이 작품은 부서의 방어 전립선 암 연구 프로그램 (W81XWH-12-1-0124)에서 자금에 의해 지원되었다, 국립 암 연구소, 그리고 로버트 McCooey 비뇨 생식기 종양학 연구 기금 U54CA143876. 우리는 HUVEC를 제공을위한 VE-cadherin의 항체를 제공하기 위해 박사 Annarita 로렌조 (병리학 교실)를 감사, 박사 마르코 Seandel (외과학 교실) 것이다.

관측 CTC - 내피 세포 상호 작용에 대한 Microslides 1. 배양 된 HUVEC <ol><li> 조직 문화 후드에서 첫 번째, PBS 1 ㎜의 채널 폭을하는 마이크로 린스. 부드럽게 코트 50 ㎍ / ml의 피브로넥틴 (PBS에 용해 된) 1 ㎖의 루어 로크 시린지를 사용하여 200 μL와 마이크로 슬라이드. </li><li> 뚜껑을하는 마이크로을 덮고 30 분 동안 조직 문화 후드 내부에 보관. 마이크로 슬라이드에있는 액체의 느린 분배 채널에서 거품 형성을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 성장 배지 200 μl를 Perfuse (M199 미디어, 1M HEPES, 20 % FBS, 5 ㎎ / ㎖ 헤파린, 100 ㎍ / ㎖의 내피 세포 성장 인자, 및 L-글루타민)하는 마이크로 이상과 부화 실온에서 20 분. 관류하는 동안, HUVEC 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> PBS로 된 HUVEC을 씻어 RT에서 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 5 분 180 XG에 2 ㎖ 성장 매체에 원심 분리기 된 HUVEC. </li><li> neuba를 사용하여 세포 농도를 측정UER의 혈구 및 성장 매체 μL 10 7 HUVEC의 cells/100를 준비합니다. 그런 다음 조심스럽게 200 μL 피펫 팁을 사용하는 마이크로의 입구에서 매체를 제거합니다. </li><li> 눈 높이로하는 마이크로 및 1-ML 루어 잠금 주사기를 사용 가져와 부드럽게 채널로 된 HUVEC의 준비 농도의 200 μl를 perfuse. 주의 기포 형성을 방지하기 위해이 단계에서 필요하다. 거품이 나타날 경우, 거품이 출구 채널을 입력 할 때까지 약간 긴 시간 동안 관류 유지. </li><li> 입구와하는 마이크로의 콘센트에 HUVEC 미디어의 동일한 볼륨 (~ 80 μL)을 넣습니다. 이는 어느 한 방향으로 세포의 유동을 방지한다. </li><li> 슬라이드를 커버하고 1.5 시간 동안 인큐베이터 (37 °의 C)를 유지한다. </li></ol> 하는 마이크로 밤새 HUVEC 문화 흐름 상공 회의소 총회의 2. 준비 <ol><li> 15 마일의 인큐베이터에서 멸균 20 ML 주사기, 여성과 남성 루어 커넥터, 튜브, 주사기 펌프를 배치N. </li><li> 최소한의 죽은 볼륨의 경우, 0.04 인치의 내경 튜브를 사용합니다. 작은 튜브의 직경은 거품 형성을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 미디어 (12 ㎖) 20 ㎖를 주사기를 채우십시오. 주사기에 커넥터와 튜브를 연결합니다. 거품을 제거합니다. 마이크로 슬라이드에이 어셈블리를 연결합니다. </li><li> 완전히 HUVEC 미디어와 마이크로 슬라이드의 입구를 입력합니다. 다음 마이크로 슬라이드에 커넥터에 연결된 가득 20 ML의 주사기를 가져옵니다. 부드럽게하는 마이크로에 커넥터를 연결합니다. </li><li> 인큐베이터에 셋업을 가지고 있으며 10 μL / 분의 전단 속도로 설정 주사기 펌프에 연결합니다. 37 ℃에서 인큐베이터에있는 세포 O / N를 남겨 </li><li> 다음날, 마이크로 슬라이드의 유입구에 연결된 커넥터를 제거함으로써 셋업을 분해. </li><li> 내장 컴퓨터에 E-selectin의 발현을 상향 조절하려면 4 ML 미디어 / ㎖를 겨 (10)에서 IL-1β를 포함하는 신선한 성장 매체를 준비합니다. 