Ringraziamo Cassandra Bryant per eseguire l&#39;esperimento IIF e Carol Buchner per la sua esperta revisione tecnica.

1. Preparazione del campione e del substrato di selezione <ol><li> Rimuovere i reagenti dalla confezione e lasciare ogni elemento raggiunga la temperatura ambiente. Preparare i reagenti e diluire siero del paziente secondo l&#39;inserto direzione. Nota: i vetrini NOVA Lite sono di codice a barre e possono essere facilmente integrati in sistemi automatizzati in collaborazione con il Laboratory Information sistema LIS. Questa procedura illustra trasformazione presentazione manuale; laboratori high throughput, tuttavia, possono optare per impianti di lavorazione presentazione automatica. </li></ol> 2. Aggiunta di controlli e campioni <ol><li> Dispensare 1 goccia di controllo positivo e 1 goccia di controllo negativo ai pozzetti di diapositive appropriate. Pipettare 20-25 microlitri di siero diluito del paziente nei pozzetti rimanenti. Elaborare una diapositiva alla volta. </li><li> Posizionare il vetrino (s) in un contenitore colorazione con un tovagliolo di carta umido sul fondo. Coprire il contenitore e incubare il vetrino (s) per 30 min. Nota: Le condizioni umide sarannoevitare che il substrato si asciughi. L&#39;essiccazione dei pozzi potrebbe causare colorazione artefatta. Durante questo periodo di incubazione, gli anticorpi antinucleari nel siero del paziente si legano agli antigeni delle cellule che sono fissi su ogni bene. </li><li> Dopo il periodo di incubazione, risciacquare il siero con una leggera corrente di tampone di lavaggio. Al fine di evitare danni al substrato ed evitare cross-over dei campioni tra pozzi, angolo diapositiva leggermente per evitare dirigere il flusso direttamente sui pozzetti. Toccare il tampone di lavaggio in eccesso e posizionare il vetrino in una vaschetta Coplin contenente tampone di lavaggio per circa 5 min. </li></ol> 3. Aggiunta di coniugato fluorescente <ol><li> Uno per uno, rimuovere le diapositive dalla tampone di lavaggio e picchiettare delicatamente per rimuovere l&#39;eccesso di tampone di lavaggio. Applicare 1 goccia di coniugato fluorescente (FITC marcato anti-IgG umane) su ciascun pozzetto. Incubare i vetrini per 30 minuti nel contenitore umidificata, ed essere sicuri di sostituire la colorazionecoperchio del contenitore. Nota: Per il test ANA, si consiglia l&#39;uso di un coniugato IgG specifiche Fc. Il coniugato è sensibile alla luce, e la copertura proteggerà i vetrini da esposizione alla luce oltre a mantenere l&#39;ambiente umidificato. Durante questo periodo di incubazione, il coniugato si legano agli anticorpi anti-nucleari del paziente che sono legati agli antigeni cellulari. Questo coniugato vincolante risultati in presenza di fluorescenza nei pozzetti. </li><li> Risciacquare e lavare la diapositiva come descritto sopra. </li><li> Posizionare un vetrino su un tovagliolo di carta e applicare il mezzo di montaggio in una linea continua al bordo inferiore del vetrino. </li><li> Rimuovere ogni diapositiva dal tampone di lavaggio e toccare delicatamente il vetrino per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Toccare il bordo inferiore della slitta al bordo del vetrino. </li><li> Abbassare delicatamente il vetrino sul vetrino coprioggetti in modo tale che il mezzo di montaggio sul vetrino scorre al bordo superiore del vetrino senza formazione di bolle d&#39;aria. Nota: Coverslipping, anche utilizzando la quantità ottimale di mezzo di montaggio, è una tecnica che si pratica per perfezionare. </li></ol> 4. Identificazione dei risultati positivi e negativi Interpretazione manuale <ol><li> Visualizza i vetrini con un microscopio a fluorescenza, che si trova in una stanza buia. Eseguire scansione dell&#39;intero bene con un obiettivo 20X o 25X per valutare la distribuzione e l&#39;uniformità di fluorescenza delle cellule </li><li> Passare a un obiettivo 40X per rendere l&#39;interpretazione finale per quanto riguarda la positività e modello. </li><li> Guardate i controlli positivi e negativi. Grade positività utilizzando una scala di valutazione di reattività da 1 + a 4 +. Nota: Il controllo negativo non può apparire completamente buio, ma spesso mostrano bassi livelli di fluorescenza non specifica. Il controllo positivo mostrerà mela brillante fluorescenza verde nel nucleo (Figura 1). </li></ol> Interpretazione automatizzata Nota: In additia interpretazione manuale, del carico e diapositive scansione di NOVA Visualizza Automated microscopio a fluorescenza o altro strumento di imaging digitale automatizzata; nessuna camera oscura è necessario. Dopo aver creato un progetto selezionando il tipo di presentazione del caso, lo strumento acquisisce e memorizza ad alta risoluzione immagini digitali di cellule in ogni pozzetto. Inoltre, NOVA View misura l&#39;intensità della luce fluorescente, e categorizza i risultati come positivi o negativi, e prevede il riconoscimento di forme per i campioni positivi. Le immagini vengono visualizzate dall&#39;operatore su un monitor ad alta risoluzione, consentendo interpretazione finale, la revisione e la conferma di NOVA View risultato. I report possono essere generati sui risultati confermati. Microscopia digitale deve essere usato in combinazione con un tecnico di laboratorio esperto in quanto destinato a facilitare l&#39;interpretazione dei risultati.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Gli autori Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, e Anna Eslami sono dipendenti di INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

