هذا البروتوكول يمكن الباحث من رصد نشاط واستجابة الخلايا العصبية الحسية واحدة لتحفيز تسيطر عليها في فقرات سليمة تتصرف. هذا التصحيح الكهربية هو وسيلة سريعة ومباشرة لتسجيل من النشاط ارتفاع الخلايا العصبية الفردية في الوقت الحقيقي. وهذا يوفر دقة وقت وحساسية أفضل بتكلفة أقل من معظم تقنيات التصوير البصري.
خلايا الشعر الخط الجانبي هي متجانسة لتلك التي من الأذن الداخلية البشرية. لذلك تستعد هذه التقنية للكشف عن خصائص دوائر خلايا الشعر التي تنطبق على الصمم البشري واضطرابات السمع. علم الفيزيولوجيا الكهربية هو حرفة تستخدم المهارات الحركية الدقيقة التي تحتاج إلى أن ينظر إليها وتقليدها جسديا.
التعليمات النصية فقط تترك مساحة كبيرة جدا لسوء التفسير. للبدء، والاستغناء عن طبقة رقيقة من الاستومر السيليكون الذاتي خلط مثل سيلغارد في طبق زراعة الأنسجة غطاء الزجاج القاع لجعل طبق تسجيل أسفل elastomer السيليكون. لجعل دبابيس تشريح، وتوفير تهمة سلبية من خمسة فولت إلى كوب 100 ملليلتر من إيشانت باستخدام إمدادات الطاقة DC وإرفاق سلك التنغستن إلى الإخراج مشحونة إيجابيا.
تراجع مرارا وتكرارا غيض من السلك في حمام إيشانت حتى يضيق الطرف إلى نقطة حادة. تحت مجهر ستيريو، قطع السلك ما يقرب من ملليمتر واحد من طرف مع شفرة حلاقة حافة مستقيمة. كرر هذا ثلاث مرات ثم إدراج دبابيس في طبق تسجيل الشفاء باستخدام ملقط ناعم.
لإعداد أقطاب تسجيل، سحب أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate باستخدام سحب micropipette مع خيوط مربع. يجب أن يكون القطب طرف قطرها 30 ميكرومتر مع تفتق التي سيتم استخدامها لتسجيل الخلايا العصبية afferent من الخط الجانبي الخلفي. سحب أنبوب إضافي البوروسيليكات الزجاج الشعرية في زوج من الأقطاب الكهربائية مع أصغر قطر تلميح واحد إلى خمسة ميكرومتر.
عقد قطب واحد في كل يد، تشغيل بلطف نصائح عبر بعضها البعض لكسر النصائح. باستخدام مثقبية، قم بتلميع الطرف المفلت حتى يصبح ناعما. يجب أن يتراوح قطر الطرف النهائي بين 30 إلى 50 ميكرومتر.
شل يرقات حمار وحشي ونقلها إلى طبق بتري 35 ملليمتر باستخدام طرف كبير لنقل ماصة. إزالة أكبر قدر ممكن من الحل المحيطة بها. تزج اليرقات في 10 ميكرولتر من 0.1٪ ألفا-Bungarotoxin لمدة خمس دقائق تقريبا.
اغسل اليرقة المشلولة بمحلول خارج الخلية لمدة 10 دقائق. ثم استخدم ماصة نقل لنقل اليرقة من حمام المحلول خارج الخلية إلى طبق التسجيل القاعي للسيليكون. تحت مجهر ستيريو ، ضع اليرقات برفق مع ملقط ناعم فوق مركز حصيرة السيليكون هذه ، الجانب الجانبي مع النهايات الأمامية والخلفية للجسم التي تعمل من اليسار إلى اليمين.
باستخدام ملقط يميل غرامة، إدراج دبوس حافة متعامدة إلى السيليكون من خلال نوتوشورد الظهري من اليرقات الظهرية مباشرة إلى فتحة الشرج. إدراج دبوس الثاني من خلال notochord قرب نهاية الذيل وإدراج دبوس الثالث من خلال ظهرية notochord من المثانة الغاز. إدراج دبوس الرابع من خلال الحويذ فيتيك مع توفير دوران طفيف كما يدخل دبوس في encapsulant.
كما يتم تطبيق دوران طفيف، ومشاهدة للأنسجة بين الحويزل المشقوق وotic للكشف عن مجموعة من سوماتا أففيرنت. ضع يرقة الدبوس تحت هدف 10 مرات على مرحلة ثابتة من مجهر DIC وتوجيه الشقوق الميسيبتية للكتل العضلية الموازية لنواقل مرحلة الرأس الأيسر. ضع السلك الأرضي في محلول الحمام وتأكد من توصيله بمرحلة الرأس اليسرى.
املأ قطب تسجيل الواقع الافتراضي ب 30 ميكرولتر من المحلول خارج الخلية باستخدام طرف ماصة مرن لتحميل الجل وأدخله في حامل ماصة مرحلة الرأس اليسرى. زيادة التكبير إلى 40 مرة وخفض ماصة التسجيل في محلول الطبق مع تطبيق الضغط الإيجابي الناتج عن محول هوائي. جلب طرف القطب على myoseptum بين اثنين من المايوميرات البطني إلى الخط الجانبي حتى يتم تركز الشق في فتحة طرف القطب VR خفض ماصة حتى حافة متخلفة من فتحة طرف الاتصالات بلطف الظهارة.
