עבודה זו נתמכה על ידי מימון מתכנית משרד ההגנה-ערמונית חקר הסרטן (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 מהמכון הלאומי לסרטן, ורוברט McCooey המין והשתן אונקולוגיה קרן המחקר. ברצוננו להודות לד&quot;ר Annarita ורנצו (מחלקה לפתולוגיה) על מתן נוגדני VE-cadherin, וד&quot;ר מרקו Seandel (מחלקה לכירורגיה) למתן HUVECs.

1. Culturing HUVECs על Microslides לאינטראקציות התבוננות CTC-אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה, לשטוף ראשון microslide, רוחב ערוץ של 1 מ&quot;מ עם PBS. בעדינות מעיל microslide עם 200 μl של 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין (מומס בPBS) באמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה microslide עם המכסה ולשמור אותו בתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה למשך 30 דקות. מחלק איטי של הנוזל בmicroslide מונע היווצרות בועה בערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse 200 μl של (37 מעלות צלזיוס) HUVEC מדיום גידול החם (מדיה M199, 1M HEPES, 20% FBS, 5 מ&quot;ג / מיליליטר הפרין, גורם גדילת תא האנדותל 100 מיקרוגרם / מיליליטר, ו-L-גלוטמין) מעל microslide ודגירה 20 דקות ב RT. במהלך זלוף, להכין את ההשעיה תא HUVEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף HUVECs עם PBS ולהוסיף 0.05% טריפסין-EDTA במשך 1-2 דקות ב RT. צנטריפוגה HUVECs ב2 מדיום גידול מיליליטר ב 180 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז התאים באמצעות neubahemocytometer uer ולהכין 10 7 cells/100 HUVEC μl מדיום גידול. לאחר מכן, להסיר בזהירות את המדיום מהמפרצון של microslide באמצעות פיפטה קצה 200-μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא microslide לגובה עיניים ובאמצעות מזרק Luer נעילת 1 מ&quot;ל, בעדינות ינקב 200 μl ריכוז מוכן של HUVECs לתוך התעלה. זהירות נדרשת בשלב זה כדי למנוע היווצרות בועה. אם הבועות מופיעות, לשמור מרוסס לזמן מעט ארוך יותר עד שבועות להיכנס לערוץ לשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הנפח שווה (~ 80 μl) של תקשורת HUVEC בשתי הכניסה והיציאה של microslide. זה מונע את הזרימה של תאים בכל כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את השקופית ולשמור אותו בחממה (C ° 37) ל1.5 שעות. </li></ol> 2. הכנת תזרים עצרת הלשכה ללילה HUVEC התרבות בMicroslide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מזרק סטרילי 20-מיליליטר, מחברים Luer נשיים וגברי, צינורות, ומשאבת מזרק בחממה במשך 15 מיילn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נפח מת מינימאלי, השתמש בצינורות עם קוטר פנימי של 0.04 סנטימטרים. קוטר צינורות קטן יותר מונע היווצרות בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מזרק 20 מ&quot;ל עם חמה (37 מעלות צלזיוס) HUVEC תקשורת (12 מיליליטר). צרף את צינורות עם המחברים על המזרק. הסר את הבועות. חבר אסיפה זו לmicroslide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין למלא את המפרצון של microslide עם תקשורת HUVEC. להביא את מזרק 20-מיליליטר המלא מצורף למחבר ליד microslide. בעדינות לצרף את המחבר לmicroslide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את ההגדרה לתוך החממה ולחבר אותו למשאבת המזרק, שקיעה ב שיעור הגזירה μl / min 10. השאר את התאים O / N בחממה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לפרק את ההגדרה על ידי הסרת את המחבר המצורף למפרצון של microslide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לupregulate ביטוי E-selectin על ECS, להכין מדיום גידול טרי המכיל IL-1β ב10 ng / ml ב4 מיליליטר תקשורת. לשאוב את התקשורת במזרק 10 מ&quot;ל. הסר tהוא אמצעי התקשורת מהמפרצון של microslide ולחבר את המזרק לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת המזרק בשיעור הגזירה μl / min 10 עבור 4 שעות בחממה. </li></ol> תאי סרטן הערמונית 3. הכנת אנטי PSMA (J591-488) תווית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה IL-1β של HUVECs, להכין תאי PCA J591-alexa488 אנטי PSMA שכותרתו. הוספת 0.05% טריפסין-EDTA לתאי מד&quot;א דקות 1. אל תחשוף את תאי טריפסין לזמנים ארוכים יותר כפי שהוא יכול להשפיע על glycopeptides ההווה על פני התא. גם מגיב תא דיסוציאציה בחינם אנזים יכול לשמש במקום טריפסין. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה מד&quot;א במאגר H מיליליטר / H 1 (% solution/0.1 מלח מאוזן הנקס HSA/10 HEPES מ&quot;מ / 1 מ&quot;מ CaCl 2). הוסף נוגדן J591-alexa488 אנטי PSMA ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך. Resuspend התאים במהלך הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, צנטריפוגה פתרון התא בXG 800 למשך 5 דקות. ASPIשיעור וresuspend את הכדור במאגר H / H 1 מיליליטר. ספירת תאי מד&quot;א שהכותרת ולהביא את הריכוז הסופי ל1x10 6 תאים / מיליליטר. ממלאי מזרק של 5 מיליליטר עם J591-488 תאי מד&quot;א שכותרתו ולהסיר את הבועות. </li></ol> 4. הכנת אנטי PSMA (J591-488) מועשר CTCs תווית מחולי PCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 7.5 דם מיליליטר מחולים בסרטן ערמונית בצינור כחול כובע (המכיל נתרן ציטרט). בעדינות לדלל 01:01 דם ב0.1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 5.3 מיליליטר Ficoll-Paque תוספת בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. שכבת דילול דם על גבי Ficoll-Paque. