Wir danken Cassandra Bryant für die Durchführung der IIF Experiment und Carol Buchner für ihre kompetente technische Bewertung.

1. Probenvorbereitung und Substratauswahl <ol><li> Reagenzien aus der Verpackung und lassen Sie jedes Element auf Raumtemperatur kommen. Bereiten Reagenzien und Patientenproben entsprechend der Richtung Einsatz. Hinweis: NOVA Lite Folien werden mit Strichcode und kann leicht in automatisierte Systeme in Verbindung mit dem Laborinformationssystem LIS integriert werden. Dieses Verfahren zeigt Handschiebe Verarbeitung; Hochdurchsatzlabors, können jedoch für die automatisierte Verarbeitung Ausrüstung Rutsche entscheiden. </li></ol> 2. Zugabe von Kontrollen und Proben <ol><li> 1 Tropfen positive Kontrolle und 1 Tropfen Negativkontrolle zu den entsprechenden Schiebe Brunnen. Pipette 20-25 ul verdünnten Patientenserum an die übrigen Brunnen. Prozess einer Folie zu einer Zeit. </li><li> Setzen Sie den Schieber (s) in einer Färbung Behälter mit einem feuchten Papiertuch auf dem Boden. Decken Sie die Behälter und inkubieren Sie die Folie (n) für 30 min. Hinweis: Die feuchten Bedingungen wirdverhindern, dass das Substrat vor Austrocknung. Die Trocknung der Brunnen könnte Artefaktfärbung führen. Während dieser Inkubationszeit werden die anti-nukleäre Antikörper im Serum des Patienten auf die Antigene von den Zellen, die gut auf jede fixiert binden. </li><li> Nach der Inkubationszeit, spülen Sie das Serum mit einem sanften Strom von Waschpuffer. Um zu vermeiden, das Substrat zu beschädigen und Cross-over von Proben zwischen Brunnen, Winkel der Schieber verhindern, leicht zu vermeiden, die Leitung der Strom direkt auf den Brunnen. Tippen Sie überschüssiges Waschpuffer und legen Sie die Folie in eine Glasküvette mit Waschpuffer für ca. 5 min. </li></ol> 3. Zugabe von Leuchtstoff-Konjugat <ol><li> Einer nach dem anderen, entfernen Sie die Folien aus der Waschpuffer und klopfen Sie leicht, um das überschüssige Waschpuffer zu entfernen. 1 Tropfen fluoreszierendes Konjugat (FITC-markierten Anti-Human-IgG) auf jede Vertiefung. Die Objektträger 30 min in der Feuchtekammer, und sicher sein, um die Färbung zu ersetzenBehälterdeckel. Anmerkung: Für ANA-Test ist die Verwendung eines IgG-Fc-spezifischen Konjugat empfohlen. Das Konjugat ist lichtempfindlich, und der Deckel wird die Folien vor Licht neben der Erhaltung der befeuchteten Umwelt zu schützen. Während dieser Inkubationszeit wird das Konjugat des Patienten anti-nukleäre Antikörper, die an die Antigene gebunden haben, zu binden. Dieses Konjugat-Bindungsergebnisse in Gegenwart von Fluoreszenz in den Vertiefungen. </li><li> Spülen und waschen Sie die Folie wie oben beschrieben. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf einem Papiertuch und gelten Montagemedium in einer durchgehenden Linie bis zum unteren Rand des Deckglases. </li><li> Entfernen Sie jede Folie aus der Waschpuffer und tippen Sie die Folie vorsichtig, um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Berühren Sie den unteren Rand der Folie an den Rand des Deckglases. </li><li> Senken Sie den Schlitten auf dem Deckglas in einer Weise, dass das Einschlussmittel auf dem Deckglas fließt zu dem oberen Rand der Folie ohne Luftblasenbildung. Hinweis: Coverslipping, einschließlich der Verwendung der optimalen Menge an Eindeckmedium, ist eine Technik, Praxis nimmt zu perfektionieren. </li></ol> 4. Identifikation von positiven und negativen Ergebnissen Manuelle Interpretation <ol><li> Blick gleitet mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, in einem dunklen Raum. Führen Abtasten der gesamten gut mit einem 20X oder 25X Ziel, Zellverteilung und Einheitlichkeit der Fluoreszenz beurteilen </li><li> Wechseln Sie zu einem 40X-Objektiv, um die endgültige Auslegung hinsichtlich Positivität und Muster zu machen. </li><li> Schauen Sie sich die positiven und negativen Kontrollen. Grade Positivität mit einer Reaktivität Notenskala von 1 + bis 4 +. Hinweis: Die Negativkontrolle nicht vollständig dunkel erscheinen, wird aber oft geringe unspezifische Fluoreszenz anzuzeigen. Die positive Kontrolle wird hell apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern (Abbildung 1) anzuzeigen. </li></ol> Automatische Interpretation Hinweis: In additiauf manuelle Interpretation, Last-und Scan-Folien von NOVA anzeigen Automatisierte Fluoreszenz-Mikroskop oder andere automatisierte digitale Bild Instrument; keine Dunkelkammer erforderlich. Nach dem Erstellen eines Projekts durch Auswahl der entsprechenden Folientyp, erwirbt das Gerät und speichert hochauflösende digitale Bilder von Zellen in jede Vertiefung. Zusätzlich misst NOVA anzeigen Fluoreszenzlichtintensität, und kategorisiert Ergebnisse als positiv oder negativ, und stellt Mustererkennung für die positiven Proben. Die Bilder werden durch den Betreiber auf einem hochauflösenden Computer-Monitor betrachtet, so dass für endgültige Interpretation, Revision und Bestätigung der Ergebnis NOVA View. Berichte können auf bestätigten Ergebnisse erzeugt werden. Digitale Mikroskopie sind in Verbindung mit einem erfahrenen Labortechniker verwendet werden, wie es beabsichtigt ist, bei der Interpretation der Ergebnisse zu unterstützen.

