Yazarlar Sindirim Moleküler Araştırmalar UPenn NIDDK Merkezi Moleküler Patoloji ve Görüntüleme Çekirdek ve görüntüleme yardım için Karaciğer Hastalıkları (P30 DK50306) müteşekkiriz. Bu çalışma (RGW için) Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DK-092111) gelen ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi&#39;nden hibe ile ve (SK) Çocukluk Karaciğer Hastalıkları Araştırma ve Eğitim Ağı bir burs ile desteklenmiştir.

Aksi belirtilmediği sürece, tüm işlem, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Tüm hayvan çalışmaları yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde insani şartlarda yapılmalıdır. 1.. Ekipmanları hazırlanması ve Çözümler <ol><li> Doku kültürü kaputu ve inkübatör (Şekil 1A) yakın fare cerrahi tablo oluşturdu. Not: Gerekli donanımları bir diseksiyon mikroskobu, bir ışık kaynağı, 12.5 cm uzunluğunda düz iris makası, ince ipuçları ile 6 inç olmayan tırtıklı kavisli bir forseps ve 4 inç kavisli uçları (Şekil 1B) ile tırtıklı forseps içerir. </li><li> Cerrahi masaya% 70 alkol, bir cam beher içinde sterilize aletleri yerleştirin. </li><li> Steril izolasyon medya (Tablo 1) ile üç steril 60 mm Petri kapları doldurun; cerrahi masada iki ve kaput biri, buz üzerinde tüm yerleştirin. </li><li> Sıçan kuyruğu kollajen yerleştirin,10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), steril su, steril 1 N NaOH ve doku kültürü kaputu safra epitel hücre (BEC) ortamı (Tablo 1). Not: kollajen buz üzerinde olmalıdır. </li></ol> 2.. Safra Kanalı İzolasyon ve Kültür <ol><li> Bilinçsiz IACUC kılavuzlar (Şekil 1C) başına servikal dislokasyon ile takip kadar karbon dioksite maruz bırakılarak, yaşam 0-3 gün arasında yeni doğan farelerin Euthanize. Not: eski fareler spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> Sırtüstü pozisyonda hayvan yerleştirin ve pelvis bölgesinde, orta hattı geçen bir küçük yatay bir kesi yapmak. U şekilli flep oluşturulması, yanal ve yukarı karın her iki tarafını bu kesi uzatın. Karın organları maruz kapağını açın. Karın açıldığında, dikkatle karaciğer ve safra kanalının daha iyi görselleştirme için hayvanın sağ tarafına doğru karın boşluğundan dışarı bağırsak hareket. Not: Karaciğer iyi kimlik elde etmek için göğüs kafesi içine yanal kesiler uzatmak için gerekli olabilir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu kullanılarak, ortak safra kanalı, karaciğer, bağırsak ve tanımlamak. Yapıları çok hassas olduğu gibi, dikkatli kullanarak, ilk ortak safra kanalı (Şekil 1D) tanımlayın. Tırtıklı olmayan dişli forseps ile, titizlikle temiz ve safra çevreleyen yağ dahil olmak üzere bağ dokusu koparmak. Kanal ve temizlemek için diğer tutmak için bir forseps kullanın. </li><li> Safra kesesini temizlemek için benzer bir tekniği kullanın. </li><li> Buz üzerinde izolasyon medyanın ilk yemeğin içine temizlenmiş kanallarını ve safra kesesini yerleştirin. Medyada daha fazla bağ dokusu kaldırmak ve safra kesesi safra çıkartırken hafifçe olmayan dişli forseps ile yapıları masaj. </li><li> Izolasyon medyanın ikinci çanak kanallarını ve safra kesesini aktarın. </li><li> 5 hayvanlardan elde edilen kanal ve safra kesesi izolasyonundan sonra, aktarmakaputu üçüncü Petri kabı parçaları. Not: hücreler, en fazla 5 hayvanlardan izole edilecekse, 5 hayvandan oluşan her grup için yeni çözeltiler kullanılarak, gruplar halinde var. </li><li> Doku kültürü kaputu kalın kollajen jeller hazırlayın: Not: herhangi bir boyut çanak kullanılabilir. 5 yeni doğan her bir grup için 3 ml kolajen bir son hacme sahip 60 mm kültür çanağı iyi çalışır. Bu taze izole edilmiş kanalları gömme anda taze hazırlanmalıdır. <ol><li> Buz üzerinde fare kuyruk kolajeni, 10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS 10x), steril dH 2 O ve steril 1 N NaOH yerleştirin. </li><li> Kollajen 0.023 katı hacmine eşittir 1 N NaOH hacmi kullanılarak, dH 2 0, 10x PBS, NaOH ve kollajen 1x PBS içinde 2 mg / ml kolajen nihai konsantrasyonuna sahip jeller için gerekli olan miktarlar hesaplayın ilave edildi. Not: kollajen alternatif kaynak kullanılırsa, nötralizasyon ve jel oluşumu için üreticinin yönergelerini izleyin. </li><li> Birlikte dH 2 0, 1 mix0 x PBS, ve 1 N NaOH, daha sonra da karıştırma sağlamak için kolajen ve pipet kuyu ekleyin. </li></ol></li><li> Kolajen çözeltisi, oda sıcaklığında benzeri bir kıvam jel kalınlaştırılmış sonra, hemen