10 ㎖를 주사기에 미디어를 대기음. T를 제거그가하는 마이크로의 입구에서 미디어와 슬라이드에 주사기를 연결합니다. </li><li> 인큐베이터에서 4 시간 10 μL / 분의 전단 속도에서 주사기 펌프를 설정합니다. </li></ol> 3. 안티 PSMA의 준비 (J591-488) 레이블이 전립선 암 세포 <ol><li> 된 HUVEC의 IL-1β의 배양하는 동안, 안티 PSMA의 J591-alexa488 표시 PCA 세포를 준비합니다. 1 분 동안 MDA 세포에 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 이 세포 표면에 존재하는 글리코 펩타이드에 영향을 미칠 수있는 긴 시간 동안 트립신으로 세포를 노출시키지 않는다. 효소 자유로운 세포 해리 시약 대신 트립신 사용될 수있다. 5 분 200 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ㎖의 H / H 버퍼 (행크스 균형 소금 solution/0.1 % HSA/10 mM의 HEPES / 1 ㎜ 염화칼슘)에 MDA 세포 펠렛을 Resuspend. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA의 J591-alexa488 항체를 추가합니다. 배양 중에 세포를 재현 탁. </li><li> 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 세포 용액을 원심 분리기. ASPI레이트 및 1 ml의 H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 표지 MDA 세포를 세어 1 × 6 세포 / ml로 최종 농도를 가져옵니다. J591-488 라벨 MDA 세포와 5 ML의 주사기를 입력하고 거품을 제거합니다. </li></ol> 4. PCA 환자에서 안티 PSMA (J591-488) 레이블의 CTCs 풍성하게 준비 <ol><li> (구연산 나트륨을 포함하는) 파란 모자 관에서 전립선 암 환자에서 7.5 ml의 혈액을 수집합니다. 부드럽게 0.1 % BSA / 1 ㎜ EDTA / PBS에서 혈액 1:1 희석. </li><li> 5.3 ㎖의 피콜 - paque 플러스 50 ML 원뿔 튜브를 추가합니다. 레이어 피콜 - paque 위에 혈액을 희석. 30 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 프리 코트의 모든 튜브 또는 팁은 2 % FBS/RPMI-1640 / 1 ㎜ 염화칼슘 2 / 4 mM의 MgCl2를 표면에의 CTCs 비 특정 바인딩을 방지하기 위해 (R / S 버퍼)과의 CTCs과 접촉. 의 CTCs과 접촉 매체 및 버퍼의 4 ° C 온도를 유지합니다. </li><li> 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 분획을 모아서30 ml의 R / S 버퍼를 포함하는 다른 50 ml의 원추형 튜브 인터페이스에서의 CTCs 함유. 8 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 재현 탁하고 8 분 400 XG에서 R / S 버퍼에 다시 씻는다. 원심 분리 후, H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA J591-488 항체를 추가합니다. </li><li> 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 J591-488 표지의 CTCs 함유 PBMC를 원심 분리. H / H 버퍼를 Resuspend. 샘플 1 ML의 주사기 (R / S 버퍼 사전 코팅)을 입력합니다. </li></ol> 5. 현미경의 준비, 주사기 펌프 및 유량 용기 조립 <ol><li> 거꾸로 현미경을 켜고 10X 목적에 쾰러 조명을 설정합니다. 