Agradecemos Cassandra Bryant para a realização do experimento IIF e Carol Buchner para ela especialista revisão técnica.

1. Preparação de amostras e Substrato Seleção <ol><li> Remover reagentes de embalagem e permitir que cada item para voltar à temperatura ambiente. Preparar os reagentes e diluir o soro do paciente de acordo com a direcção de inserção. Nota: NOVA Lite slides estão com código de barras e pode ser facilmente integrado em sistemas automatizados em conjunto com o Sistema de Informação do Laboratório LIS. Este procedimento ilustra o processamento de slides manual; laboratórios de alto rendimento, no entanto, pode optar por equipamentos automatizados de processamento de slide. </li></ol> 2. Adição de controles e amostras <ol><li> Dispensar uma gota de controlo positivo, e 1 gota de controlo negativo para os poços de deslizamento apropriados. Pipeta de 20-25 ul de soro de um paciente diluída aos poços restantes. Processe um slide de cada vez. </li><li> Colocar a lâmina (s) em um recipiente de coloração com uma toalha de papel húmido no fundo. Cobrir o recipiente e incubar a lâmina (s), durante 30 min. Nota: As condições de umidade vaievitar que o substrato de secar. A secagem dos poços pode resultar em fluorescência artificial. Durante este período de incubação, os anticorpos anti-nucleares em soro do paciente, ligam-se a antigénios das células que estão fixos em cada poço. </li><li> Após o período de incubação, enxaguar o soro utilizando uma corrente suave de tampão de lavagem. A fim de evitar danos no substrato e evitar cross-over de amostras entre os poços, o ângulo de deslize ligeiramente para evitar a dirigir o fluxo directamente nos poços. Toque fora tampão de lavagem em excesso e coloque o slide em uma jarra de Coplin contendo tampão de lavagem por cerca de 5 min. </li></ol> 3. Adição de Fluorescente Conjugado <ol><li> Um por um, remova os slides da tampão de lavagem e bata suavemente para remover o excesso de tampão de lavagem. Aplicar uma gota de conjugado fluorescente (FITC IgG anti-humano) em cada poço. Incubar as lâminas por 30 min no recipiente umidificado, e não se esqueça de substituir a coloraçãotampa do recipiente. Nota: Para o teste ANA, é recomendado o uso de um conjugado específico IgG Fc. O conjugado é sensível à luz, e a tampa irá proteger as lâminas da exposição à luz, além de manter o ambiente humidificado. Durante este período de incubação, o conjugado irá ligar-se a anticorpos anti-nucleares do paciente que se ligaram aos antigénios celulares. Resultados da ligação deste conjugado na presença de fluorescência nas cavidades. </li><li> Lavar e lavar a lâmina, como descrito acima. </li><li> Coloque uma lamela sobre uma toalha de papel e aplicar o meio de montagem numa linha contínua para a extremidade inferior da lamela. </li><li> Retire cada slide da tampão de lavagem e bata suavemente a lâmina para remover o excesso de tampão de lavagem. Tocar a borda inferior da lâmina para a extremidade da lamela. </li><li> Cuidadosamente, baixe a lamela na lâmina, de tal forma que o meio de montagem na lamela flui para a extremidade superior da lâmina, sem a formação de bolhas de ar. Nota: Coverslipping, inclusive usando a quantidade ideal de meio de montagem, é uma técnica que requer prática para aperfeiçoar. </li></ol> 4. Identificação de resultados positivos e negativos Interpretação manual <ol><li> Ver slides com um microscópio de fluorescência, localizada em um quarto escuro. Realizar a verificação da totalidade do poço com uma objectiva 20X ou 25X para avaliar a distribuição de células e uniformidade de fluorescência </li><li> Mudar para uma objetiva de 40X para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão. </li><li> Olhe para os controles positivos e negativos. Grau positividade usando uma escala de classificação de reatividade de 1 + a 4 +. Nota: O controle negativo não pode aparecer completamente escuro, mas muitas vezes irá exibir baixo nível de fluorescência inespecífica. O controle positivo irá exibir fluorescência verde maçã brilhante no núcleo (Figura 1). </li></ol> Interpretação automatizada Nota: Em comum, alémsobre a interpretação manual, carga e digitalizar slides pela Nova Visão Automated microscópio de fluorescência ou outro instrumento automatizado de imagem digital; nenhuma câmara escura é necessária. Depois de criar um projeto, selecionando o tipo de slide for o caso, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução de células em cada poço. Além disso, a NOVA Ver mede a intensidade da luz fluorescente, e classifica os resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões de amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação da NOVA Ver resultado. Os relatórios podem ser gerados em resultados confirmados. Microscopia digital deve ser usado em conjunção com um técnico de laboratório experiente, pois destina-se a ajudar na interpretação dos resultados.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Os autores Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, e Anna Eslami são funcionários da INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