Il termine anticorpi antinucleo (ANA) descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con costituenti dei nuclei delle cellule, tra cui DNA, proteine ​​e ribonucleoproteine ​​1, 2. La cella HEp-2, una matrice proteina nativa con centinaia di antigeni, fornisce un substrato ideale per il rilevamento di ANA 1. Il rilevamento di ANA nel siero umano è un importante strumento di screening per le malattie del tessuto connettivo, e IIF è il metodo di riferimento per il test ANA 1. Recentemente, IFI su cellule HEp-2 è stato sostituito in alcuni laboratori con i dosaggi antigene-specifiche e metodi multiplex. A causa di preoccupazioni risultati falsi negativi e la mancanza di trasparenza ai clinici, l&#39;American College of Rheumatology ha formato una task force che ha concluso che IIF utilizzando cellule HEp-2 dovrebbe essere il &quot;gold standard&quot; per ANA di screening 1. A causa della natura soggettiva dello screening ANA, la qualità delle cellule HEp-2 è integrata di riferimento corretto e sicuro dei risultati. La presenza di un elevato numero di cellule mitotiche, morfologia ottimale delle cellule, confluenza sufficiente, e l&#39;espressione di antigeni rilevanti sono particolarmente importanti. Pattern recognition IIF serve come uno strumento importante per aiutare nella diagnosi del paziente. Comprendere il significato dei vari modelli permette ai medici e personale di laboratorio per eseguire il test di follow-up adeguato per confermare la diagnosi. Ad esempio, omogeneo modello ANA può verificare in presenza di anti-dsDNA o anticorpi cromatina, e può essere associata a lupus eritematoso sistemico (SLE) 3. Dall&#39;altro lato, è stato recentemente descritto che il cosiddetto modello denso bene a chiazze (DFS) che è comunemente visto in fino al 12% dei campioni di routine, è principalmente stata associata con anticorpi anti-DFS70. Questi autoanticorpi, quando si trova in isolamento (senza altri ANA malattia-specifica) non sono associati con malattie reumatiche autoimmuni sistemiche &lt;sup&gt; 4-9. In tal modo il test di conferma per gli anticorpi anti-DFS70 può aiutare a ridurre i test reflex inutili, offrire notevoli risparmi sui costi, e facilità l&#39;ansia del paziente. Dato che IIF è il primo metodo di screening linea per rilevare autoanticorpi, è fondamentale che l&#39;utente capisce come la selezione dei reagenti e substrati tissutali possono influenzare i risultati. Poiché la tecnica IIF è intrinsecamente personale, è importante che i reagenti utilizzati forniscano risultati di ottima qualità. Questo obiettivo di questo protocollo video è quello di familiarizzare l&#39;utente con i passaggi corretti necessari per eseguire il metodo IFI, i modelli più comuni associati con ANA, e di introdurre nuovi progressi che possono semplificare il flusso di lavoro del laboratorio e standardizzare i risultati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

