この作品は、米国国立がん研究所から国防総省前立腺癌研究プログラム（W81XWH-12-1から0124）の、U54CA143876、ロバートMcCooey泌尿生殖器がん研究基金からの資金によってサポートされていました。私たちは、HUVECをを提供するためのVE-カドヘリン抗体を提供し、博士マルコSeandel（外科）博士Annaritaロレンツォ（病理部）に感謝したいと思います。

観測CTC - 内皮相互作用のためのマイクロスライド上の1。培養のHUVEC <ol><li>組織培養フードの下では、まず、PBSで1mmのチャネル幅をマイクロスライドをすすぐ。優しくコート1ミリリットルルアーロック注射器を用いて50μg/ mlのフィブロネクチン（PBSに溶解）200μlのマイクロスライド。 </li><li>蓋付きのマイクロスライドをカバーし、30分間組織培養フードの中に保管してください。マイクロスライド内の液体の遅い分注は、チャネル内の気泡の形成を防ぐことができます。 </li><li>マイクロスライド上に温かい（37°C）HUVEC増殖培地200μl（M199培地、1M HEPES、20％FBS、5 mg / mlのヘパリン、100μg/ mlの内皮細胞成長因子、及びL-グルタミン）を灌流し、インキュベートRTで20分。灌流中、HUVEC細胞懸濁液を調製。 </li><li> PBSでのHUVECをすすぎ、室温で1〜2分間、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5分間180×gでの2mlの増殖培地中でHUVECを遠心分離機。 </li><li> neubaを用いて細胞濃度を測定UERの血球計数器および増殖培地μL10 7のHUVEC cells/100を準備します。その後、慎重に200μlのピペットチップを用いてマイクロスライドの入口からメディアを取り出します。 </li><li>目の高さにマイクロスライドを持参し、1 mlのルアーロック注射器を用いて、そっとチャンネルにHUVECの準備濃度の200μLを灌流。注意気泡形成を防ぐために、この段階で必要とされる。気泡が表示された場合、気泡が出口チャネルを入力するまで、わずかにより長い時間灌流キープ。 </li><li>マイクロスライドの入口と出口の両方でのHUVECメディア、等量の（〜80μl）を置く。これは、いずれかの方向における細胞の流れを防止する。 </li><li>スライドをカバーし、1.5時間、インキュベーター（37℃）に保管してください。 </li></ol>ミクロスライド上で一晩HUVEC文化のためのフロー商工総会の2。準備<ol><li> 15マイルのためのインキュベーター内の滅菌20 mlの注射器、メスとオスルアーコネクタ、チューブ、シリンジポンプを配置N。 </li><li>最小限のデッドボリュームの場合は、0.04インチの内径のチューブを使用しています。より小さなチューブ径が気泡形成を防止する。 </li><li>温かい（37℃）、HUVEC培地（12ml）で20 mlの注射器を埋める。注射器の上にコネクタを備えたチューブを取り付けます。気泡を除去する。マイクロスライドにこのアセンブリを接続します。 </li><li>完全HUVEC培地でマイクロスライドの入口を埋める。マイクロスライドの横のコネクタに接続され満たされた20 mlの注射器を持参してください。静かにマイクロスライドにコネクタを取り付けます。 </li><li>インキュベーターにセットアップを持参し、10μL/分のせん断速度に設定したシリンジポンプに接続します。 37℃のインキュベーター内で細胞のO / Nを残す</li><li>次の日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタを削除することで、セットアップを分解します。 </li><li> ECの上、E-セレクチンの発現を上方制御するために、4ミリリットルのメディアが10 ng / mlの時に、IL-1βを含む新鮮な増殖培地を準備します。 10 mlの注射器でメディアを吸引除去する。 Tを削除彼マイクロスライドの入口からメディアやスライドにシリンジを接続します。 </li><li>インキュベーター内で4時間10μL/分の剪断速度でシリンジポンプを設定します。 </li></ol> 3。抗PSMAの調製（J591-488）ラベル前立腺癌細胞<ol><li> HUVECのIL-1βのインキュベーションの間、抗PSMA J591-をAlexa488ラベルのPCa細胞を調製。 1分間MDA細胞を0.05％トリプシン-EDTAを追加します。それが細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与えることができるように長い時間のために、トリプシンに細胞を放置しないでください。酵素を含まない細胞解離試薬はまた、代わりに、トリプシンを使用することができる。 5分間200×gで遠心分離する。 </li><li> 1ミリリットルのH / Hバッファー（ハンクスsolution/0.1％HSA/10のHEPES / 1のCaCl 2）でのMDA細胞ペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-のAlexa488抗体を追加します。インキュベーション中に細胞を再懸濁。 </li><li> 30分後、5分間800×gで細胞溶液を遠心する。 ASPIレートと1ミリリットルのH / Hバッファにペレットを再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度をもたらす。 J591-488ラベルされたMDA細胞を5 mLの注射器を記入し、気泡を除去。 </li></ol> PCaの患者から4。