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	<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Tan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+nuclear+antigens+(ANA):+Their+immunobiology+and+medicine.">Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.</a> Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).</li><li>Sack, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+detection+using+indirect+immunofluorescence+on+HEp-2+cells.">Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells.</a> Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells+and+anti-DFS70+antibodies+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+significance+of+the+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern+on+HEp-2+cells+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+phenotypes+of+patients+with+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+a+routine+ANA+referral+cohort.">Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort.</a> Clin Dev Immunol. , (2013).</li><li>Mariz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody+positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Muro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+as+an+autoantigen.">The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen.</a> J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).</li><li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block.">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li><li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies.">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li><li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis/scleroderma+overlap+syndrome.">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li><li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Die Autoren Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, Anna und Eslami sind Mitarbeiter von INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

Der Begriff antinukleäre Antikörper (ANA) beschreibt eine Vielzahl von Autoantikörpern, die mit Bestandteilen der Zellkerne, einschließlich DNA, Proteinen und Ribonukleoproteine ​​1, 2 reagieren. Die HEp-2-Zelle, ein natives Protein-Array mit Hunderten von Antigenen, stellt ein ideales Substrat für die Detektion von ANA 1. Der Nachweis von ANA im menschlichen Serum ist ein wichtiger Screening-Tool für Erkrankungen des Bindegewebes, und IIF ist die Referenzmethode für ANA Testen ein. Kürzlich IIF auf HEp-2-Zellen wurde in einigen Laboratorien mit Antigen-spezifischen Immunassays und Multiplex-Verfahren ersetzt. Aus Sorge um falsch-negative Ergebnisse und der fehlenden Transparenz für Kliniker, das American College of Rheumatology bildeten eine Task Force, die dem Schluss, dass IIF mit HEp-2-Zellen sollte der &quot;Goldstandard&quot; für die ANA-Screening 1 sein. Durch die subjektive Natur der ANA-Screening, ist die Qualität der HEp-2-Zellen inintegraler, genaue und vertrauliche Meldung der Ergebnisse. Die Anwesenheit einer hohen Anzahl von mitotischen Zellen, optimale Zellmorphologie ausreichend Konfluenz und Expression der entsprechenden Antigene sind besonders wichtig. IIF Mustererkennung dient als ein wichtiges Instrument, um in der Patientendiagnose zu unterstützen. Das Verständnis der Bedeutung der verschiedenen Muster ermöglicht es, die Ärzte und Laborpersonal, um die entsprechende Follow-up-Tests durchführen, um die Diagnose zu bestätigen. Zum Beispiel können homogene ANA Muster in der Gegenwart von Anti-dsDNA-Antikörpern auftreten oder Chromatin und kann mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) 3 zugeordnet werden. Von der anderen Seite wurde kürzlich beschrieben, dass das so genannte dichte feine Fleckenmuster (DFS), die üblicherweise bis zu 12% der anfallenden Proben zu sehen ist, hat sich vor allem mit Anti-DFS70 Antikörpern assoziiert. Diese Autoantikörper, wenn sie isoliert (ohne andere krankheitsspezifische ANA) vorhanden sind, nicht mit systemischen Autoimmunrheumatischen Erkrankungen &lt;sup&gt; 9.4. Dabei Bestätigungstests für Anti-DFS70 Antikörper kann dazu beitragen, unnötige Reflextests, bieten erhebliche Kosteneinsparungen und erleichtern Patienten Angst. Da IIF ist die erste Zeile Screening Methode für Autoantikörper erkennen, ist es wichtig, dass der Anwender weiß, wie die Auswahl der Reagenzien und Gewebesubstrate können die Ergebnisse beeinflussen. Da die IIF-Technik ist von Natur aus subjektiv, ist es wichtig, dass die verwendeten Reagenzien bieten die höchste Qualität der Ergebnisse. Das Ziel dieses Video-Protokoll ist, den Benutzer mit den richtigen Schritte, um das IIF-Methode, die gemeinsamen Muster mit ANA, verknüpften Aufgaben vertraut zu machen und neue Entwicklungen, die die Arbeitsabläufe im Labor zu rationalisieren und zu standardisieren, Ergebnisse vorzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