O termo anticorpos antinucleares (ANA) descreve uma variedade de auto-anticorpos que reagem com os componentes de núcleos de células, incluindo DNA, proteínas e ribonucleoproteínas 1, 2. A células HEp-2, um array de proteínas nativas com centenas de antigénios, fornece um substrato ideal para a detecção de ANA 1. A detecção de ANA no soro humano é uma importante ferramenta de triagem para doenças do tecido conjuntivo, e IIF é o método de referência para o teste ANA 1. Recentemente, IFI em células HEp-2 tem sido substituído, em alguns laboratórios com imunoensaios específicos para o antigénio e os métodos de multiplex. Devido a preocupações com resultados falsos negativos ea falta de transparência para os médicos, o Colégio Americano de Reumatologia formado um Grupo de Trabalho que concluiu que IFI utilizando células HEp-2 deve ser o &quot;padrão ouro&quot; para a ANA triagem 1. Devido à natureza subjetiva de triagem ANA, a qualidade das células HEp-2 éTegral de relatórios precisos e confiante dos resultados. A presença de um elevado número de células mitóticas, a morfologia óptima de células, confluência suficiente, e a expressão de antigénios relevantes são particularmente importantes. Reconhecimento de padrões IIF serve como uma importante ferramenta para auxiliar no diagnóstico do paciente. Compreender o significado de vários padrões permite que os médicos e pessoal de laboratório para realizar o teste apropriado de acompanhamento para confirmar o diagnóstico. Por exemplo, homogénea padrão ANA pode ocorrer na presença de anti-dsADN ou anticorpos de cromatina, e podem estar associados com lúpus eritematoso sistémico (LES) 3. Do outro lado, foi recentemente descrito que o assim chamado padrão pontilhado fino denso (DFS) que é frequentemente observado em até 12% de amostras de rotina, tem sido principalmente associada com anticorpos anti-DFS70. Esses auto-anticorpos, quando encontrado em isolamento (sem outra doença específica ANA) não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas &lt;sup&gt; 4-9. Assim, o teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente. Dado que IIF é a primeira metodologia de triagem linha para detectar auto-anticorpos, é fundamental que o usuário entenda como a selecção de reagentes e substratos de tecido podem afetar os resultados. Uma vez que a técnica de IFI é inerentemente subjectiva, é importante que os reagentes utilizados fornecer os resultados da mais alta qualidade. Este objetivo deste protocolo de vídeo é familiarizar o usuário com os passos corretos necessários para executar o método IIF, os padrões comuns associados com a ANA, e introduzir novos avanços que podem agilizar o fluxo de trabalho de laboratório e padronizar resultados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