L&#39;American College of Rheumatology posizione dichiarazione sui test ANA prevede l&#39;uso della IIF come metodo gold standard per lo screening ANA 1. Anche se IIF è un ottimo test di screening in mani esperte, le difficoltà tecniche di lavorazione e la lettura IIF scivoli - come il lavoro di elaborazione intensiva diapositiva, lettura manuale, la necessità di esperti, tecnici qualificati e l&#39;uso di camera oscura - rendere il metodo IFI difficile da inserire nel flusso di lavoro dei laboratori moderni, automatizzati. Il primo e fondamentale passo verso lo screening ANA di alta qualità è l&#39;elaborazione di diapositive attenta. Questa procedura è laborioso, e richiede una piena comprensione del processo, così come l&#39;attenzione ai dettagli e l&#39;esperienza. Lettura diapositiva viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza in stanze buie, ed è fatto da tecnici qualificati che hanno familiarità con i vari modelli, nel contesto del ciclo cellularee la morfologia di interfase e cellule in divisione. A condizione che IIF è il primo strumento di screening online per SARD, capire i passaggi per eseguire correttamente questa tecnica è fondamentale. Recentemente, sistemi di imaging digitale sono stati sviluppati per la lettura automatica di diapositive IIF. Questi sistemi, come il NOVA Visualizza Automated fluorescente Microscopio, sono progettati per semplificare il flusso di lavoro di routine IIF. NOVA View acquisisce e memorizza ad alta risoluzione le immagini digitali dei pozzetti, separando così l&#39;acquisizione di immagini da interpretazione; le immagini vengono visualizzate una interpretazione sui monitor dei computer ad alta risoluzione. Memorizza le immagini per riferimento futuro e sostiene l&#39;interpretazione dell&#39;operatore, fornendo dati di intensità di luce fluorescente sulle immagini. Inoltre categorizza preliminarmente risultati come positivi o negativi, e prevede il riconoscimento di forme per i campioni positivi. In sintesi, si elimina la necessità di camera oscura, e automatizza e semplifica la prontezza IIFworkflow ng / interpretazione. Ancora più importante, aumenta la coerenza tra i lettori e letture. Inoltre, con l&#39;uso di diapositive barcode, errori di trascrizione sono eliminati fornendo tracciabilità campione e identificazione del paziente. Ciò si traduce in una maggiore integrità dei dati del paziente e la sicurezza. L&#39;obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare la procedura IIF, tra cui l&#39;elaborazione di diapositive, l&#39;identificazione di modelli comuni IIF, e l&#39;introduzione di nuovi progressi per semplificare e armonizzare questa tecnica.