Das American College of Rheumatology Positionspapier auf ANA-Test sieht vor, die Verwendung von IIF als Goldstandard-Methode für ANA-Screening ein. Obwohl IIF ist ein ausgezeichneter Screening-Test in erfahrenen Händen, die technischen Schwierigkeiten bei der Verarbeitung und Lese IIF gleitet - wie die arbeitsintensive Dia Verarbeitung, manuelle Lesen, die Notwendigkeit für erfahrene, geschulte Techniker und die Verwendung von dunklen Raum - machen das IIF-Methode schwierig, in den Workflow des modernen, automatisierten Labors passen. Der erste und entscheidende Schritt in Richtung hohe Qualität ANA-Screening ist eine sorgfältige Dia-Verarbeitung. Dieses Verfahren ist arbeitsintensiv und erfordert volle Verständnis des Prozesses, sowie die Liebe zum Detail und Erfahrung. Schieber Lesen wird durch Fluoreszenzmikroskopie in dunklen Räumen durchgeführt wird, und wird durch geschulte Techniker, die mit den verschiedenen Mustern vertraut sind, im Rahmen der Zellzyklus getanund die Morphologie der Interphase und teilende Zellen. Vorausgesetzt, dass IIF ist die erste Zeile Screening-Tool für SARD, das Verständnis der Schritte, um diese Technik korrekt durchzuführen, ist kritisch. Vor kurzem haben Digital-Imaging-Systemen für die automatisierte Lesen von IIF Folien entwickelt. Diese Systeme, wie dem NOVA anzeigen Automatische Fluoreszenzmikroskop, sind entworfen, um die Routine IIF Arbeitsabläufe zu optimieren. NOVA anzeigen erwirbt und speichert hochauflösende digitale Bilder von den Brunnen, damit die Bildaufnahme der Trennung von Interpretation; Bilder werden auf eine hochauflösende Computer-Monitore ausgelegt angesehen. Es speichert Bilder für die Zukunft und unterstützt Interpretation des Betreibers durch Fluoreszenzlichtintensität Daten auf die Bilder. Es ist auch vorläufig kategorisiert Ergebnisse als positiv oder negativ, und stellt Mustererkennung für die positiven Proben. Zusammenfassend, beseitigt die Notwendigkeit für die Dunkelkammer, automatisiert und rationalisiert die IIF-Bereitschaftng / Interpretation Workflow. Am wichtigsten ist, erhöht es die Konsistenz zwischen Leser und Lesungen. Darüber hinaus mit dem Einsatz von Barcode-Dias, Übertragungsfehler werden durch die Bereitstellung Probe Rückverfolgbarkeit und positive Patientenidentifikation eliminiert. Dies führt zu erhöhten Patientendatenintegrität und Sicherheit. Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die IIF Verfahren demonstrieren, einschließlich Rutsche Verarbeitung, Identifizierung gemeinsamer IIF Muster und die Einführung von neuen Entwicklungen zu vereinfachen und zu vereinheitlichen diese Technik.