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל כל הצינורות או הטיפים הבאים במגע עם CTCs עם 2% FBS/RPMI-1640 / 1 מ&quot;מ CaCl 2/4 מ&quot;מ MgCl 2 (חיץ R / S) כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של CTCs למשטחים. לשמור על טמפרטורת 4 מעלות צלזיוס של תקשורת ומאגרים הבאים במגע עם CTCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאי הדם ההיקפי mononuclear שבריר (PBMCs)המכיל CTCs מהממשק בצינור אחר 50 מ&quot;ל חרוטי המכילים חיץ R / S 30 מיליליטר. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ולשטוף שוב במאגר R / S ב XG 400 במשך 8 דקות. לאחר צנטריפוגה, resuspend את הכדור במאגר H / H. הוסף נוגדן אנטי PSMA J591-488 ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ל30 דקות ב RT במקום חשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, צנטריפוגות PBMCs מכילה J591-488 CTCs כותרת בXG 800 למשך 5 דקות. Resuspend במאגר H / H. ממלאי מזרק 1 מ&quot;ל (טרום מצופה עם חיץ R / S) עם המדגם. </li></ol> 5. הכנת מיקרוסקופ, מזרק משאבה וזרימת עצרת קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מיקרוסקופ ההפוכה ולהגדיר את תאורת קולר ב10X אובייקטיבי. להביא את משאבת המזרק באותה הרמה כמו בשלב המדגם של מיקרוסקופ ולהגדיר אותו בלחץ dyn 1/2 סנטימטר גזירה (~ 10 μl / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Zeiss AxioVision. בחר את המטרה על מסך המחשב. צור חדשתיקייה תחת אפשרות הכלים בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את אפשרות ניסויים החכמים בAxioVision ולהתאים את ההגדרות כדי להקליט קטעי וידאו שניות קצרים 30 ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וידאו ניאון חי, להגדיר את האפשרויות-12 תמונה msec החשיפה, 2 x 2 סל, 5 רווח. פרמטרים אלה מסייעים בהשגת קטעי וידאו קרוב למסגרת שיעור וידאו (~ 23 מסגרות לשנייה) עם המצלמה Zeiss MRM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הרוחב מלא של ערוץ הזרימה ב10 אובייקטיבי X על מסך המחשב, להשתמש במתאם C-Mount (0.63 ממשק xf/60 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדליק את מנורת הכספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק והמחבר המכיל את התאים על גבי משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא IL-1β מגורה HUVECs מן החממה. חבר את המחבר לערוץ כניסה המלא של microslide מכיל HUVECs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הערוץ לשקע עם המחבר המחובר לצינורות. שים את הצינור לתוך צלחת או 15 צינור חרוטי מיליליטר לאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל infusiעל דרך microslide ב10 μl / min. שים לב ליחסי הגומלין בין תאי אנדותל ותאי מד&quot;א שכותרתו או CTCs שכותרתו נגזר מחולים תחת מסנן 488 ננומטר במיקרוסקופ epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הניסוי כקטעי וידאו קצר 30 שניות. במהלך ניתוח השמעה, למדוד את המהירות מתגלגלת. מהירות רולינג נמדדה על ידי חלוקת המרחק שעובר התאים לאורך זמן. </li></ol> 6. Immunostaining של Microslide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהכניסה והיציאה של microslide לאחר מרוסס תאי מד&quot;א על ​​IL-מגורה 1β HUVECs 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה 200-μl, לשים חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל סידן ומגנזיום לתוך המפרצון של microslide למשך 5 דקות. הטה את microslide באמצעות המכסה שלה כאבזר על הספסל. שמור microslide בעמדה מוטה לכל incubations במהלך immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן HUVECs ידי מרוסס פורמלדהיד 2% חמים לתוך המפרצון </li><li&gt; דגירה של 20 דקות ב RT. יש לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת Triton-X 100 (0.1%) BSA 5% ב-PBS עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם BSA 5% ב-PBS למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם עז נוגדן ראשוני נגד VE-cadherin (1:100) ב2.5% O BSA / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. הוסף נוגדן אנטי עז 647 חמור משנית ל45 דקות. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT עם נוגדנים מצומדות אנושיים J591-alexa488 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. להוסיף DAPI למשך 5 דקות. לשטוף עם מים מזוקקים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS (או Mowiol עבור אחסון לטווח ארוך). דמיין microslide תחת מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+in+transit:+the+vascular+interactions+of+tumor+cells.">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li><li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis.">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li><li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li><li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers.">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--/rag2--+mice.">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

