Nous remercions Cassandra Bryant pour effectuer l&#39;expérience IIF et Carol Büchner pour son examen technique d&#39;experts.

1. Exemple de sélection et de préparation du support <ol><li> Éliminer les réactifs de l&#39;emballage et de permettre à chaque article à venir à la température ambiante. Préparer les réactifs et diluer le sérum du patient en fonction de la pièce rapportée de direction. Remarque: diapositives NOVA Lite sont un code à barres et peuvent être facilement intégrés dans les systèmes automatisés en collaboration avec le Laboratoire Système d&#39;information LIS. Cette procédure illustre le traitement manuel de diapositives; laboratoires à haut débit, cependant, peuvent opter pour un équipement automatisé de traitement de diapositive. </li></ol> 2. Ajout des contrôles et des échantillons <ol><li> Distribuer une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif dans les puits de glissement appropriées. Introduire à la pipette 20 à 25 pl de sérum dilué patient dans les puits restants. Traiter une diapositive à la fois. </li><li> Placer la lame (s) dans un récipient de coloration avec une serviette en papier humide sur le fond. Couvrir le récipient et laisser incuber le coulisseau (s) pendant 30 min. Note: Les conditions humides seraempêcher le substrat de sécher. Séchage des puits pourrait entraîner une coloration un artefact. Au cours de cette période d&#39;incubation, les anticorps anti-nucléaires dans le sérum du patient se lient aux antigènes des cellules qui sont fixés sur chaque puits. </li><li> Après la période d&#39;incubation, rincer le sérum en utilisant un léger courant de tampon de lavage. Afin d&#39;éviter d&#39;endommager le substrat et empêcher cross-over entre les puits d&#39;échantillons, la glissière angle légèrement pour éviter de diriger le jet directement sur les puits. Secouez tampon de lavage en excès et placer la lame dans une jarre Coplin contenant du tampon de lavage pendant environ 5 min. </li></ol> 3. Ajout de conjugué fluorescent <ol><li> Un par un, supprimer les diapositives de la mémoire tampon de lavage et tapotez doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appliquer 1 goutte de conjugué fluorescent (FITC marqué anti-IgG humaine) sur chaque puits. Incuber les lames pendant 30 min dans le conteneur humidifié, et assurez-vous de remplacer la colorationcouvercle du récipient. Remarque: Pour les tests ANA, l&#39;utilisation d&#39;un conjugué spécifique d&#39;IgG Fc est recommandée. Le conjugué est sensible à la lumière, et le couvercle protège les diapositives de l&#39;exposition à la lumière en plus de maintenir l&#39;environnement humide. Au cours de cette période d&#39;incubation, le conjugué se lie à des anticorps anti-nucléaires du patient qui se sont liés aux antigènes cellulaires. Ce conjugué de liaison se traduit par la présence de la fluorescence dans les puits. </li><li> Rincer et laver la lame comme décrit ci-dessus. </li><li> Placer une lamelle couvre-objet sur une serviette en papier et appliquer un milieu de montage dans une ligne continue sur le bord inférieur de la lamelle. </li><li> Retirez chaque diapositive du tampon de lavage et appuyez sur la diapositive doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appuyez sur le bord inférieur de la lame vers le bord de la lamelle. </li><li> Abaisser doucement le glisser sur la lamelle couvre-objet de telle manière que le milieu de montage sur la lamelle couvre-objet s&#39;écoule vers le bord supérieur de la lame sans formation de bulles d&#39;air. Note: Coverslipping, y compris en utilisant la quantité optimale de milieu de montage, est une technique qui demande de la pratique de la perfection. </li></ol> 4. Identification des résultats positifs et négatifs Interprétation Manuel <ol><li> Voir glisse avec un microscope à fluorescence, situé dans une pièce sombre. Effectuer un balayage de l&#39;ensemble du bien avec un objectif 20X ou 25X pour évaluer la distribution de cellules et l&#39;uniformité de la fluorescence </li><li> Basculer vers un objectif 40X pour rendre l&#39;interprétation finale concernant la positivité et le motif. </li><li> Regardez les contrôles positifs et négatifs. positivité de grade en utilisant une échelle de notation de la réactivité de 1 + à 4 +. Remarque: Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais souvent afficher fluorescence non spécifique faible niveau. Le contrôle positif afficher pomme lumineux fluorescence verte dans le noyau (figure 1). </li></ol> Interprétation automatisée Remarque: En additià l&#39;interprétation manuelle, la charge et Numérisation de diapositives par NOVA Voir Microscope à fluorescence automatisé ou tout autre instrument d&#39;imagerie numérique automatisé; pas de chambre noire est nécessaire. Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de diapositive échéant, l&#39;instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution de cellules dans chaque puits. En outre, NOVA Voir mesure l&#39;intensité de la lumière fluorescente, et catégorise les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. Images sont visualisées par l&#39;opérateur sur un écran d&#39;ordinateur à haute résolution, permettant l&#39;interprétation finale, la révision et la confirmation de NOVA Voir résultat. Les rapports peuvent être générés sur les résultats confirmés. Microscopie numérique doit être utilisé en conjonction avec un technicien de laboratoire expérimenté car il est destiné à faciliter l&#39;interprétation des résultats.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Les auteurs Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, et Anna Eslami sont des employés de INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