Bei der Bewertung der Zellfärbung Ergebnisse für HEp-2, sind fünf großen Kernmuster am häufigsten berichteten: homogen, gesprenkelt, Zentromer, nukleolären und Kernpunkten. Diese Muster sind das Ergebnis der Autoantikörper-Bindung an spezifische Bestandteile des Kerns. Obwohl ANA-Test ist spezifisch für Kernstrukturen können cytoplasmatischen Muster mit Autoantikörpern gegen cytoplasmatische Strukturen verbunden zu beachten. In einigen Fällen können mehrere Autoantikörpern in einer Probe vorhanden sein, und das Bild kann als ein gemischtes Muster. Es gibt auch andere, weniger häufig beobachtet, und oft Zellzyklus spezifische Muster, die von der IIF Verfahren nachgewiesen werden kann; zuletzt wurde eine so genannte dichte feine Fleckenmuster mit besonderen klinischen Bedeutung in einigen ANA-positiven Seren beschrieben. Homogene Muster Um eine homogene Muster zu identifizieren, scannen Sie die gut und identifizieren mitotischen oder TrennZellen. Der kondensierte Chromatin der mitotischen Zellen (Abbildung 2, orange Pfeil) weist festen, einheitlichen Fluoreszenz, die oft stärker ausgeprägt als in der Ruhezelle nuclei.In homogenen Muster, die ruhenden Zellen zeigen einheitlich, diffuse Fluoreszenz des gesamten Zellkern (Abbildung 2, weißer Pfeil). Dieses charakteristische Muster ist häufig die Folge von anti-dsDNA-Antikörper 10. Fleckenmuster In der Grobfleckenmuster, die mitotischen Zellen zeigen keine Färbung des verkürzten Chromosomenregionen (Abbildung 3, orange Pfeil). Die ruhenden Zellen zeigen körnige Fluoreszenz über den gesamten Kern. Die Atomrauschen kann als grob oder fein definiert werden. Die Grob Sprenkeln Muster ist oft das Ergebnis von Anti-Sm-und Anti-RNP-11. Bei der Feinfleckenmuster, die ruhenden Zellen zeigen feine oder diffuse Rauschen in den Kernen, in der Regel in Uniform distribution (Abbildung 4, weißer Pfeil). Die feine Fleckenmuster ist oft das Ergebnis von Anti-Anti-SSAand SSB 12. Dichtes fein gefleckte Muster Es wird nun erkannt, dass die dichte fein gefleckte Muster (DFS) ist häufig bei Routineuntersuchungen, und so viel wie 12% der Proben positiv für anti-DFS70 Autoantikörper. Allerdings sind diese Autoantikörper, wenn sie in Isolation gefunden werden, werden nicht mit systemischen Autoimmunrheumatischen Erkrankungen 4 -6 verbunden. Diese Antikörper sind bei gesunden Personen und Patienten, die nicht mit Lagerkrankheiten SARD 6 weit verbreitet. Bestätigungstests für Anti-DFS70 Antikörper kann dazu beitragen, unnötige Reflex-Tests, ermöglichen erhebliche Kosteneinsparungen und erleichtern Patienten Angst. Da die DFS-Muster ist schwer zu identifizieren und ANA-Positivität kann Angst um Patienten und Ärzte zu verursachen, ist es sehr empfehlenswert, um ein Bestätigungstest durchführen, nachdem identifiziert<html> fying ein Muster hindeuten DFS70 Anti-Antikörper, um die klinische Bedeutung von ANA klären positivty 5,6. In diesem Muster mitotischen Zellen (Abbildung 5, orange Pfeil) zeigen positive fleckige Verfärbung des Metaphase Chromatin, während Ruhe Zellkerne (Abbildung 5, weißer Pfeil) weisen gleichmäßig verteilt feine Flecken in der gesamten Kern. Zentromer-Muster Um das Zentromer-Muster zu identifizieren, scannen die Brunnen und identifizieren mitotischen oder teilenden Zellen. In mitotischen Zellen (Abbildung 6, orange Pfeil), diese diskrete Flecken eng geworden in dem, was oft als &quot;Metaphase bar&quot; beschrieben verbunden. In der Zentromer-Muster, ruhenden Zellen (Abbildung 6, weißer Pfeil) zeigen etwa 40-60 diskrete Flecken in den Kernen verteilt. Zentromer-Muster ist das Ergebnis der anti-CENP A, B, C 13-Antikörper. Schritt &quot;&gt; Nucleolar Muster Einige nukleolären Muster werden mit einer diffusen zytoplasmatischen Färbung in mitotischen Zellen (Abbildung 7, orange Pfeil) und negativen chromosomalen Region zugeordnet sind, während andere