Quando si valutano i risultati della colorazione delle cellule per Hep-2, cinque principali modelli nucleari sono più comunemente riportati: omogeneo, maculato, centromere, nucleolare, e puntini nucleari. Questi modelli sono il risultato di autoanticorpi legandosi a specifici componenti del nucleo. Anche se i test ANA è specifico per le strutture nucleari, i modelli citoplasmatici associati autoanticorpi contro strutture citoplasmatiche possono anche essere osservati. In alcuni casi, diversi autoanticorpi possono essere presenti in un campione, e l&#39;immagine può apparire come un modello misto. Ci sono altri, meno frequentemente osservata, e spesso modelli specifici del ciclo cellulare che possono essere rilevati dal metodo IFI; più di recente, il cosiddetto denso bene motivo maculato, con particolare rilevanza clinica è stata descritta in alcuni ANA sieri positivi. Omogeneo modello Per identificare un pattern omogeneo, la scansione del bene e identificare mitotica o demarcazionecellule. La cromatina condensata delle cellule mitotiche (Figura 2, freccia arancione) presenta solido, fluorescenza uniforme che è spesso più pronunciata che nella cella riposo nuclei.In il pattern omogeneo, il riposo cellule mostra uniforme, fluorescenza diffusa dell&#39;intero nucleo (Figura 2, freccia bianca). Questo modello caratteristico è spesso il risultato di anticorpi anti-dsDNA 10. Pattern maculato Nel modello chiazze grossolana, le cellule mitotiche mostrano alcuna colorazione delle regioni cromosomiche abbreviato (Figura 3, arancione freccia). Le cellule quiescenti presentano una fluorescenza granulare durante l&#39;intero nucleo. La pezzatura nucleare può essere definito come grossolano o fine. Il modello di pezzatura grossolana è spesso il risultato di anti-Sm e anti-RNP 11. Nel modello a chiazze sottili, le cellule quiescenti mostrano pezzatura fine o diffusa in tutto i nuclei, in genere in uniforme dISTRIBUZIONE (Figura 4, freccia bianca). Il modello a chiazze sottili è spesso il risultato di anti-SSAand anti-SSB 12. Dense Belle macchiato modello E &#39;ormai riconosciuto che l&#39;ammenda modello chiazze dense (DFS) è comune nei test di routine, e ben il 12% dei campioni sono positivi per autoanticorpi anti-DFS70. Tuttavia, questi autoanticorpi, quando si trovano in isolamento, non sono associati con malattie reumatiche autoimmuni sistemiche 4 -6. Questi anticorpi sono prevalenti nei soggetti e pazienti portatori di malattie non correlate al SARD 6 sani. Test di conferma per gli anticorpi anti-DFS70 può aiutare a ridurre i test reflex inutili, offrire notevoli risparmi sui costi, e facilità l&#39;ansia del paziente. Dal momento che il modello DFS è difficile da identificare e ANA positività può causare ansia sia per i pazienti e medici, si consiglia vivamente di eseguire un test di conferma dopo identi<html> fying un modello suggestivo di anticorpi anti-DFS70 per chiarire il significato clinico di ANA positivty 5,6. In questo modello, le cellule in mitosi (Figura 5, arancione freccia) mostrano positivo colorazione a chiazze della cromatina metafase, mentre riposa nuclei delle cellule (Figura 5, freccia bianca) mostrano chiazze sottili distribuiti uniformemente su tutto il nucleo. Centromere modello Per identificare il modello centromero, la scansione dei pozzi e identificare mitotico o cellule in divisione. In cellule in mitosi (Figura 6, Freccia arancione), queste chiazze discrete diventano strettamente associati in quello che viene spesso descritto come un &quot;bar metafase&quot;. Nel modello centromero, cellule quiescenti (Figura 6, freccia bianca) mostrano circa 40-60 chiazze discrete distribuiti i nuclei. Il modello centromero è il risultato di anti-CENP A, B, C anticorpi 13. passo &quot;&gt; Nucleolare Motivo Alcuni modelli nucleolari sono associati con diffusa colorazione citoplasmatica in cellule mitotiche (Figura 7, freccia arancione) e regione cromosomica negativo, mentre altri modelli nucleolear mostrano colorazione positiva della regione cromosomica. Il pattern nucleolare è associato con colorazione omogenea o chiazze dei nucleoli (Figura 7, freccia bianca), oltre a chiazze o debole colorazione omogenea del nucleoplasm. Questi modelli sono associati con l&#39;anti-RNA polimerasi III, anti-fibrillarina, anti-Th/To e anti-PM/Scl anticorpi 14,15. Nucleare modello di puntino La serie di punti nucleare è associato negativi cellule mitotiche metafase (Figura 8, arancione freccia) e con poche chiazze discrete nei nuclei cellulari riposo (Figura 8, freccia bianca). Questo modello caratteristica è spesso il risultato di sp-100, PML, o p80 Colin autoanticorpi. Questi anticorpi sono<html> spettivi con cirrosi biliare primaria ed epatite autoimmune 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figura 1 Controllo negativo (a sinistra): le cellule mostrano bassi livelli di fluorescenza non specifica, ma nessuna colorazione nucleare specifica di controllo positivo (a destra):. Cellule monitor Apple fluorescenza nucleare verde. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Modello omogeneo. Cellule mitotiche (orangearrow) mostrano fluorescenza solido. Cellule quiescenti mostrano anche, colorazione diffusa (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Grossolano maculato schema. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostrano colorazione negativa. Cellule quiescenti mostrano una macchia maculato distinto (freccia bianca). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Belle motivo maculato. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostra colorazione negativa. Cellule quiescenti mostrano una colorazione finemente maculata distinto (freccia bianca). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Dense bel modello a chiazze. Cellule mitotiche (freccia arancione) mostra una bella colorazione solido granulare. Cellule quiescenti mostrano una molto fine, diffusa macchia maculato (whitearrow). Figura 6. Modello Centromere. Cellule mitotiche (orangearrow) mostra uniforme, chiazze discrete. Cellule quiescenti (whitearrow) mostra 40-60 chiazze discrete per nucleo delle cellule. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Modello Nucleolar. Cellule mitotiche (orangearrow) appaiono come grandi cluster di colorazione granulare. Riposo cellule nucleishows fluorescenza nei nucleoli (whitearrow). <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. Dot pattern nucleare. Cellule mitotiche (orangearrow) appaiono negative. Cellule quiescenti mostrano alcuni DISCRmacchioline ete nel nucleo (whitearrow). Inoltre, il modello di puntino Nucleari possono coesistere con colorazione citoplasmatica associata ad autoanticorpi diretti contro antigeni mitocondriali (freccia rossa).

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Immunofluorescenza indiretta (IIF) saggi sono stati tradizionalmente utilizzati per il rilevamento di anticorpi antinucleo (ANA) nel siero umano. La presenza di questi anticorpi può aiutare nella diagnosi delle malattie autoimmuni sistemiche reumatiche (SARD). Questo protocollo viene illustrato come eseguire efficacemente la tecnica IIF di rilevare con precisione questi autoanticorpi.

Anti-Nuclear Antibody screening utilizzando cellule Hep-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

134.2K Views.  INOVA Diagnostics, Inc..  Immunofluorescenza indiretta (IIF) saggi sono stati tradizionalmente utilizzati per il rilevamento di anticorpi antinucleo (ANA) nel siero umano. La presenza di questi anticorpi può aiutare nella diagnosi delle malattie autoimmuni sistemiche reumatiche (SARD). Questo protocollo viene illustrato come eseguire efficacemente la tecnica IIF di rilevare con precisione questi autoanticorpi. 

Video: Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...