L&#39;anticorps antinucléaires terme (ANA) décrit une variété d&#39;auto-anticorps qui réagissent avec les constituants des noyaux de cellules dont l&#39;ADN, des protéines et ribonucléoprotéines 1, 2. La cellule HEp-2, une matrice de protéine native avec des centaines d&#39;antigènes, fournit un substrat idéal pour la détection d&#39;une ANA. La détection de l&#39;ANA dans le sérum humain est un outil de dépistage important pour les maladies du tissu conjonctif, et IIF est la méthode de référence pour tester ANA 1. Récemment, IIF sur cellules HEp-2 a été remplacé dans certains laboratoires avec des dosages immunologiques spécifiques de l&#39;antigène et méthodes multiplex. En raison de préoccupations au sujet des résultats faussement négatifs et le manque de transparence pour les cliniciens, l&#39;American College of Rheumatology a formé un groupe de travail qui a conclu que l&#39;aide IIF cellules HEp-2 devrait être le «gold standard» pour le dépistage ANA 1. En raison de la nature subjective de criblage ANA, la qualité des cellules HEp-2 est enintégrante de rapports précis et sûr des résultats. La présence d&#39;un nombre élevé de cellules en mitose, la morphologie cellulaire optimale, la confluence suffisante, et l&#39;expression des antigènes en question sont particulièrement importants. Reconnaissance de formes IIF sert comme un outil important pour aider au diagnostic du patient. Comprendre l&#39;importance de divers modèles permet aux cliniciens et le personnel de laboratoire pour effectuer les essais de suivi approprié pour confirmer le diagnostic. Par exemple, le motif ANA homogène peut se produire en présence d&#39;anticorps anti-ADN double brin chromatine ou, et peut être associé à un lupus érythémateux disséminé (SLE) 3. De l&#39;autre côté, il a été récemment décrit que la configuration dite fine et dense mouchetée (DFS) qui est couramment observée jusqu&#39;à 12% des échantillons de routine, a surtout été associée à des anticorps anti-DFS70. Ces auto-anticorps, une fois trouvé dans l&#39;isolement (sans autre ANA spécifique de la maladie) ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques &lt;sup&gt; 4-9. Tests de confirmation de ce fait pour les anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l&#39;anxiété du patient. Étant donné que l&#39;IIF est la première méthode de dépistage de la ligne pour détecter des auto-anticorps, il est primordial que l&#39;utilisateur comprenne comment le choix des réactifs et des substrats de tissus peut influer sur les résultats. Depuis la technique IIF est intrinsèquement subjective, il est important que les réactifs utilisés fournissent les résultats de la plus haute qualité. Cet objectif de ce protocole vidéo est de familiariser l&#39;utilisateur avec les bonnes mesures nécessaires pour exécuter la méthode IIF, les modèles communs associés à ANA, et d&#39;introduire de nouvelles avancées qui peuvent rationaliser le flux de travail de laboratoire et de normaliser les résultats.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