ד&quot;ר בנדר הוא ממציא על פטנטים המוקצים לקורנל Research Foundation (&quot;CRF&quot;) לנוגדן J591 בשימוש במאמר זה. ד&quot;ר בנדר הוא יועץ ולבעלי מניות BZL ביולוגי, החברה שבה לפטנטים שמורשים על ידי CRF למחקר ופיתוח נוספים.

בשל המספר הנמוך של CTCs בין תאי דם, קשה לבודד CTCs כאוכלוסייה טהורה של תאים. כדי לחקור אינטראקציות CTC / EC, האוכלוסייה נדירה וטמאה של CTCs מציבה שני אתגרים מרכזיים: א) זיהוי של CTCs בין תאי דם; ב) תצפית של אינטראקציות CTC / EC. <p class="jove_content" style=";tex...

גרורות היא תהליך רב שלבים מורכבים שנשאר הבינו היטב. ציר יגנד E-selectin/selectin הוכח לשחק תפקיד חשוב בגרורות סרטניים על ידי קידום אינטראקציות דבק עיקריים בין האנדותל של כלי הדם והתאים סרטניים 1,2. אנדותל (E)-selectin הוא חלבון הטרנסממברני לידי ביטוי על ידי תאי האנדותל הופעלו, ואילו ליגנד שונה E-selectin (ים) באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול 3. במבחנה גישות רבות כבר מועסקות בהצלחה למודל אינטראקציות E-selectin/selectin יגנד בין תאים סרטניים ותאי אנדותל (ECs) 1. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מערכות תא זרימה שונות להיות מועסקות כדי לדמות מערכת כלי דם בדם. בין מכלולי תא זרימה, חדר זרימת לוחות מקבילים (PPFC) בשיתוף עם ECs משמש באופן שגרתי כמבחנת מודל בהדמיה בתנאי לחץ הגזירה vivo. בזהשיטה, ECS גדלים על צלחת 35 מ&quot;מ ולאחר השיג monolayer, ECS מחוברים PPFC וניסויים מבוססי מאמץ גזירה מבוצעים. עם זאת, PPFC ומערכות שוטפות אחרות להציג מגבלות רבות לחקר אינטראקציות דבק בין תאים סרטניים במחזור (CTCs) נגזרים מחולים וECS, בעיקר, כי CTCs הוא אוכלוסייה נדירה של תאים, לשפוך מן הגידול הראשוני, במחזור בין מיליוני תאי דם (1 CTC לכל 10 9 תאי דם) 4. לפיכך, בניגוד לאספקה ​​בלתי מוגבלת של שורות תאים בתרבית, ספירת CTC נמוכה להוביל לאינטראקציות CTC / EC כמה ונדירות מאוד, הדורשת רוחב ערוץ זרימה נכון כדי להקליט את האינטראקציות לניתוח השמעה. בנוסף, מאז CTCs נגזר המטופל הוא אוכלוסייה טמאה, ולכן סמן זיהוי נדרש כדי לעקוב אחר CTCs בספציפי. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חדשה לזיהוי סרטן הערמונית (PCA) CTCs על ידי ניצול של העובדה שכמעט כל CTCs אלה מבטאים אנטיגן הספציפי לערמונית קרום (PSMA) על פני התא שלהם 5,6. בדו&quot;ח זה, השתמשנו בשורת תאי סרטן הערמונית, מד&quot;א PCa2b (מד&quot;א), כדי להדגים את התועלת הפוטנציאלית של המערכת החדשה שלנו כדי לחקור אינטראקציות CTC ערמונית עם ECS, סופו של דבר להבין את המנגנון של גרורות. המתודולוגיה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניסויי גזירה מבוססות שונים לדמות במערכת כלי דם vivo 