현미경의 시료 스테이지 같은 수준의 주사기 펌프를 지참 한 DYN / cm이 전단 응력 (~ 10 μL / 분)로 설정. </li><li> 혈구 AxioVision의 소프트웨어를 엽니 다. 컴퓨터 화면에 목표를 선택한다. 새로 만들기소프트웨어의 도구 옵션에서 폴더. </li><li> AxioVision의에서 스마트 실험 옵션을 열고 30 분 동안 짧은 30 초 영상을 기록하는 설정을 조정합니다. </li><li> 실시간 형광 영상의 경우, 영상 옵션-12 밀리 초 노출, 2 × 2 빈 5 게인을 설정합니다. 이러한 매개 변수는 MRM 자이스 카메라와 비디오 프레임 속도 (~ 초당 23 프레임)에 가까운 동영상을 달성하는 데 도움이됩니다. </li><li> 컴퓨터 화면에 10 X의 목적에 유동 채널의 전체 너비를 시각화 C-마운트 어댑터 (0.63 xf/60 mm 인터페이스)를 사용하십시오. </li><li> 수은 램프를 켭니다. </li><li> 주사기 펌프에 주사기와 세포를 포함하는 커넥터를 놓습니다. </li><li> 가져 IL-1β를 인큐베이터에서 H​​UVEC를 자극. 된 HUVEC을 포함하는 마이크로의 작성 유입 채널에 커넥터를 연결합니다. </li><li> 튜브에 부착 된 커넥터와 콘센트 채널을 연결합니다. 을 통해 흐름을 수집하는 접시 15 ML 원뿔 튜브에 튜브를 넣어. </li><li> infusi를 시작합니다10 μL / 분하는 마이크로를 통해서 전달됩니다. 내피 세포 및 표시 MDA 세포 또는 표면 형광 현미경에 488 나노 필터에 따라 환자에서 파생 된 레이블의 CTCs 사이의 상호 작용을 관찰한다. </li><li> 30 초 짧은 영상으로 실험을 녹음을 시작합니다. 재생 분석 중에, 압연 속도를 측정. 회전 속도는 시간이 지남에 따라 셀에 의해 이동 한 거리를 나눔으로써 측정된다. </li></ol> 하는 마이크로의 6. 면역 염색 <ol><li> 10 분 동안 IL-1β 자극 된 HUVEC에 MDA 세포를 관류 한 후하는 마이크로의 입구와 출구에서 용지를 제거합니다. </li><li> 200 ㎕의 팁을 사용하여 5 분 동안하는 마이크로의 입구에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 따뜻한 (37 ℃) PBS를 넣어. 벤치에 소품으로의 뚜껑을 사용하는 마이크로를 기울이십시오. 면역 염색 동안 모든 배양을 위해 기울어 진 위치에하는 마이크로 유지. </li><li> 입구에 따뜻한 2 % 포름 알데히드를 관류하여 HUVEC를 수정 </li><l난&gt; RT에서 20 분 동안 품어. 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS에서 5 % BSA에 트리톤-X 100 (0.1 %)를 추가합니다. </li><li> 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. 30 분 동안 PBS에서 5 % BSA로 차단합니다. </li><li> 차 항체 염소와 부화 방지 VE-cadherin의 (1:100)를 2.5 % BSA의 O / N로 4 ℃에서 </li><li> 다음 날, 5 분마다 PBS로 두 번 세척한다. 45 분 동안 차 당나귀 방지 염소 647 항체를 추가합니다. 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 인간 답게 J591-alexa488 복합 항체로 실온에서 품어. </li><li> 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분 DAPI를 추가합니다. 5 분 동안 증류수로 세척 할 것. </li><li> PBS를 추가 (또는 장기 저장을 위해 MOWIOL). 공 초점 현미경으로하는 마이크로 시각화. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--/rag2--+mice.">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