L&#39;American College of Rheumatology énoncé de position sur les tests ANA prévoit l&#39;utilisation de l&#39;IIF que la méthode de l&#39;étalon-or pour le dépistage ANA 1. Bien IIF est un excellent test de dépistage dans des mains expertes, les difficultés techniques de traitement et de lecture IIF glisse - comme la intensif de traitement du travail de diapositives, une lecture manuelle, la nécessité d&#39;une expérience, les technologues formés et l&#39;utilisation de la salle sombre - rendre la méthode IIF difficile de faire entrer dans le flux de travail de laboratoires automatisés, modernes. La première étape cruciale vers la haute qualité dépistage ANA est le traitement de diapositive attention. Cette procédure est laborieuse et nécessite une bonne compréhension du processus, ainsi que l&#39;attention aux détails et l&#39;expérience. Glisser lecture est effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et se fait par des techniciens qualifiés qui sont familiers avec les différents modèles, dans le cadre du cycle cellulaireet la morphologie de l&#39;interphase et les cellules en division. À condition que l&#39;IIF est le premier outil de dépistage de la ligne pour l&#39;ADRD, comprendre les étapes à exécuter correctement cette technique est critique. Récemment, des systèmes d&#39;imagerie numérique ont été développés pour la lecture automatique des diapositives IIF. Ces systèmes, tels que le NOVA Voir microscope à fluorescence automatisé, sont conçus pour faciliter le travail IIF routine. NOVA Voir acquiert et stocke les images numériques de haute résolution des puits, séparant ainsi l&#39;acquisition d&#39;images à partir de l&#39;interprétation; images sont visualisées sur une interprétation d&#39;un des écrans d&#39;ordinateur à haute résolution. Il stocke les images pour référence future et prend en charge l&#39;interprétation de l&#39;opérateur en fournissant des données d&#39;intensité de lumière fluorescentes sur les images. Il classe également au préalable les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. En résumé, il élimine le besoin de chambre noire, et automatise et rationalise le readi IIFng / flux de travail d&#39;interprétation. Surtout, il augmente la cohérence entre les lecteurs et les lectures. De plus, avec l&#39;utilisation de diapositives à code-barres, les erreurs de transcription sont éliminés en fournissant la traçabilité des échantillons et l&#39;identification positive du patient. Il en résulte l&#39;intégrité des données du patient et de sécurité accrue. L&#39;objectif global de cette vidéo est de démontrer la procédure IIF, y compris le traitement de diapositives, l&#39;identification de modèles IIF communes, et l&#39;introduction de nouvelles avancées pour simplifier et harmoniser cette technique.

