تقدم أسماك الزرد نموذجا قيما للتجديد العصبي بسبب قدرتها على التعافي من إصابة الحبل الشوكي. تصف هذه الطريقة القدرة على التحمل والسباحة وسلوك السباحة كقراءات لإصلاح الحبل الشوكي الوظيفي. توفر هذه التقنية تقييما موثوقا به وقابلا للقياس الكمي لقدرة السباحة على التحمل وسلوك السباحة في أسماك الزرد البالغة.
هذه الطرق قابلة للتطبيق بنفس القدر على دراسات التطور العصبي العضلي والعضلي الهيكلي والمرض والتجديد. لتقييم القدرة على التحمل في السباحة، افتح برنامج التحكم في سرعة التدفق. انقر على المربع المسمى التجربة وقم بإلغاء تحديد Uswim و Uwater.
ثم قم بتغيير سرعة التدفق في مربع Uwater في أسفل اليسار لضبط سرعات تيار الماء. لبدء بروتوكول تلقائي ، انقر فوق المربع بدء التسجيل. في نافذة الحوار التي تفتح، اختر تلقائي من القائمة المنسدلة.
لفتح ملف بروتوكول تم حفظه مسبقا، انقر فوق رمز الملف بجوار ملف البروتوكول. بعد ذلك ، قم بإعداد ملف الإخراج بالنقر فوق رمز الملف بجوار ملف السجل. في نافذة مستكشف الملفات التي تفتح ، قم بتسمية ملف الإخراج وحفظه في الموقع المطلوب.
بعد ذلك، قم بإعداد نافذة مؤقت دورة مقسمة لضمان الوصول المتزامن إلى برنامج التحكم في سرعة التدفق ونوافذ المؤقت على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، قم بإنشاء خزان لجمع الأسماك لإيواء الأسماك المنهكة بعد إزالتها من نفق السباحة. املأ خزان التجميع وأنبوب كلوريد البولي فينيل الطويل بماء نظام الزرد.
ضع أحد طرفي الأنبوب المعبأ مسبقا في خزان التجميع وآخر في الخزان العازل ، مما يضمن تدفق المياه بحرية من الخزان العازل إلى خزان التجميع. قم بتثبيت الطرف العلوي من الأنبوب بمشبك موثق لمنع تدفق المياه ، واستخدم مشبك الموثق للتحكم في تدفق المياه حسب الحاجة. أغلق نفق السباحة بغطاء تحمل السباحة قبل وضع مجموعة واحدة من الأسماك داخل نفق السباحة.
للتأقلم مع الأسماك مع نفق السباحة واتجاه التدفق ، ابدأ مؤقت اللفة المقسم واضبط السرعة الحالية على صفر سنتيمتر في الثانية للدقائق الخمس الأولى ، وتسعة سنتيمترات في الثانية للدقائق الخمس التالية ، و 10 سنتيمترات في الثانية للدقائق الخمس التالية. بعد التأقلم ، افتح البروتوكول وابدأ برنامج التحكم الآلي في سرعة التدفق ، والذي سيزيد من سرعة تيار الماء بمقدار سنتيمترين في الثانية كل دقيقة. مراقبة الأسماك للإرهاق.
سيتم دفع الأسماك المنهكة نحو الطرف الخلفي من نفق السباحة. لضمان استنفاد السمكة ، انقر برفق على الطرف الخلفي من النفق أو قم بإنشاء ظل فوق تلك المنطقة لتحفيز الأسماك على السباحة. لم تستجب الأسماك المنهكة للحافز المذهل واستلقيت على الأرض في الطرف الخلفي من النفق.
عندما يتم استنفاد السمكة ، قم بفك أنبوب جمع الأسماك. افتح نافذة نفق السباحة واجمع الأسماك في خزان التجميع. سجل الوقت عند الإرهاق باستخدام مؤقت اللفة المقسمة.
بعد استنفاد جميع الأسماك وجمعها في خزان التجميع ، انقر فوق الزر "إيقاف الطوارئ" في برنامج التحكم في سرعة التدفق وأوقف المؤقت. لالتقاط أفلام لفحص سلوك السباحة، ضع مجموعة من الأسماك في نفق السباحة وأغلق النفق باستخدام غطاء قياسي مغلق بالكامل. ثم افتح نافذة تسجيل جديدة وقم بتسمية الملف.
لا تنقر فوق تسجيل بعد. قبل البدء في تجربة جديدة ، ضع منشفة ورقية أو قطعة قماش على جانب نفق السباحة للتأكد من أن جميع السلوكيات ناتجة عن سباحة الأسماك ، وليس بسبب استجابة مذهلة ناجمة عن الحركة في البيئة. بعد التأكد من أن الماء هادئ ولا توجد تموجات تتحرك عبر الإطار ، انقر فوق تسجيل في نافذة برنامج الكاميرا لبدء تسجيل ملف الفيلم.