抗PSMAの調製（J591-488）ラベルのCTCエンリッチ<ol><li> （クエン酸ナトリウムを含有する）は青キャップチューブに前立腺癌患者から7.5ミリリットルの血液を収集する。穏やかに0.1％BSA / 1 mMのEDTA / PBS中の血液1:1に希釈する。 </li><li> 5.3ミリリットルフィコール·パックプラス50mlのコニカルチューブに追加します。層は、フィコール·パックの上に血を希釈した。 30分間400×gで遠心分離する。 </li><li>プレコート全てのチューブまたは先端が2％FBS/RPMI-1640 / 1mMのCaCl 2/4のMgCl 2表面へのCTCの非特異的結合を防ぐために、（R / S緩衝液）を用いたCTCと接触する。 CTCのと接触メディアとバッファの4℃の温度を維持する。 </li><li>末梢血単核細胞（PBMC）を画分を集め30ミリリットルのR / Sバッファを含む別の50 mlのコニカルチューブ内のインタフェースからのCTCを含む。 8分間400×gで遠心分離する。 </li><li>ペレットを再懸濁し、8分間、400×gでR / S緩衝液中で再度洗浄する。遠心分離した後、H / Hバッファーでペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-488抗体を追加します。 </li><li> 30分後、J591-488を含む遠心PBMCを、5分間、800×gでのCTCを標識した。 H / Hのバッファに再懸濁。試料と（R / S緩衝液で予めコーティング）1mlシリンジを充填する。 </li></ol> 5。顕微鏡の準備、シリンジポンプおよびフロー商工総会<ol><li>倒立顕微鏡の電源をオンにして、10倍の対物レンズでケーラー照明を設定します。顕微鏡の試料ステージと同じレベルで、シリンジポンプを持参し、1ダイン/ cm 2のせん断応力（〜10μL/分）で設定してください。 </li><li>ツァイスAxioVisionのソフトウェアを起動します。コンピュータ画面上の目的を選択します。新規作成ソフトウェアの[ツール]オプションの下にあるフォルダ。 </li><li> AxioVisionのスマート実験オプションを開いて、30分間の短い30秒のビデオを記録するために設定を調整します。 </li><li>ライブの蛍光ビデオ、画像オプション-12秒露出、2×2ビン、5ゲインを設定します。これらのパラメータは、ツァイスMRMカメラでビデオのフレームレート（毎秒約23フレーム）に近いビデオを達成するの​​に役立ちます。 </li><li>コンピュータの画面に10のX目的で流路の幅全体を可視化するために、Cマウントアダプター（0.63 xf/60 mmインタフェース）を使用します。 </li><li>水銀ランプのスイッチをオンにします。 </li><li>シリンジとシリンジポンプ上に細胞を含むコネクタを配置します。 </li><li> IL-1βは、インキュベーターからのHUVECを刺激させる。 HUVECをを含むマイクロスライドの塗りつぶされた入口チャネルへのコネクタを接続します。 </li><li>チューブに取り付けられたコネクタと出口チャネルを接続します。フロースルーを収集するために皿または15ミリリットルコニカルチューブにチューブを入れる。 </li><li> infusiを開始10μL/分でマイクロスライドを通して上。内皮細胞間の相互作用を観察し、MDA細胞またはエピ蛍光顕微鏡で488 nmのフィルタの下に患者に由来するラベルのCTCのラベル。 </li><li> 30秒の短いビデオなどの実験の記録を開始。再生分析中に、ローリング速度を測定。圧延速度は、経時的に細胞が移動した距離を割ることによって測定される。 </li></ol>ミクロスライドの6。免疫染色<ol><li> 10分間、IL-1βで刺激したHUVECにMDA細胞を灌流した後にマイクロスライドの入口と出口からメディアを取り出します。 </li><li> （37°C）をPBSで5分間、マイクロスライドの入口にカルシウム及びマグネシウムを含有する200μlのチップを用いて、暖かい置く。ベンチで小道具としての蓋を使用してマイクロスライドを傾けます。免疫染色時に全てのインキュベーションのために傾いた位置にマイクロスライドを保管してください。 </li><li>入口に暖かい、2％ホルムアルデヒドを灌流によってHUVECをを修正しました。 </li><l私は&gt;室温で20分間インキュベートする。 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 </li><li> RTで10分間PBS中5％BSAにトリトンX-100（0.1％）を添加する。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 30分間、PBS中の5％BSAでブロックする。 </li><li>一次抗体ヤギ4℃で2.5％のBSA、O / Nでの抗VE-カドヘリン（1:100）でインキュベート</li><li>次の日、5分間ずつPBSで2回洗浄します。 45分間二次ロバ抗ヤギ抗体647を追加します。 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 </li><li> 1時間ヒトJ591-のAlexa488結合抗体で、室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 5分間、DAPIを追加します。 5分間蒸留水で洗ってください。 </li><li> PBSを追加する（または長期保存のためのMowiol）。共焦点顕微鏡下でマイクロスライドを可視化する。 </li></ol>