박사 Bander도이 문서에서 사용되는 J591 항체에 대한 코넬 연구 재단 ( &quot;CRF&quot;)에 할당 된 특허의 발명자이다. 박사 Bander도 컨설턴트와 BZL 생물 의약품의 특허가 추가 연구 및 개발을위한 CRF에 의해 허가 된 것으로 회사의 주식을 소유하고 있습니다.

인해 혈액 세포들 사이의 CTCs 낮은 숫자로, 그것은 세포의 순수로의 CTCs 모집단을 분리하는 것이 곤란하다. CTC / EC의 상호 작용을 연구하기 위해,의 CTCs 희귀하고 불순한 인구는 두 가지 주요 도전 포즈 : 혈액 세포들 사이의 CTCs) 확인을; B) CTC / EC의 상호 작용을 관찰. 혈액 세포들 전립선의 CTCs 식별 첫번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 사실상 모든 전립?...

전이가 제대로 이해 남아있는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. E-selectin/selectin 리간드 축은 혈관 내피 세포와 암세포 간의 1,2 차 접착제 상호 작용을 촉진함으로써 종양 전이에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 다른 E-셀렉틴 리간드 (들) 종양 세포 (3)에 의해 표현되는 반면 내피 (E)-셀렉틴은 활성화 된 내피 세포에 의해 발현 막 횡단 단백질이다. 다수의 체외 방법이 성공적으로 종양 세포와 내피 세포 사이의 E-selectin/selectin 리간드 상호 작용되는 EC (1) 모델로 사용되어왔다. 이러한 상호 작용을 연구하기 위해, 다른 흐름 챔버 시스템은 혈액 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 사용하고있다. 유량 용기 어셈블리 중, 내피와 함께 병렬 플레이트 흐름 챔버 (PPFC)는 정기적으로 생체 전단 응력 조건에서 시뮬레이션 체외 모델로 사용됩니다. 이에방법, 내피는 35 mm 접시에 성장하고 단일 층을 달성 한 후, 내피는 PPFC에 부착하고 전단 응력을 기준으로 실험이 수행된다. 그러나 PPFC과 다른 현재의 시스템은 환자와 내피에서 파생 된 종양 세포 (의 CTCs)를 순환 사이의 접착제의 상호 작용을 연구하는 많은 제약을 제시 주로의 CTCs는 혈액 세포의 수백만의 사이에 순환, 기본 종양에서 흘려 세포의 희소 한 인구 때문에 (1 CTC 9 혈구 열마다) 4. 따라서, 배양 세포 라인의 무제한 공급과 달리 낮은 CTC 수는 재생 분석을위한 상호 작용을 기록하는 적절한 흐름의 채널 폭을 필요로하는, 매우 적은 희귀 CTC / EC의 상호 작용을지도한다. 환자 유래의 CTCs가 불순한 인구 때문에 또한, 따라서 식별 마커는 특정의 CTCs를 추적해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 (PCA) CT 전립선 암을 확인하는 새로운 방법을 개발CS 거의 모든 이들의 CTCs가 자신의 세포 표면 5,6에 전립선 특이 막 항원 (PSMA)을 표현한다는 사실을 활용하여. 이 보고서에서, 우리는 결국 전이의 메커니즘을 이해하기 위해, 내피로 전립선 CTC 상호 작용을 연구하기위한 새로운 시스템의 잠재적 인 유틸리티를 보여, 전립선 암 세포주 MDA PCa2b (MDA)를 사용했다. 우리의 방법은 생체 내 혈관 시스템 7-9에서 시뮬레이션 각종 전단을 기준으로 실험에 적용 할 수 있습니다. PCA CTC / EC 상호 작용을 조사 외에, 전류 흐름 챔버 시스템은 쉽게 말초 혈액 단핵 세포를 분석하거나 내피와 종양 세포의 상호 작용을 위해 구성 될 수있다. 분해 및 유량 용기의 재 조립의 용이성,하는 마이크로는 III (0.1) (이하 마이크로 슬라이드로 함), 관류 및 홍보를 유도하는 다른 사이토 카인과 내피를 자극에서 배양되는 EC 수 있습니다식을 otein. 또한, 배양 된 내피 같은 E-셀렉틴 및 P-재조합 단백질은 종양 세포와 상호 작용하는 마이크로 슬라이드 상에 코팅 할 수는 층류 조건 (10)으로 관찰 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

전이는 종양 세포가 차 틈새 시장을 extravasate 및 양식에 대한 액세스를 확보함으로써, 기본 종양 intravasate 혈액 혈관과 림프 시스템에서 창고하는 과정이다. 혈액 혈관 시스템에서 종양 세포의 혈관 외 유출은 다양한 세포주에서 얻은 내피 세포 (EC에) 및 종양 세포를 이용하여 연구 될 수있다. 초기 연구는 정적 조건을 사용하여 실시되었다하지만 그것은 잘되는 EC 생리 흐름 조건에서 다르게 행동하는 것이 설명되어 있습니다. 따라서, 다른 유동 챔버 조립체는 현재의 EC와 암세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고있다. 현재 유량 용기 어셈블리는 다른 전단 응력 조건에서 서로 다른 세포주 또는 유체를 사용하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, 관찰하고 종양 세포 (의 CTCs)를 순환하는 희귀 세포와의 상호 작용을 연구하기 위해, 특정 변경 내용은 기존의 유량 용기의 조립을 할 필요합니다. 의 CTCs혈액 세포의 수백만 사이 희소 세포 집단이다. 결과적으로,의 CTCs 순수 인구를 얻기 어렵다. 정상적으로 순환에서 발견 세포의 다른 유형의 CTCs 오염은 본 농축 또는 공핍 기술을 사용 불가피하다. 본 보고서에서, 우리는 형광 라벨 순환하는 전립선 암 세포에 고유 한 방법을 설명하고 자기 조립 흐름 챔버 시스템에서의 EC와의 상호 작용을 연구한다. 이 기술은 또한 전립선의 CTCs 및 또한 어떤 단백질 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 적용될 수있다.

그림 1은 마이크로 슬라이드에 내장 컴퓨터의 단일 층의 O / N 문화를 보여줍니다. 그림 1A에 스케일링은하는 마이크로의 100 %는 70 %가 10 배 목표 (그림 1B)를 사용하여 표시되는 동안 5 배 목표를 사용하여 볼 수 있음을 보여줍니다. E-셀렉틴 매개되는 상호 작용의 경우, 가장자리에서 롤링 균체 영상 기록 재생 분석을위한 마이크로 슬라이드의 70 % 이상이 가능?...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.

환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K 조회수.  Weill Cornell Medical College.  우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다. 

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...