Ce travail a été soutenu par un financement du ministère de la Défense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 de l&#39;Institut national du cancer, et le Fonds de recherche Robert McCooey génito-urinaire oncologie. Nous tenons à remercier le Dr Annarita Lorenzo (Département de pathologie) pour fournir des anticorps VE-cadhérine, et le Dr Marco Seandel (département de chirurgie) pour fournir HUVEC.

1. HUVEC en culture sur microplaques pour Interactions observation CTC-endothéliales <ol><li> Sous le capot de la culture de tissus, d&#39;abord rincer la microplaque, largeur de canal de 1 mm avec du PBS. Manteau doucement la microplaque avec 200 pi de 50 pg / ml de fibronectine (dissous dans du PBS) en utilisant une seringue de 1 ml de type Luer-lock. </li><li> Couvrir la microplaque avec le couvercle et garder à l&#39;intérieur de la culture de tissus capot pendant 30 min. Distribution lente du liquide dans la microplaque empêche la formation de bulles dans le canal. </li><li> Perfuser 200 ul de (37 ° C) Agent chaud HUVEC de croissance (milieu M199, 1 M de HEPES, 20% de FBS, 5 mg / ml d&#39;héparine, 100 ug / ml de facteur de croissance des cellules endothéliales, et la L-glutamine) au-dessus de la microplaque et incuber pendant 20 min à température ambiante. Au cours de la perfusion, de préparer la suspension de cellules HUVEC. </li><li> Rincer HUVEC avec du PBS et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA pendant 1-2 min à température ambiante. Centrifugeuse HUVEC dans 2 ml de milieu de croissance à 180 xg pendant 5 min. </li><li> Mesurer la concentration des cellules en utilisant un Neubauer hémocytomètre et préparer 10 7 cellules HUVEC cellules/100 ul de milieu de croissance. Puis, enlevez délicatement le milieu de l&#39;entrée de la microplaque à l&#39;aide d&#39;une pipette 200 pl. </li><li> Apportez la microplaque au niveau des yeux et en utilisant un 1 ml luer-lock seringue, perfuser doucement 200 pi de concentration prêt de HUVEC dans le canal. La prudence est requise à cette étape pour éviter la formation de bulles. Si des bulles apparaissent, garder la perfusion pendant une durée légèrement plus longue jusqu&#39;à ce que les bulles pénètrent dans le canal de sortie. </li><li> Mettre un volume égal (~ 80 pi) de support HUVEC dans l&#39;entrée et à la sortie de la microplaque. Cela empêche le flux de cellules dans les deux sens. </li><li> Recouvrir la lame et le maintenir dans l&#39;incubateur (37 ° C) pendant 1,5 heure. </li></ol> 2. Préparation des flux Assemblée Chambre pour une nuit HUVEC Culture sur un Microslide <ol><li> Placez une seringue stérile de 20 ml, connecteurs Luer mâles et femelles, des tubes, et une pompe à seringue dans l&#39;incubateur pendant 15 kmn. </li><li> Pour le volume mort minimal, utiliser le tuyau d&#39;un diamètre intérieur de 0,04 pouces. Plus petit diamètre du tube empêche la formation de bulles. </li><li> Remplir la seringue de 20 ml au chaud (37 ° C) des cellules HUVEC médias (12 ml). Fixez le tube avec les connecteurs sur la seringue. Retirer les bulles. Connectez cette assemblée à la microplaque. </li><li> Remplir complètement l&#39;entrée de la microplaque avec les médias HUVEC. Amener le rempli de 20 ml seringue fixée au connecteur côté de la microplaque. Attacher doucement le connecteur de la microplaque. </li><li> Apportez la mise en place dans l&#39;incubateur et le connecter à la pompe seringue, fixé à 10 taux de cisaillement pi / min. Laisser les cellules O / N dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Le jour suivant, démonter la mise en place en retirant le connecteur fixé à l&#39;entrée de la microplaque. </li><li> Pour réguler positivement l&#39;expression E-sélectine sur les CE, préparer le milieu de croissance frais contenant de l&#39;IL-1β à 10 ng / ml dans 4 ml de milieu. Aspirer les médias dans une seringue de 10 ml. Retirer til médias de l&#39;entrée de la microplaque et connecter la seringue à la diapositive. </li><li> Réglez la pompe seringue à 10 pi / min vitesse de cisaillement pendant 4 heures dans l&#39;incubateur. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;anti-PSMA (J591-488) a marqué des cellules de cancer de la prostate <ol><li> Au cours de l&#39;IL-1β incubation de HUVEC, préparer anti-PSMA J591-Alexa488 a marqué des cellules APC. Ajouter 0,05% de trypsine-EDTA à des cellules MDA pendant 1 min. Ne pas exposer les cellules à la trypsine pour des temps plus longs car il peut affecter les glycopeptides présents à la surface cellulaire. Enzyme réactif de dissociation cellulaire libre peut également être utilisé à la place de la trypsine. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension cellulaire MDA culot dans 1 ml de H / H tampon (% du sel de Hanks équilibrée HSA/10 mM HEPES / 1 mM de CaCl2). Ajouter anticorps J591-Alexa488 anti-PSMA à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre. Remettre en suspension les cellules pendant l&#39;incubation. </li><li> Après 30 minutes, centrifuger la solution de cellules à 800 xg pendant 5 min. Aspitaux et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon H / H. Compter les cellules MDA étiquetés et porter la concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. Remplir une seringue de 5 ml avec J591-488 cellules MDA étiquetés et éliminer les bulles. </li></ol> 4. Préparation des anti-PSMA (J591-488) Étiqueté CTC enrichi de CaP patients <ol><li> Recueillir 7,5 ml de sang de patients atteints de cancer de la prostate dans un tube à bouchon bleu (contenant du citrate de sodium). Diluer doucement 1h01 de sang dans 0,1% de BSA / EDTA 1 mM / PBS. </li><li> Ajouter 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus dans un tube conique de 50 ml. Couche diluée sang sur le dessus du Ficoll-Paque. Centrifuger à 400 g pendant 30 min. </li><li> Pré-manteau tous les tubes ou embouts venant en contact avec les CTC avec 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM de CaCl 2/4 mM de MgCl 2 (R / S tampon) pour empêcher une liaison non spécifique des CTC aux surfaces. Maintenir 4 ° C la température des médias et des tampons à venir en contact avec les CTC. </li><li> Recueillir la cellule périphérique mononucléées du sang (PBMC) de fractionCTC contenant de l&#39;interface dans un autre tube conique de 50 ml contenant 30 ml de tampon R / S. Centrifuger à 400 g pendant 8 min. </li><li> Reprendre le culot et laver de nouveau dans un tampon R / S à 400 g pendant 8 min. Après centrifugation, remettre le culot dans un tampon H / H. Ajouter anti-PSMA J591-488 anticorps à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre. </li><li> Après 30 minutes, centrifuger les PBMC contenant J591-488 CTC marqués à 800 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans un tampon H / H. Remplir une seringue de 1 ml (pré-revêtu avec du tampon R / S) avec l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Préparation du microscope, seringue et flux Assemblée Chambre <ol><li> Allumez le microscope inversé et mettre l&#39;éclairage Kohler à 10X objectif. Apportez la pompe de la seringue au même niveau que la scène du microscope de l&#39;échantillon et le fixer à 1 dyn / cm 2 cisaillement (~ 10 pi / min). </li><li> Ouvrez le logiciel Zeiss Axiovision. Sélectionnez l&#39;objectif sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur. Créer un nouveaudossier sous