &quot;شريط الطورية&quot;. في نمط السنترومير، ويستريح الخلايا (الشكل 6، السهم الأبيض) تظهر ما يقرب من 40-60 بقع منفصلة موزعة في جميع أنحاء نوى. نمط السنترومير هو نتيجة لمكافحة CENP A، B، C الأجسام المضادة 13. خطوة &quot;&gt; نمط نويي وترتبط بعض أنماط نويي مع تلطيخ حشوية منتشر في الخلايا الإنقسامية (الشكل 7، البرتقال السهم) والمنطقة الكروموسومات السلبية، في حين عرض أنماط أخرى nucleolear تلطيخ إيجابية في المنطقة الكروموسومات. ويرتبط هذا النمط نويي مع تلطيخ متجانسة أو الأرقط من نويات (الشكل 7، السهم الأبيض)، جنبا إلى جنب مع ضعف الأرقط أو تلطيخ متجانسة من جبلة النواة. وترتبط هذه الأنماط مع مكافحة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثالث، ومكافحة fibrillarin، anti-Th/To وanti-PM/Scl الأجسام المضادة 14،15. دوت النووية نمط ويرتبط نمط نقطة النووية مع الخلايا السلبية الطورية الإنقسامية (الشكل 8 والبرتقالي السهم) ومع عدد قليل من بقع منفصلة في نواة الخلية يستريح (الشكل 8، السهم الأبيض). هذا النمط مميزة وغالبا ما يكون نتيجة لSP-100، الرابطة الاسلامية، أو P80 الأجسام المضادة كولن. هذه الأجسام المضادة هي على النحو<html> sociated مع التشمع الصفراوي الابتدائي والتهاب الكبد الذاتية 16. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . الرقم 1 السيطرة السلبية (إلى اليسار): خلايا عرضه انخفاض مستوى مضان غير محددة، ولكن لا تلطيخ النووية الرقابة المحددة الإيجابية (اليمين): عرض خلايا التفاح الأخضر مضان النووية. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. نمط متجانسة. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر مضان الصلبة. تظهر الخلايا يستريح حتى، وتلطيخ منتشر (whitearrow). <html> &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الرقم 3. الأرقط الخشنة النمط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ السلبية. تظهر الخلايا يستريح وصمة عار الأرقط متميزة (السهم الأبيض). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. نمط الجميلة الأرقط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ السلبية. تظهر الخلايا يستريح على تلطيخ الأرقط غرامة متميزة (السهم الأبيض). <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. الكثيفة نمط غرامة الأرقط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ الصلبة الحبيبية غرامة. تظهر الخلايا يستريح غرامة جدا، وصمة عار الأرقط منتشر (whitearrow). ogether.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. نمط السنترومير. الخلايا الميتوزى (orangearrow) عرض موحد، بقع منفصلة. يستريح الخلايا (whitearrow) يظهر بقع منفصلة 40-60 في نواة الخلية. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. نمط نويي. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر مجموعات كبيرة اعتبارا من تلطيخ الحبيبية. يستريح الخلايا nucleishows مضان في نويات (whitearrow). <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> الرقم 8. نمط نقطة النووية. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر سلبية. تظهر الخلايا يستريح بضع discrبقع مؤسسة التدريب الأوروبية في النواة (whitearrow). بالإضافة إلى ذلك، فإن نمط نقطة nucelar يمكن أن تتعايش مع تلطيخ حشوية المرتبطة الأجسام المضادة لمستضدات الميتوكوندريا (السهم الأحمر).

Watch this Scientific Journal Video about Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells at JoVE.com

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

وقد جرت العادة على استخدامها مناعي غير المباشرة (معهد التمويل الدولي) فحوصات للكشف عن الأجسام المضادة للنواة (ANA) في مصل الدم البشري. وجود هذه الأجسام المضادة يمكن أن تساعد في تشخيص الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية (التنمية الزراعية والريفية). يوضح هذا البروتوكول كيفية تنفيذ الفعال للتقنية معهد التمويل الدولي للكشف عن الأجسام المضادة هذه بدقة.

مكافحة النووية عن طريق فحص الأجسام المضادة التهاب الكبد-2 خلايا

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

133.8K Views.  INOVA Diagnostics, Inc..  وقد جرت العادة على استخدامها مناعي غير المباشرة (معهد التمويل الدولي) فحوصات للكشف عن الأجسام المضادة للنواة (ANA) في مصل الدم البشري. وجود هذه الأجسام المضادة يمكن أن تساعد في تشخيص الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية (التنمية ال?...

Video: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

تعيش تشريح ذبابة الفاكهة الأجنة : طرق مبسطة للفحص من قبل مجموعات المسخ تلطيخ جسم

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...