نشكر MR Helmus لأكثر من صوت، CM Popelier، S. Ypenburg وC. يفيسك للحصول على المساعدة الفنية. ويدعم هذا البحث ماليا من قبل المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO)، وهولندا الأكاديمية الملكية للفنون والعلوم (KNAW) ومنظمة خدمات الطلاب اليابان (JASSO). وأيد هذا المنشور من منحة النفاذ المفتوح من NWO إلى JMK.

1. مرفق تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات من المنقعية الكبار الراكدة (L.) من ثقافة المختبر مثل واحد في جامعة VU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على المياه المنخفضة النحاس عند 20 درجة مئوية في كل مرفق تربية (molluscarium) والدبابات التجريبية، التي لديها صرف المياه المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين دورة الضوء / الظلام في 12 ساعة: 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتربية، تغذية القواقع الكبار الخالية من المبيدات الحشرية بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية الخس، وإطعام الصغار مع الأحداث TetraPhyll (الأسماك) رقائق. الحفاظ على القواقع في خزانات منفصلة وفقا لسنهم، بدءا من كتل البيض التي وضعت ضمن إطار زمني 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تتم إزالة القواقع من الدبابات تربية لا عادوا، لتجنب آثار بعد أن تبقى في ظل ظروف مختلفة قليلا وكذلك لمنع pseudoreplication. </li></ol> 2. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل القواقع ل1 أسبوع، وإطعامهم الإعلان بالمال وبالشهرة أيضا، لضمان ثار لديهم الحيوانات المنوية الكامل ومخازن السائل المنوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر ستيريو، لوحة تشريح مع دبابيس، مقص جراحي صغير، ملقط الخشنة وغرامة، وهي مل حقنة مليئة 10 50 ملي MgCl 2 الحل، والإبر الحقن (0.3 ملم × 13 ملم) وبعض المناشف الورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحلزون عن طريق حقن MgCl 2 الحل (عادة 3 مل أو أكثر لالقواقع الكبار بطول قذيفة من 31.6 ± 2.1 ملم والوزن الرطب من 2.89 ± 0.55 غ). اختراق القدم مع إبرة الحقن في زاوية 45 درجة وحقن عن طريق تطبيق الضغط بلطف بشكل مستمر حتى يرتاح الحلزون ويبقى الموسعة (في غضون ثوان). إزالة إبرة الحقن وتحقق ما إذا كان الموت الرحيم الحلزون (على سبيل المثال، عن طريق فحص ما إذا كان رد الفعل اللامسة انسحاب غائب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية قذيفة التالية انحناء لها باستخدام ملقط الخشنة. في منتصف الطريق، فصل بلطف العضلات columellar من قذيفة عن طريق كشط مع ملقط. بلطف تحريف رانه الحلزون قوقعته من بعد الاتجاه المتعرج للقذيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحلزون على لوحة التشريح وحصره في نهاية الجزء الخلفي من القدم. ثم، وضع دبوس من خلال الرأس ووضع بعض التوتر على الحلزون لتسهيل تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توطين gonopore الإناث، والتي ستكون في وقت لاحق على نقطة مرجعية للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص جراحي وملقط غرامة، وجعل شق الأولى، فقط تحت حافة عباءة وقطع نحو gonopore الإناث. عند واحد من شفرات مقص &quot;يتم الضغط تحت جدار الجسم، ورفع عنه قليلا فقط لضمان أن جدار الجسم، وأيا من الأعضاء الداخلية، يتم قطع. مواصلة قطع فوق gonopore نحو الرأس وقطع في خط مستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توطين غدة البروستاتا (الخلفي) والحويصلات المنوية (الأمامي). تشريح هذه بعناية والاحتفاظ بها على الجليد. استخدام هذه الحلول لجعل اختبار تحتوي على السائل المنوي و / أو الحيوانات المنوية. استخدام الفسيولوجية المنقعية سالالمعهد الوطني للإحصاء (5.83 ملمول / لتر و CaCl 2 · 2H 2 O، 3.76 مليمول / لتر MgCl 2 · 6H 2 O، 42.69 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم، 37.53 مليمول / لتر بوكل) كوسيلة الناقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع السائل المنوي التي موجود في تجويف غدة البروستاتا وكذلك الحيوانات المنوية من الحويصلات المنوية. بعد ذلك، وقف كل من في المياه المالحة في قنينات منفصلة بالإعراب بلطف محتوياتها وإزالة الأنسجة الجهاز مع ملقط. الحفاظ على الجليد واستخدام نفس اليوم. في وقت لاحق، مزج هذه المعلقات لإنشاء حلول معاملة مختلفة. </li></ol> 3. مهبلى حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إجراء الحقن مهبلى، وإعداد السيليكون قذيفة العفن (مصنوعة لتناسب غيض من قذيفة)، 1 ملم المحاقن، 10-12 سم السيليكون الأنابيب التي يبلغ قطرها 1 مم، قلل الإبر الحقن (0.3 ملم × 13 ملم )، ملقط الخشنة ونفس 10 مل حقنة مليئة 50 ملي MgCl 2 الحل مزودة حقن إبرة حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحيوانات المنوية، وهناك حاجة لإضافة إلى السائل المنوي (أو فرد بروتينات السائل المنوي) في بعض العلاجات؛ جرعة ذات الصلة بيولوجيا يعادل 1/3 من غدة البروستاتا والحويصلة المنوية في الحقن. ملاحظة: في نتائج قسم ممثل (الشكل 1) وأظهرت نتائج تجربة مع ثلاثة علاجات مختلفة: التحكم (متوسطة الناقل، أي المياه المالحة)، Ovipostatin (واحد من البروتينات السائل المنوي المحددة) وحده، وOvipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. بالإضافة إلى ذلك، لتقدير الجرعات ذات الصلة بيولوجيا في الأنواع الأخرى، وتحديد