nucleolear Muster zeigen positive Färbung der chromosomalen Region. Die nukleolären Muster mit homogener oder gesprenkelt Färbung der Kernkörperchen (Abbildung 7, weißer Pfeil) verbunden sind, zusammen mit schwachen gesprenkelt oder homogene Färbung der Kernplasma. Diese Muster werden mit anti-RNA-Polymerase-III verbunden sind, anti-Fibrillarin, anti-Th/To und anti-PM/Scl Antikörper 14,15. Nuclear-Punkt-Muster Die Kernpunktmuster mit negativen mitotischen Metaphase-Zellen (Abbildung 8, orange Pfeil) und mit wenigen diskrete Flecken in den Ruhezellkerne (Abbildung 8, weißer Pfeil) verbunden. Diese charakteristische Muster ist häufig die Folge von sp-100, PML oder p80-Autoantikörper colin. Diese Antikörper sind als<html> mit primär biliäre Zirrhose und Autoimmunhepatitis 16 sociated. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 1 Negativkontrolle (links): Die Zellen zeigen geringe unspezifische Fluoreszenz, aber keine spezifische Kernfärbung Positive Kontrolle (rechts):. Cells anzuzeigen Apfelgrün Kernfluoreszenz. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Homogene Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) zeigen feste Fluoreszenz. Ruhende Zellen zeigen auch, diffuse Färbung (whitearrow). &quot;Breite =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Grobfleckige Muster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine negative Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine deutliche Flecken gesprenkelt (weißer Pfeil). <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Feine Fleckenmuster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine negative Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine deutliche fein gefleckte Färbung (weißer Pfeil). <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Dense fein gefleckte Muster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine feinkörnige Fest Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine sehr feine, diffuse Flecken gesprenkelt (whitearrow). Abbildung 6. Zentromer-Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) zeigen einheitlich, diskrete Flecken. Ruhende Zellen (whitearrow) zeigt 40-60 diskrete Flecken pro Zellkern. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Nucleolar Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) erscheinen als große Cluster von körnigen Färbung. Ruhen Zelle nucleishows Fluoreszenz in den Kernkörperchen (whitearrow). <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. Nuclear Punktmuster. Mitotische Zellen (orangearrow) negativ erscheinen. Ruhende Zellen zeigen ein paar discrete Flecken im Nukleus (whitearrow). Zusätzlich wird die Nucelar Punktmuster mit Zytoplasma-Färbung mit Autoantikörpern gegen mitochondriale Antigene (roter Pfeil) verbunden nebeneinander existieren.

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)-Assays wurden traditionell für den Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) in Humanserum verwendet. Das Vorhandensein dieser Antikörper können bei der Diagnose von rheumatischen systemischen Autoimmunerkrankungen (SARD) unterstützen. Dieses Protokoll zeigt, wie die IIF-Technik effektiv durchzuführen, um diese Autoantikörper genau zu erfassen.

Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

133.7K Aufrufe.  INOVA Diagnostics, Inc..  Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)-Assays wurden traditionell für den Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) in Humanserum verwendet. Das Vorhandensein dieser Antikörper können bei der Diagnose von rheumatischen systemischen Autoimmunerkrankungen (SARD) unterstützen. Dieses Protokoll zeigt, wie die IIF-Technik effektiv durchzuführen, um diese Autoantikörper genau zu erfassen. 

Serie: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Forschung

Biologie

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...