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	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. 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A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis.">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li><li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. 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Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

博士バンダーは、この記事で使用したJ591抗体のためにコーネル研究財団（「CRF」）に割り当てられている特許に関する発明である。博士バンダーはコンサルタントであるMLN-2704の特許は、さらなる研究と開発のためのCRFによってライセンスされていると、会社の株式を所有しています。

による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。 血液細胞のう ​​ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我?...

転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞3で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） は1〜E-selectin/selectinリガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。 しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 9血液細胞あたり1 CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。 私たちの方法論は、生体内血管系7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライドIII（0.1）は 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態10で観察することができる。

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer adapter</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer adapter</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Mitogen</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td><td></td><td>provided by Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x objective</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzyme free cell dissociation reagent</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。

図1に、マイクロスライド上のECの単分子層のO / N培養を示しています。 図1Aにスケーリングはマイクロスライドの100％が70％の10倍の対物レンズ（ 図1B）を使用して表示されている間に5 ​​倍の対物レンズを使用して表示されていることを示しています。 E-セレクチン介在性相互作用のため、エッジにローリング細胞は録画と再生の分析のためのマイク?...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K ビュー.  Weill Cornell Medical College. 我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。 

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A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

がん研究

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

生物工学

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone and inflamed tissues.  E-selectin expression is constitutive on dermal and bone microvessels and is inducible by pro-inflammatory cytokines, such as IL-1&#945;/  and TNF-&#945;, on microvessels in inflamed tissues.  This lectin receptor mediates weak binding interactions with carbohydrate counter-receptor ligands on circulating leukocytes, which results in a characteristic  rolling  behavior.  Because these interactions precede more stable adhesive events and diapedesis activity, characterization of leukocyte rolling activity and identification of leukocyte E-selectin ligands have been major goals in studies of leukocyte trafficking and inflammation and in the development of anti-inflammatory therapeutics (1-5).  The intent of this report is to provide a visual, comprehensive description of the most widely-used technology for studying E-selectin   E-selectin ligand interactions under physiologic blood flow conditions.  Our laboratory in conjunction with the Harvard Skin Disease Research Center uses a state-of-the-art parallel-plate flow chamber apparatus accompanied by digital visualization and new recording software, NIS-Elements.  This technology allows us to analyze adhesion events in real time for onscreen visualization as well as record rolling activity in a video format.  Cell adhesion parameters, such as rolling frequency, shear resistance and binding/tethering efficiency, are calculated with NIS-Elements software, exported to an Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.  In the demonstration presented here, we employed the parallel-plate flow chamber to investigate E-selectin-dependent leukocyte rolling activity on live human bone marrow endothelial cells (hBMEC).  Human hematopoietic progenitor KG1a cells, which express a high level of E-selectin ligand, were used as our leukocyte model, while an immortalized hBMEC cell line, HBMEC-60 cells, was used as our endothelial cell model (6).  To induce and simulate native E-selectin expression in the flow chamber, HBMEC-60 cells were first activated with IL-1 .  Our video presentation showed that parallel-plate flow analysis is a suitable method for studying physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling activities and that functional characterization of leukocyte E-selectin ligand(s) in the flow chamber can be ascertained by implementing protease or glycosidase digestions.

This report provides a visual depiction of parallel-plate flow chamber analysis for studying leukocyte endothelial interactions under physiologic shear stress. This method is particularly useful for investigating the role of endothelial (E)-selectin and leukocyte E-selectin ligands that trigger leukocyte rolling on endothelial cell surfaces.

微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

生物学

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

免疫・感染学

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

医学

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

要約

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