O Colégio Americano de Reumatologia declaração de posição sobre o teste ANA prevê o uso de IIF como o método padrão-ouro para ANA triagem 1. Embora IIF é um teste de rastreio excelente nas mãos de especialistas, as dificuldades técnicas de processamento e leitura IIF desliza - como o processamento intensivo trabalho de slides, leitura manual, a necessidade de experiente, tecnólogos formados eo uso de quarto escuro - tornar o método IIF difíceis de encaixar no fluxo de trabalho de, laboratórios automatizados modernos. O primeiro e fundamental passo para a alta qualidade de triagem ANA é o processamento de slides cuidado. Este procedimento é trabalhoso e requer uma compreensão completa do processo, bem como a atenção aos detalhes e experiência. A leitura das lâminas é realizada por meio de microscopia de fluorescência em salas escuras, e é feito por técnicos treinados, que estão familiarizados com os vários padrões, no contexto do ciclo celulare a morfologia de interfase e células em divisão. Desde que IIF é a primeira ferramenta de triagem linha para SARD, compreender as etapas para executar corretamente essa técnica é fundamental. Recentemente, sistemas de imagem digitais têm sido desenvolvidos para a leitura automática das lâminas de IFI. Estes sistemas, como o NOVA Ver Automated microscópio fluorescente, são projetados para simplificar o fluxo de trabalho IIF rotina. NOVA Ver adquire e armazena imagens digitais de alta resolução dos poços, separando assim a aquisição de imagem a partir de interpretação; imagens são visualizadas uma interpretadas em monitores de computador de alta resolução. Ele armazena as imagens para referência futura e apóia a interpretação do operador, fornecendo dados de intensidade de luz fluorescente nas imagens. Também categoriza preliminarmente resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões para as amostras positivas. Em resumo, o que elimina a necessidade de câmara escura, e automatiza e simplifica o readi IIFng / interpretação do fluxo de trabalho. Mais importante, ele aumenta a consistência entre leitores e leituras. Além disso, com o uso de lâminas com código de barras, os erros de transcrição, são eliminados pelo fornecimento de rastreabilidade da amostra e identificação positiva do paciente. Isto resulta num aumento da integridade e da segurança dos dados do paciente. O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o procedimento IIF, incluindo processamento de slide, identificação de padrões comuns IIF, ea introdução de novos avanços para simplificar e harmonizar esta técnica.