بعد الاتصال الأولي، والمناورة ماصة قطريا لضمان حافة الرائدة يجعل الاتصال ويمكن أن تولد ختم. تطبيق الضغط السلبي مع محول هوائي وعقد عليه. في برنامج المشبك التصحيح، انقر على زر التشغيل على شريط الأدوات لمراقبة إشارة VR.
تأكد من أن يتم تحقيق تسجيل VR مرة واحدة يتم ملاحظة نشاط الخلايا العصبية الحركية مع ديناميات إشارة انفجار ويلز النمطية. ملء القطب تسجيل afferent مع 30 ميكرولتر من محلول خارج الخلية وإدراجه في حامل ماصة مرحلة الرأس الأيمن. ثم خفضه في محلول الطبق مع تطبيق الضغط الإيجابي الناتج عن محول هوائي.
حدد موقع القطب الكهربائي وأحضر طرف القطب الكهربائي فوق العينة. باستخدام ميكرومانيبولاتور، خفض طرف القطب afferent حتى يتم عقد موقف فوق cleithrum. زيادة التكبير إلى 40 مرة الغمر وتحديد موقع تقاطع العصب الخط الجانبي الخلفي وcleithrum.
جلب طرف القطب فوق العقدة afferent وخفض ماصة حتى طرف الاتصالات ظهارة. بلطف، مناورة القطب بحيث محيط طرف كامل الاتصالات العقدة afferent. تطبيق الضغط السلبي مع محول هوائي وعقد عليه.
بعد النقر فوق تشغيل في برنامج المشبك التصحيح، تأكد من أن يتم تحقيق تسجيل التصحيح فضفاضة الخلية بأكملها من الخلايا العصبية afferent عندما تحدث طفرات تلقائيا تقريبا كل 100 إلى 200 مللي ثانية. مرة واحدة يتم الكشف عن الخلايا العصبية afferent ونشاط الخلايا العصبية الحركية على حد سواء، انقر على زر تسجيل على شريط الأدوات في ذروة المشبك 10 لالتقاط التسجيلات الحرة الفجوة في وقت واحد في كل من القنوات. إجراء معالجة مسبقة للبيانات كما هو موضح في المخطوطة النصية.
باستخدام بروتوكول التسجيل الخالي من الفجوات هذا ، يمكن قياس النشاط في الوقت الفعلي للخلايا العصبية الأفرنت وVR في وقت واحد. مخصص مكتوبة ، قبل معالجة البرامج النصية توليد المؤامرات للمساعدة في التصور من الكشف عن ارتفاع باستخدام معلمات مثل عتبة ، والحد الأدنى من المدة والحد الأدنى الفاصل الزمني بين البينية. تم الحصول على إشارات معزولة عن طريق ضبط المتغيرات الكشف الحد السفلي والمرتبط العلوي في البرنامج النصي قبل المعالجة.
تتبع عملية الكشف عن ارتفاع الجذور البطنية معلمات متطابقة مع مدخلات إضافية. يتم تعريف رشقات نارية داخل قيادة المحرك من قبل ما لا يقل عن اثنين من المسامير في غضون 0.1 مللي ثانية دائم لمدة خمس مللي ثانية على الأقل ورسمها ما لا يقل عن ثلاث رشقات نارية مع فترات فاصلة بين أقل من 200 مللي ثانية قبل المعالجة البرامج النصية سوف تراكب أجزاء من النشاط afferent دخلت في فترة محددة جيدا من الفائدة. في هذه الحالة، يظهر النشاط التلقائي المتوسط تغيرات جذرية استجابة لبداية النشاط الحركي المصور على المحور X كزالوقت المساوي للصفر.
تم الكشف عن اختلافات كبيرة في معدلات الارتفاع البؤري بين معدلات الارتفاع قبل السباحة ومعدلات الارتفاع في كل من فترات السباحة وما بعد السباحة. وارتبطت معدلات الارتفاع الحاد سلبا بمدة السباحة. لا يوجد أي ارتباط تم اكتشافه بين معدل الارتفاع النسبي وتواتر السباحة.
صحة الحيوان هو أهم شيء عند محاولة هذا الإجراء. من المهم مراقبة تدفق الدم السريع ليس فقط لضمان رفاهية الحيوان ولكن أيضا لزيادة احتمال نجاح التسجيل العصبي. من خلال الاستفادة من الأدوات الوراثية المتاحة في Zebrafish ، يمكن تكملة بروتوكول الفيزيولوجيا الكهربية هذا بخطوط معدلة وراثيا للتحقيق بقوة في اتصال الدائرة التشريحية والوظيفية في أنظمة خلايا الشعر وخارجها.
هذا التعديل المبسط لتقنية المشبك التصحيح يسمح لنا لرصد كيفية عمل النظم الحسية في الجسم الحي.