kollajen kanalları gömmek. </li><li> % 5 CO2 30 dakika boyunca katılaşması için kolajen sağlamak için, 37 ° C&#39;de inkübatör yerleştirin. </li><li> Jel (beyaz açık renk değişiklikleri), BEC medya (Tablo 1) 3.5 ml ile kaplamayı katılaşmış ve 37 ° C&#39;de inkübe edildikten sonra,% 5 CO 2. </li><li> BEC medya haftada 3 kez kaldırmak ve 3.5 ml taze ortam ile değiştirin. </li></ol> Kalın Kollajen Jeller 3. Isolating İlköğretim Cholangiocytes Not: 3 hafta içinde, cholangiocytes (büyük çekirdekler gömülü kanallarından doğrudan uzanan hücreler) yaprak kalın kollajen görünür olacaktır. Çanak fibroblastların çok sayıda vardır, bu atılmalıdır. Yemeğin bir kaç bölge varsafibroblast büyüme, bu bir bistüriyle kesilip ve önceki cholangiocytes bölme için çıkarılabilir. <ol><li> Ince kollajen jeller hazırlayın: <ol><li> Steril PBS ile 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar kollajen seyreltin. Not: 100 mm tabak için 1 ml kullanmak; Diğer boyut yemekler için buna göre ayarlayın. </li><li> Bir hücre dağıtıcı (büyük yemekleri) veya pipet ucu (küçük yemekler) ile eşit şekilde yayılmış kolajen çözeltisi, daha sonra 10 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> DMEM/F12 plaka kapak ve 37 ° C, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li><li> Inkübatör plakasını çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın. Hemen 1x PBS aspire. </li><li> Plakası döner veya bir çalkalayıcı levha üzerinde yayma kollajen yerleştirerek ikinci bir ince tabaka ile kaplayın. 37 ° C&#39;de, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin. </li><li> Kollajen katılaşan sonra, kapak DMEM/F12 plakası ve 37 ° C, 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Th hücreleri bölmeTran kollajen jeller: <ol><li> Bu yüzer böylece hücre kültürünün bir spatula ya da hücre kazıyıcı ile, plaka kapalı yavaşça kollajen jel kazıyın. </li><li> DMEM/F12 ile 10 mg / ml Tip XI kolajenaz (maddeler listesine bakınız) seyreltilerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın. De ve steril filtre karıştırın. </li><li> Kalın kollajen hücrelerin 60 mm tabak başına kolajenaz çözeltisi (yukarıdaki) 1 ml ilave edilir. (3 ml olmalıdır) BEC ortamı çıkarmayın. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe çanak,% 5 CO2. </li><li> Hücreleri içeren çözüm çıkarın ve 15 ml konik bir tüp içinde yer. </li><li> 5 dakika boyunca 2.200 xg&#39;de aşağı spin. Süpernatantı atın ve DMEM/F12 benzer hacminde pelet askıya yeniden. </li><li> 5 dakika boyunca 2,200 x g hızında tekrar çözelti Spin. Süpernatantı. </li><li> 3,% 0.5 tripsin ml ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca,% 5 CO2 inkübe içinde süspanse pelet. Inkübasyondan sonra, çözüm yukarı pipet ve aşağı cholangiocytes bir yaprak kırmak için. BEC medya a 5 ml ekleyin5 dakika boyunca 1500 xg nd sıkma çözüm. </li><li> Daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de çözeltisi spin DMEM/F12 süpernatant ve pelet tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Süpernatantı ve BEC medya (Tablo 1) pelet askıya yeniden. Önceden yapılmış ince kollajen jeller üzerinde plaka hücreleri. </li></ol></li></ol> Hücreler 4. Passage ve Depolama Not: Gerektiğinde ince kollajen jeller üzerinde hücreler bölünebilir. <ol><li> Önce 10-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.25 tripsin kuluçka için steril PBS ile plakaları yıkayın. </li><li> BEC ortamının bir eşit hacmi ile nötralize ve 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de topak. DMEM/F12 pelet durulayın, daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de topak. </li><li> Kollajen kaplı hücre kültürü yemekleri dağıtımı için BEC medyada süspanse edin hücreleri. Not: Alternatif olarak, hücreler, depolama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve -80 ° C veya sıvı azot dondurucu (Tablo 1) saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan yenidoğan dahil her yaştan farelerin farelerin ekstrahepatik safra kanallarında saf cholangiocytes izole etmek için bir tekniktir. Teknik ekstrahepatik cholangiocytes intrahepatik cholangiocytes ayrı ele alınabilir ki avantaj sunuyor, ve hücrelerin bu toplumlar arasında önemli farklılıklar tespit çalışmaları kolaylaştırabilir. Biz son zamanlarda bir çalışma demonstrating bu yöntemle izole ve al yanaklı rotavirüs 8 ile enfekte ekstrahepatik cholangiocytes içinde kirpi...