7-9. חוץ מבחינת אינטראקציות PCA CTC / EC, מערכת תא הזרימה הנוכחית יכולה להתאים בקלות לניתוח תאי הדם היקפיים mononuclear או אינטראקציות של התאים סרטניים עם ECS. הקלות של פירוק והרכבה של תא הזרימה, microslide III (0.1) (להלן כmicroslide), מאפשרת culturing ECs תחת זלוף ומגרה ECs עם ציטוקינים שונים כדי לגרום ליחסי ציבורotein ביטוי. חוץ מזה, ECs התרבותי, יכולים להיות מצופים חלבונים רקומביננטיים כגון E-ו-P-selectin על microslide ואינטראקציות עם תאים סרטניים יכול להיות שנצפה בתנאי זרימה למינרית 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

גרורות היא תהליך שבו תאים סרטניים לשפוך ממערכת הלימפה וכלי דם גידול הראשוני intravasate דם, ובכך לקבל גישה לextravasate ויוצר נישה משני. Extravasation של תאים סרטניים ממערכת כלי דם דם ניתן ללמוד באמצעות תאי אנדותל (ECs) ותאים סרטניים המתקבלים משורות תאים שונות. מחקרים ראשוניים שנערכו באמצעות תנאי סטטי, אבל זה כבר מתועד היטב כי ECs מתנהג באופן שונה בתנאי זרימה פיסיולוגיים. לכן, מכלולי תא זרימה שונים משמשים כיום לחקר אינטראקציות של תאי סרטן עם ECS. מכלולי תא הזרימה הנוכחיים מציעים תוצאות לשחזור או באמצעות קווי תאים שונים או נוזל בתנאי לחץ גזירה שונה. עם זאת, כדי להתבונן וללמוד אינטראקציות עם תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs), שינויים מסוימים נדרשים להתבצע להרכבת תא זרימה הקונבנציונלית. CTCsהם אוכלוסיית תאים נדירה בין מיליון של תאי דם. כתוצאה מכך, קשה להשיג אוכלוסייה טהורה של CTCs. זיהום של CTCs עם סוגים שונים של תאים בדרך כלל נמצאים במחזור הדם הוא בלתי נמנע באמצעות העשרה בהווה או בטכניקות דלדול. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה ייחודית לתאים סרטניים fluorescently תווית במחזור ערמונית וללמוד האינטראקציות שלהם עם ECs במערכת תא זרימה עצמית התאספו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת נוספת לצפות אינטראקציות בין CTCs ערמונית וכל חלבון של עניין.

איור 1 מציג את תרבות O / N של monolayer של ECs על microslide. Scalings באיור 1A מראה כי של microslide 100% גלויים באמצעות אובייקטיבי 5X תוך 70% גלויים באמצעות מטרת 10X (איור 1). עבור אינטראקציות E-selectin בתיווך, תאים מתגלגלים בקצוות אינם נחשבים שהופך יותר מ -70% מmicroslide זמינים ל?...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells at JoVE

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.

בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K Views.  Weill Cornell Medical College.  הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים. 

Video: In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...