l&#39;option des outils dans le logiciel. </li><li> Ouvrez l&#39;option expériences intelligentes en Axiovision et ajuster les paramètres pour enregistrer de courtes vidéos de 30 sec pour 30 min. </li><li> Pour la vidéo en direct fluorescent, définissez les options-12 images ms exposition, 2 x 2 bin 5 Gain. Ces paramètres permettent à la réalisation de vidéos à proximité de la fréquence d&#39;images vidéo (~ 23 images par seconde) avec l&#39;appareil photo Zeiss MRM. </li><li> Pour visualiser toute la largeur du canal d&#39;écoulement à 10 X objectif sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur, utilisez un adaptateur de monture C (0,63 Interface xf/60 mm). </li><li> Allumez la lampe à mercure. </li><li> Placer la seringue et le connecteur contenant les cellules sur la pompe à seringue. </li><li> Apportez IL-1β stimulée HUVECs de l&#39;incubateur. Branchez le connecteur sur le canal d&#39;entrée rempli de la microplaque contenant HUVEC. </li><li> Connecter le canal de sortie avec le connecteur fixé à la tubulure. Mettre le tube dans une boîte de 15 ml ou tube conique pour recueillir le débit à travers. </li><li> Démarrez le infusià travers la microplaque à 10 pi / min. Observer les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules MDA marqués ou étiquetés CTC provenant de patients sous filtre 488 nm sur le microscope à épifluorescence. </li><li> Commencer à enregistrer l&#39;expérience que de courtes vidéos de 30 sec. Lors de l&#39;analyse de lecture, mesurer la vitesse de roulement. La vitesse de laminage est mesurée en divisant la distance parcourue par les cellules au cours du temps. </li></ol> 6. Immunocoloration du Microslide <ol><li> Retirez le support de l&#39;entrée et la sortie de la microplaque après perfusion, les cellules MDA sur IL-1β stimulée HUVEC pendant 10 min. </li><li> En utilisant une pointe de 200 ul, mettre au chaud (37 ° C) du PBS contenant du calcium et du magnésium dans l&#39;entrée de la microplaque pendant 5 min. Inclinez la microplaque à l&#39;aide de son couvercle comme un accessoire sur le banc. Gardez la microplaque dans une position inclinée pour tous les incubations pendant immunologique. </li><li> Fixer HUVEC par perfusion chaud 2% de formaldéhyde dans l&#39;entrée </li><li&gt; incuber pendant 20 min à température ambiante. Rincer deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Ajouter triton X-100 (0,1%) dans 5% de BSA dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rincer deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Bloquer avec 5% de BSA dans du PBS pendant 30 min. </li><li> Incuber avec la chèvre d&#39;anticorps primaire anti-VE-cadhérine (1:100) dans 2,5% de BSA O / N à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter âne secondaire anti-chèvre 647 anticorps pendant 45 min. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber à température ambiante avec l&#39;anticorps humanisé conjugué J591-Alexa488 pendant 1 heure. </li><li> Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter DAPI pendant 5 min. Laver avec de l&#39;eau distillée pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter PBS (ou MOWIOL pour le stockage à long terme). Visualisez la microplaque sous le microscope confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. 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Dr Bander est l&#39;inventeur sur les brevets qui sont affectés à la Cornell Research Foundation (&quot;CRF&quot;) pour l&#39;anticorps J591 utilisé dans cet article. Dr Bander est consultant et possède des actions dans BZL biologiques, la société à laquelle les brevets ont été autorisés par le CRF pour la recherche et le développement.