Intra ve ekstrahepatik cholangiocytes kökeni ve gelişim belirgin farklıdır. Karaciğer ventral foregut endoderm 5 bir divertikül gelişir. Kranial bölge intrahepatik safra yolları 5 üretirken divertikül kaudal bölge, ekstrahepatik safra yolları oluşturur. Intrahepatik kanal cholangiocytes peri portal bölgelerde 6&#39;da duktal plaka çevresinde projenitör hücrelerinden türetilmiştir. Bu hücreler hepatositler veya cholangiocytes 6 ya da içine ayırt etmek yeteneğine sahip. Bu cholangiopathies özellikle cholangiocytes bir kategori hedef olabileceğini verilen önemli klinik etkileri vardır. Alagille Sendromu intrahepatik kanalları etkiler Örneğin, biliyer atrezi başlangıçta, yenidoğanın ekstrahepatik kanalları etkiler. Fare ve sıçan cholangiocytes intrahepatik safra kanalı ve birimlerin tecrit çok açıklamaları vardır. Içindevestigators kanal izolasyon ve sonraki akıbet tarafından tek hücreleri izole veya karaciğer sindirim ve antikor spesifik hücre yüzey belirteçleri 1-4 ifade cholangiocytes aşağı çekme var. Fonksiyonel ve polarize safra kanalı birimleri karaciğer sindirim ve boyut filtrasyon 7 tarafından izole edilmiştir. Safra kanalı tane izole cholangiocytes vitro 1,2 kanalsal yapıların geliştirilmesi için gösterilmiştir ve, uyarı salgılama ve sıvı salgı 7 göstermek için yanıt yeteneğine sahiptir. Bu yöntemlerden Sınırlamalar sindirim enzimleri ile karaciğer perfüzyon için uzman teknik uzmanlık ve özel ekipman ihtiyacı bulunmaktadır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler 3 ile kirlenme riski vardır. Özel olarak neonatal ekstrahepatik safra kanallarının ikinci, ekstrahepatik safra kanalı cholangiocytes izole edilmesi için bir yöntem olup, daha önce tarif edilmemiştir. Bu yazıda yenidoğan a izole etmek için basitleştirilmiş bir teknik özetliyoriyi saflık yüksek seviyelerde yetişkin ekstrahepatik safra kanalı hücreleri olarak var. Bu teknik, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve ekstrahepatik kanalları dahil safra atrezi gibi hastalıkların mekanizmaları araştırma arasındaki farkların çalışma kolaylaştıracaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

Karaciğer içi ve ekstrahepatik safra kanalları gelişimsel farklıdır ve farklı şekilde bazı hastalıklar etkilenebilir. Ancak, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve yenidoğan ve yetişkin hücreleri arasındaki arasındaki farklar, iyi anlaşılmış değildir. Intrahepatik safra kanallarının ikinci cholangiocytes izolasyonu için yöntemler de 1-4 kurulmuştur. Bu ayrı cholangiocyte popülasyonları arasındaki farklılıkları anlamak ve ekstrahepatik kanalları hedef gibi görünür, safra atrezi gibi hastalıklara okuyan büyük fayda olacağını, ancak özellikle Yenidoğandan ekstrahepatik duktal hücrelerin izolasyonu, henüz tarif edilmemiştir. Neonatal ve yetişkin fare hem de ekstra-hepatik safra kanalı hücreleri izole etmek için optimize edilmiş bir teknik aşağıda tarif edilmiştir. Bu teknik, fibroblastlar gibi mezenkimal hücrelerden en az kirlenme ile saf bir hücre popülasyonu elde edilir. Bu metod titiz diseksiyon ve yağ ve fibroblast tabakaları kaldırmak için kazıma tarafından takip ekstrahepatik kanalları ve safra kesesi, çıkarılması dayanmaktadır. Yapılar deneysel kullanım için daha sonra tripsinize edilebilir ve kaplama yeniden tek katmanlarda cholangiocytes arasında gelişimini sağlamak için yaklaşık 3 hafta boyunca kollajen ve kültüre kalın tabakalar gömülür.

Neonatal fare ekstrahepatik mükemmel saflıkta cholangiocytes, K19 immünofloresan boyama ile gösterildiği gibi (Şekil 2A ve 2B) bir nüfus izolasyonunda bu protokol sonuçlarının kullanılması; erişkin farelerin hücrelerini izole benzer sonuçlar elde. Bu kalın kolojen jeller üstünde tek tabakaları oluşturacak şekilde taze olarak izole edilen safra kanalları hücrelerin boyunca 3 hafta sürer olduğunu gözlemledik. Cholangiocytes kanallarından izole edilmiş hücre tabakaların oluşt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Görüntüleme.  The Children's Hospital of Philadelphia.  Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar. 