Ao avaliar os resultados da coloração de células de HEp-2, cinco padrões nucleares são mais comumente relatados: homogênea, salpicadas centrômero, nucleolar e pontos nucleares. Estes padrões são o resultado da ligação de auto-anticorpos para componentes específicos do núcleo. Embora o teste de ANA é específico para estruturas nucleares, padrões citoplasmáticos associados à auto-anticorpos contra estruturas citoplasmáticas também podem ser observadas. Em alguns casos, vários auto-anticorpos podem estar presentes em uma amostra, e a imagem pode aparecer como um padrão misto. Há outros, menos freqüentemente observada, e muitas vezes padrões específicos do ciclo celular que podem ser detectados pelo método IIF; mais recentemente, um chamado padrão pontilhado fino denso, com significância clínica especial tem sido descrita em algum soros positivos ANA. Homogêneo Padrão Para identificar um padrão homogêneo, a varredura do bem e identificar mitótico ou divisóriacélulas. A cromatina condensada das células mitóticas (Figura 2, laranja seta) exibe fluorescência sólida, uniforme, o que é muitas vezes mais pronunciado do que na célula de repouso nuclei.In o padrão homogéneo, a células em repouso uniforme exposição, fluorescência difusa de todo o núcleo (Fig. 2, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de anticorpos anti-dsDNA 10. Padrão pontilhado No padrão salpicado grosseira, as células mitóticas não mostram coloração das regiões cromossómicas condensados ​​(Figura 3, laranja seta). As células em repouso exibem fluorescência granulado em todo o núcleo. O salpicar nuclear pode ser definida como grosso ou fino. O padrão salpicar Grosso é muitas vezes o resultado de anti-Sm e anti-RNP 11. No padrão pontilhado fino, as células em repouso mostrar salpicar multa ou difuso ao longo dos núcleos, geralmente em uniforme dISTRIBUIÇÃO (Figura 4, seta branca). O padrão pontilhado fino é muitas vezes o resultado de anti-SSAand anti-SSB 12. Densa Padrão Belas Speckled Sabe-se agora que o padrão pontilhado fino denso (DFS) é comum nos testes de rotina, e tanto quanto 12% de amostras positivas para autoanticorpos são anti-DFS70. No entanto, esses auto-anticorpos, quando encontrados isoladamente, não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas 4 -6. Estes anticorpos são prevalentes em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doenças não relacionadas com SARD 6 de rolamento. O teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente. Como o padrão DFS é difícil identificar e ANA positividade pode causar ansiedade para pacientes e médicos, é altamente recomendável realizar um teste confirmatório após identificação<html> car um padrão sugestivo de anticorpos anti-DFS70 para esclarecer o significado clínico da ANA positivty 5,6. Neste padrão, as células mitóticas (Figura 5, laranja de setas) apresenta coloração salpicada positivo da cromatina metáfase, enquanto descansa os núcleos das células (Figura 5, seta branca) apresentam manchas finas uniformemente distribuídas por todo o núcleo. Centromere Padrão Para identificar o padrão de centrômero, navegue pelos poços e identificar mitótico ou células em divisão. Em células mitóticas (Figura 6, seta laranja), essas manchas tornam-se intimamente associado discretos no que é muitas vezes descrito como um &quot;bar metaphase&quot;. No padrão centrómero, descansando células (Figura 6, seta branca) mostram aproximadamente 40-60 manchas discretas distribuídas por todo o núcleo. O padrão de centrómero é o resultado de anti-CENP A, B, C de anticorpos 13. passo &quot;&gt; Nucleolar Padrão Alguns padrões de nucléolos estão associados com a coloração citoplasmática difusa em células mitóticas (Figura 7, laranja seta) e região cromossómica negativo, enquanto que outros padrões nucleolear exibir coloração positiva da região cromossómica. O padrão nucleolar está associado com a coloração homogénea ou salpicado dos nucléolos (Figura 7, seta branca), juntamente com salpicado fraco ou coloração homogénea do nucleoplasma. Estes padrões estão associados a anti-RNA polimerase III, anti-fibrilarina, anti-Th/To e anti-PM/Scl anticorpos 14,15. Dot Nuclear Padrão O padrão de ponto nuclear está associada com as células mitóticas metafase negativos (Figura 8, laranja de seta) e com poucas manchas discretas nos núcleos de células de repouso (Figura 8, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de sp-100, PML, ou auto-anticorpos p80 Colin. Estes anticorpos são tão<html> associada com cirrose biliar primária e hepatite auto-imune 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figura 1 controle negativo (esquerda): células apresentam baixo nível de fluorescência não específica, mas nenhuma marcação nuclear específica de controle positivo (direita):. Células apresentam fluorescência nuclear maçã verde. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 2. Homogênea. Células mitóticas (orangearrow) mostram fluorescência sólida. Células em repouso mostrar mesmo, coloração difusa (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Grosso salpicado padrão. Células mitóticas (seta laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma mancha salpicado distinta (seta branca). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Padrão pontilhado fino. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma coloração pontilhado fino distinta (seta branca). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Padrão pontilhado fino denso. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram uma coloração sólida granular bem. Células em repouso mostram uma muito fina, salpicado mancha difusa (whitearrow). Padrão Figura 6. Centromere. Células mitóticas (orangearrow) mostram uniforme, manchas discretas. Descansando células (whitearrow) mostra 40-60 manchas discretas por núcleo celular. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 7. Nucleolar. Células mitóticas (orangearrow) aparecem como grandes aglomerados de coloração granular. Descansando célula nucleishows fluorescência no nucléolo (whitearrow). <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 8. Ponto Nuclear. Células mitóticas (orangearrow) aparecem negativo. Células em repouso mostrar alguns DISCRmanchas ete no núcleo (whitearrow). Além disso, o padrão de pontos nucelar pode coexistir com coloração citoplasmática associada com auto-anticorpos contra antígenos mitocondriais (seta vermelha).

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos.

Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

133.7K visualizações.  INOVA Diagnostics, Inc..  Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos. 

Vídeo: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...