ثم انقر فوق ابدأ في برنامج التحكم في سرعة التدفق لبدء البروتوكول ، والذي سيستمر دون انقطاع. شاهد الفيلم للتأكد من عدم إسقاط أي إطارات ، وعدم وجود فقاعات في مجال الرؤية ، وتسجيل جميع الأسماك. بمجرد اكتمال تسجيل الفيلم ، انقر فوق إيقاف الطوارئ لإنهاء بروتوكول التحكم في سرعة التدفق والتحقق من حفظ ملف إخراج البيانات تلقائيا.
ثم أغلق نافذة التسجيل لحفظ ملف الفيلم. بعد التسجيل ، قم بإزالة الغطاء. استرجع الأسماك بعناية وأعادها إلى خزانها.
لتحليل الأفلام التي تم التقاطها، افتح tracking_v2. ijm البرنامج النصي في فيجي وانقر على تشغيل لبدء البرنامج. في النافذة المنبثقة ، اختر المجلد الذي يحتوي على أفلام سلوك السباحة لتتبعها وانقر فوق فتح.
ابحث عن إطار واحد من أول فيلم ، مربع حوار ، ومنطقة الاهتمام ، أو مدير عائد الاستثمار ، الذي سيظهر. اتبع الإرشادات الواردة في مربع الحوار وقم بإنشاء عائد استثمار في أسفل غرفة نفق السباحة. ثم انقر فوق موافق وتأكد من عدم رؤية أي زوايا سوداء.
سيتم فتح نافذة العتبة جنبا إلى جنب مع إطار عتبة تم تحريره. قم بتغيير نظام الألوان من الأسود والأبيض إلى الأحمر واضبط القيمة القصوى حتى يظهر الإطار الأول الأسماك باللون الأحمر فقط ولا شيء آخر. سجل العتبة وانقر فوق موافق في مربع الحوار.
لمحاذاة الإحصاءات الوصفية وتجميعها والحصول عليها، افتح SwimBehavior_v7-3. R البرنامج النصي في RStudio وانقر على المصدر في الزاوية العلوية اليمنى من قسم البرنامج النصي. في نافذة جديدة تفتح، اختر المجلد الذي يحتوي على _raw.
ملفات csv التي تم إنشاؤها بواسطة فيجي وانقر فوق فتح. سيتم تشغيل البرنامج تلقائيا. في مربع الحوار المنبثق، تأكد من عدد الأسماك في كل فيلم.
انقر فوق نعم إذا كانت الأرقام المعطاة صحيحة أو لا إذا كانت الأرقام غير صحيحة. بمجرد محاذاة الملفات، تحقق من وجود _aligned تم إنشاؤه حديثا. ملف csv.
بعد التأكد من أن البرنامج يجمع بين البيانات ويقوم بتشغيل الإحصائيات ورسم الرسوم البيانية للمخرجات ، تحقق من ملفات التحليل التي تم إنشاؤها في مجلد جديد يسمى النتائج داخل المجلد الأصل الذي يحتوي على _raw. CSV و _aligned. ملفات csv.
أظهر التحمل على السباحة الذي تم تقييمه في أسبوعين وأربعة وستة أسابيع بعد الإصابة فقدان 60٪ من قدرة التحمل على السباحة في أسبوعين. استعادت الأسماك المتجددة تدريجيا القدرة على التحمل في السباحة في أربعة وستة أسابيع بعد الإصابة. في فحص سلوك السباحة ، تسبح عناصر التحكم بثبات في الجزء الأمامي من غرفة نفق السباحة المقابلة لموضع Y المرتفع.
في المقابل، في غضون أسبوعين بعد الإصابة، لم تتمكن الأسماك المصابة من الحفاظ على قدرة ثابتة على السباحة ضد التيار. وبالتالي ، فإن مسارات السباحة الخاصة بهم غير منتظمة أكثر ، مع انخفاض عام في وضع Y. زاد وضع Y في أربعة وستة أسابيع بعد الإصابة ، مما يشير إلى أن الحيوانات المتجددة استعادت تدريجيا قدرتها على السباحة.
علاوة على ذلك، بالنسبة إلى الضوابط غير المصابة، كانت الحيوانات المصابة في أسبوعين بعد الإصابة أقل نشاطا بشكل ملحوظ، وتوقفت في الربع الخلفي من نفق السباحة، وفقدت قدرتها على السباحة ضد سرعات التيار المنخفض. تمشيا مع قدرتها الفطرية على تحقيق الانتعاش الوظيفي ، قامت الحيوانات المصابة تدريجيا بتطبيع معلمات سلوك السباحة في أربعة وستة أسابيع بعد الإصابة. استخدام برنامج التحكم في سرعة التدفق في هذا البروتوكول اختياري.
البديل هو التحكم يدويا في محرك تيار الماء. يمكن استخدام الفحوصات الموصوفة في هذه الدراسة للفحص المسبق للأنماط الظاهرية العصبية أو العضلية أو الهيكلية. يمكن بعد ذلك حصاد الأنسجة ذات الأهمية للفحص النسيجي أو الجزيئي.
استخدم مختبرنا وغيره هذا البروتوكول لتحديد الجينات المطلوبة لإصلاح الأعصاب الفطرية والعوامل الكافية لتعزيز التجديد العصبي.