Lors de l&#39;évaluation des résultats de coloration cellulaire pour HEp-2, cinq grands modèles nucléaires sont les plus fréquemment rapportés: homogène, moucheté, centromère, nucléolaire et points nucléaires. Ces modèles sont le résultat de la liaison d&#39;auto-anticorps spécifiques de constituants du noyau. Bien que les tests ANA est spécifique aux structures nucléaires, cytoplasmiques modèles associés à des auto-anticorps contre les structures cytoplasmiques peuvent également être observés. Dans certains cas, plusieurs auto-anticorps peuvent être présents dans un échantillon, et l&#39;image peuvent apparaître comme un modèle mixte. Il existe d&#39;autres, moins fréquemment observé, et souvent des modèles spécifiques du cycle cellulaire qui peuvent être détectés par la méthode IIF; plus récemment, un soi-disant modèle finement mouchetée dense de signification clinique spéciale a été décrite dans certains sérums positif ANA. Motif homogène Pour identifier un modèle homogène, analyser le bien et identifier mitotique ou séparationcellules. La chromatine condensée des cellules en mitose (figure 2, orange flèche) présente solide, fluorescence uniforme, qui est souvent plus prononcée que dans la cellule de repos nuclei.In la structure homogène, les cellules au repos exposition uniforme, fluorescence diffuse de l&#39;ensemble du noyau (Figure 2, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d&#39;anticorps anti-ADN double brin 10. Motif tacheté Dans le motif moucheté grossier, les cellules mitotiques ne présentent pas de coloration des régions chromosomiques condensés (Figure 3, orange flèche). Les cellules au repos présentent une fluorescence granulaire dans l&#39;ensemble du noyau. La moucheture nucléaire peut être définie comme grossier ou fin. Le motif de taches grossier est souvent le résultat d&#39;anti-Sm et anti-RNP 11. Dans le modèle finement mouchetée, les cellules au repos montrent taches amende ou diffus à travers les noyaux, généralement en uniforme distribution (figure 4, flèche blanche). Le motif finement mouchetée est souvent le résultat de l&#39;anti-anti-SSB SSAand 12. Dense Motif Fin tacheté Il est maintenant reconnu que l&#39;amende motif tacheté dense (DFS) est commun dans les tests de routine, et autant que 12% des échantillons sont positifs pour les auto-anticorps anti-DFS70. Cependant, ces auto-anticorps, quand trouvés dans l&#39;isolement, ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques 4 -6. Ces anticorps sont répandues dans les individus et les patients porteurs de maladies non liées à l&#39;ADRD 6 sains. Les tests de confirmation des anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l&#39;anxiété du patient. Depuis le modèle DFS est difficile d&#39;identifier et ANA positivité peut causer de l&#39;anxiété pour les patients et les médecins, il est fortement recommandé d&#39;effectuer un test de confirmation après identification<html> Fying un motif suggestif d&#39;anticorps anti-DFS70 de clarifier la signification clinique de l&#39;ANA positivty 5,6. Dans ce modèle, les cellules en mitose (figure 5, flèche orange) montrent une coloration mouchetée positif de la chromatine en métaphase, tout en se reposant noyaux cellulaires (figure 5, flèche blanche) présentent des fines mouchetures uniformément réparties dans tout le noyau. Motif centromère Pour identifier le modèle de centromère, analyser les puits et identifier mitotique ou cellules en division. Dans les cellules en mitose (figure 6, flèche orange), ces mouchetures discrètes deviennent étroitement associés à ce qui est souvent décrit comme une &quot;barre de métaphase&quot;. Dans le modèle de centromère, les cellules au repos (figure 6, flèche blanche) montrent environ 40-60 mouchetures discrètes réparties dans les noyaux. Le motif de centromère est le résultat d&#39;anti-CENP A, B, C des anticorps 13. étape &quot;&gt; Motif Nucleolar Certains motifs nucléolaires sont associées à une coloration cytoplasmique diffuse dans les cellules en mitose (figure 7, orange flèche) et de la région chromosomique négative, tandis que d&#39;autres modèles nucleolear présentent une coloration positive de la région chromosomique. L&#39;aspect nucléolaire est associé à la coloration homogène ou tacheté des nucléoles (figure 7, flèche blanche), avec fontaine faible ou coloration homogène du nucléoplasme. Ces motifs sont associés à anti-ARN polymérase III, anti-fibrillarine, anti-Th/To et anti-PM/Scl anticorps 14,15. Motif de point nucléaire Le motif de points nucléaire est associée à des cellules négatives métaphase de la mitose (figure 8, flèche orange) et avec quelques mouchetures discrètes dans les noyaux des cellules de repos (figure 8, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d&#39;auto-anticorps p80 colin sp-100, PML, ou. Ces anticorps sont aussi<html> sociated avec la cirrhose biliaire primitive et l&#39;hépatite auto-immune 16. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figure 1 témoin négatif (à gauche): Les cellules affichent un faible niveau de fluorescence non spécifique, mais pas de coloration nucléaire spécifique contrôle positif (à droite):. Cellules affichent pomme fluorescence nucléaire vert. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Modèle homogène. Des cellules mitotiques (de orangearrow) montrent fluorescence solide. Les cellules au repos montrent même, coloration diffuse (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 3. Grossier mouchetée modèle. Cellules mitotiques (de flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une tache tacheté distincte (flèche blanche). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Motif Beaux mouchetée. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une fluorescence finement mouchetée distincte (flèche blanche). <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. Dense motif fin moucheté. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration solide granulaire fine. Les cellules au repos montrent une très fine, tache mouchetée diffuse (whitearrow). Figure 6. Modèle centromère. Des cellules mitotiques (de) orangearrow spectacle uniforme, mouchetures discrètes. Les cellules au repos (whitearrow) montre 40-60 mouchetures discrètes par noyau de la cellule. <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Figure 7. Modèle Nucleolar. Des cellules mitotiques (de orangearrow) apparaissent comme des grappes de coloration granulaire. Repos cellule nucleishows fluorescence dans les nucléoles (whitearrow). <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Figure 8. Motif de points nucléaire. Des cellules mitotiques (de orangearrow) semble négative. Les cellules au repos montrent un peu discrmouchetures ete dans le noyau (whitearrow). De plus, le modèle de point Nucelar peuvent coexister avec une coloration cytoplasmique associée à des auto-anticorps contre les antigènes mitochondriaux (flèche rouge).

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Immunofluorescence indirecte (IFI) les essais ont traditionnellement été utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires (ANA) dans le sérum humain. La présence de ces anticorps peut aider au diagnostic de maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (ADRD). Ce protocole montre comment effectuer efficacement la technique IIF pour détecter avec précision ces auto-anticorps.

Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

133.7K vues.  INOVA Diagnostics, Inc..  Immunofluorescence indirecte (IFI) les essais ont traditionnellement été utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires (ANA) dans le sérum humain. La présence de ces anticorps peut aider au diagnostic de maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (ADRD). Ce protocole montre comment effectuer efficacement la technique IIF pour détecter avec précision ces auto-anticorps. 

Vidéo: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...