En raison du faible nombre de CTC parmi les cellules sanguines, il est difficile d&#39;isoler les CTC comme une population pure de cellules. Afin d&#39;étudier les interactions CTC / CE, la population rare et impure de CTC pose deux défis majeurs: a) Identification des CTC entre les cellules du sang; b) Observation des interactions CTC / CE. Pour remédier à la première limitation d&#39;identifier les CTC de la prostate chez les cellules du sang, nous avons pr...

Métastase est un processus complexe en plusieurs étapes qui reste mal compris. L&#39;axe de ligand E-selectin/selectin a été montré pour jouer un rôle important dans la métastase de la tumeur en favorisant les interactions adhésives primaires entre l&#39;endothélium vasculaire et les cellules cancéreuses 1,2. Endothéliale (E)-sélectine est une protéine transmembranaire exprimée par les cellules endothéliales activées, tandis que les différents ligand (s) E-sélectine est exprimée par les cellules tumorales 3. De nombreuses approches in vitro ont été utilisés avec succès pour modéliser les interactions de ligands E-selectin/selectin entre les cellules tumorales et les cellules endotheliales (EC) 1. Pour étudier ces interactions, les différents systèmes de chambres d&#39;écoulement sont utilisées pour simuler le système vasculaire sanguin. Parmi les ensembles de la chambre d&#39;écoulement, la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles (FPNC), en liaison avec les EC est couramment utilisé comme modèle in vitro simulant vivo dans des conditions de contrainte de cisaillement. Dans ceProcédé, les EC sont cultivées sur une boîte de 35 mm, et après la réalisation d&#39;une monocouche, les EC sont fixés à la FPNC et expériences basées contrainte de cisaillement sont effectuées. Cependant, PPFC et autres systèmes actuels présentent de nombreuses limites à l&#39;étude des interactions adhésives entre les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients et EC, principalement parce que les CTC sont une population rare de cellules, remise de la tumeur primaire, circulant parmi des millions de cellules sanguines (1 CTC par 10 9 cellules sanguines) 4. Ainsi, contrairement à l&#39;offre illimitée de lignées cellulaires en culture, un faible nombre de CTC conduisent à très peu et rares interactions CTC / CE, nécessitant la bonne largeur de canal d&#39;écoulement d&#39;enregistrer les interactions pour l&#39;analyse de la lecture. En outre, depuis patients CTC dérivés sont une population impur, donc un marqueur d&#39;identification est nécessaire pour suivre les CTC en particulier. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle méthode pour identifier le cancer de la prostate (CaP) CTCs en profitant du fait que la quasi-totalité de ces CTC expriment l&#39;antigène de membrane spécifique de la prostate (PSMA) sur leur surface cellulaire 5,6. Dans ce rapport, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer de la prostate, MDA PCa2b (MDA), afin de démontrer l&#39;utilité potentielle de notre nouveau système à étudier la prostate interactions CCT avec les CE, finalement à comprendre le mécanisme de métastases. Notre méthodologie peut être appliquée à diverses expériences de cisaillement en fonction de simulation dans le système vasculaire in vivo 7-9. Outre l&#39;examen des interactions PCa CTC / CE, le système de chambre de passage du courant pourrait être facilement adapté pour l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique ou des interactions des cellules tumorales avec les EC. La facilité de démontage et remontage de la chambre d&#39;écoulement, une microplaque III (0,1) (ci-après dénommé microlame), permet la culture EC sous perfusion et stimulant EC avec différentes cytokines pour induire protein expression. En outre, les EC cultivées, des protéines recombinantes telles que E-et P-sélectine peuvent être revêtus sur la microplaque et les interactions avec les cellules tumorales peut être observé dans des conditions d&#39;écoulement laminaire 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

La métastase est un processus dans lequel les cellules tumorales perdent de la tumeur primaire intravasate vasculaire sanguin et du système lymphatique, de ce fait, l&#39;accès à s&#39;extravaser et former un créneau secondaire. L&#39;extravasation de cellules tumorales à partir du système vasculaire sanguin peut être étudiée en utilisant des cellules endotheliales (EC) et des cellules tumorales obtenues à partir de différentes lignées cellulaires. Les premières études ont été menées dans des conditions statiques, mais il a été bien documenté que les CE se comporter différemment dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. Par conséquent, les différents ensembles de chambre de débit sont actuellement utilisés pour l&#39;étude des interactions de cellules cancéreuses avec les EC. Ensembles de chambre de flux actuels offrent des résultats reproductibles en utilisant soit des lignées cellulaires différentes ou de fluide à différentes conditions de stress de cisaillement. Toutefois, à observer et à étudier les interactions avec les cellules rares telles que des cellules tumorales circulantes (CTC), certaines modifications doivent être apportées à l&#39;ensemble de la chambre de flux classique. CTCsont une population de cellules rares parmi des millions de cellules sanguines. Par conséquent, il est difficile d&#39;obtenir une population pure de CTC. Contamination des CTC avec différents types de cellules qui se trouvent normalement dans la circulation est inévitable en utilisant enrichissement présents ou techniques d&#39;épuisement. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode unique de cellules de cancer de la prostate par fluorescence de l&#39;étiquette de circulation et d&#39;étudier leurs interactions avec les CE dans un système de chambre de circulation auto-assemblée. Cette technique peut être en outre appliqué à observer les interactions entre les CTC de la prostate et de toute protéine d&#39;intérêt.

La figure 1 montre une culture O / N d&#39;une monocouche de EC sur la microplaque. Les battitures sur la figure 1A montre que 100% de la microplaque est visible à l&#39;aide objectif 5X tandis que 70% est visible à l&#39;aide d&#39;un objectif 10X (figure 1B). Pour les interactions à médiation par la E-sélectine, les cellules de roulement sur les bords ne sont pas considérés ce qui rend plus de 70% de la microplaque disponible pour l&#39;enregistrement vidéo et...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Notre rapport décrit une méthode unique pour visualiser et analyser les interactions CTC / CE dans le cancer de la prostate dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques.

Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K vues.  Weill Cornell Medical College.  Notre rapport décrit une méthode unique pour visualiser et analyser les interactions CTC / CE dans le cancer de la prostate dans des conditions d'écoulement physiologiques. 

Vidéo: In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Recherche

Médecine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l&#39;urine cellules dérivées

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Dans l&#39;Enrichissement vitro du cancer des ovaires cellules initiatrices de tumeurs

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...