الفرق في وزن غدة البروستاتا من الأفراد الذين تزاوج والأفراد التي بقيت معزولة جنسيا 16 في الآونة الأخيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل المحاقن لكل من حلول اختبار استعداد. ملء كل المحاقن مع حل واحد وضمان عدم وجود فقاعات هواء داخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب إبرة حقن اضعافها على كل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدام حقن 1مم أنبوب السيليكون بطول لا يقل عن 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة بعناية أنبوب السيليكون على إبرة الحقن، والتأكد من عدم اختراق أنبوب، وإزالة الهواء من الأنبوب بلطف من خلال تطبيق الضغط على حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحلزون باتباع نفس البروتوكول كما هو الحال في النقطة 2.3. هذه المرة تأكد من عدم ضخ أكثر من 2-3 مل من 50 ملي MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحلزون في وعاء العفن لإبقائه في وضع مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع gonopore الإناث، وهو أمر واضح كما بقعة بيضاء على الجانب الأيمن للحيوان، الأمامي إلى اللامسة الحق وgonopore الذكور بشكل واضح (وينطبق هذا الموقع أيضا إلى الأنواع الأخرى من القواقع في المياه العذبة). تأكد من أن يكون الوصول دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لعقد نهاية أنبوب السيليكون وبلطف إدراج ما يقرب من 2-4 ملم من أنبوب السيليكون في gonopore الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بعناية الضغط على حقنة وحقن 0.03 مل من محلول الاختبار. انتظر نصف دقيقةيوت للسماح للضغط في الأنبوب لتنتشر في المسالك الإناث قبل إزالة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الحلزون المعالجة إلى حاوية عزلتها، حيث يمكن رصدها، والسماح لها للتعافي من التخدير في خزان التجريبية. </li></ol> 4. الأحيائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كل الحلزون لتحديد وقياس طول غلافه. وهذا الأخير يعد مؤشرا جيدا لحجم، والتي هي ذات الصلة عند قياس الناتج الإنجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء كل الحلزون معزولة في حاوية مل 460 الذي مثقبة للسماح لتبادل المياه داخل الخزان التجريبية. من المهم أن تضع كافة الحاويات في الاتجاه الصحيح، مع ثقوب في اتجاه تدفق المياه، للسماح لتبادل المياه بكفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الأحيائي، وإطعام القواقع بانتظام مع كمية قياسية من الخس. استخدام جولة، الناخس المعادن لخفض الخس. في هذا البروتوكول وتستخدم أقراص الخس من 19.6 سم 2، الذي يقترب من وجبل أنها الحد الأقصى يمكن أن يأكل في يوم واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كتلة البيض باستخدام الجانب المسطح من ملعقة وتتخلص من كتلة البيض من جدار الحاوية. استخدام الجانب ملعقة لجمع كتلة البيض. ملاحظة: كتل البيض كامد التي وضعت للتو لا يمكن أن تستخدم للمسح الضوئي (أنها تصبح شفافة في غضون ساعات قليلة بعد أن وضع). لأنواع نموذجية في هذا البروتوكول، المنقعية الراكدة، تحقق من وجود كتل البيض كل يوم، لأنها تنتج 2-3 كتل البيض في الأسبوع. وهذا يمكن أن تختلف في الأنواع الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح كتل البيض التي تم جمعها رقميا، وذلك باستخدام (كمبيوتر محمول) الكمبيوتر الذي يحتوي على برنامج تشغيل الماسح الضوئي، الماسح الضوئي سرير مسطح، وعلى نطاق ملليمتر القياسية، ملعقة، ونقل لوحات والبلاط والزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل كتلة البيض على لوحات نقل وتكرار حتى لوحات مليئة. في وقت لاحق، ربت الجماهير البيض الجاف على منشفة ورقية ونقلها على البلاط والزجاج في نفس الترتيب كما في لوحات نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل كل البلاط رأسا على عقب (وسوف كتل البيض التمسك البلاط والزجاج) ووضعه بعناية على الماسحة الضوئية المسطحة، فقط تحت نطاق ملليمتر. تطبيق قليلا من الضغط لشد الجماهير البيض، والتي سوف توزع بالتساوي البيض بحيث تكون مرئية فقط داخل الطائرة التركيز نفسه. تناسب البلاط مع كمية قياسية من الشريط حول حواف اثنين للتأكد من أن كل البيض يتم بالارض على قدم المساواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات الماسح الضوئي. من المهم لضبط القرار إلى الحد الأقصى، وجعل معاينة المسح الضوئي، والمحاصيل مجال العمل، وضبط السطوع والتباين. مسح كتل البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل البيض في الكتلة الخاصة صفت 20 مل قارورة من الزجاج من أجل مزيد من التطوير والفقس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث المياه في قوارير التفريخ كل يوم للحفاظ على الاوكسيجين بشكل صحيح. القيام بذلك وفقا لأرقام فقس البيض وحجم بالترتيب التالي: الصب / صب قبالة (أي سلحفاة صغيرة)، تفيض (بداية من الفقس)، واستخراج من الماء مع ماصة (سلحفاة صغيرة كثيرة). </li></ol> &lt;ع الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. قياس والعد بيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت بحرية المتاحة برمجيات تحليل صورة يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية) والمساعد العداد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة يماغيج فضلا عن برنامج جداول البيانات لنقل البيانات ل. ثم فتح صورة ممسوحة ضوئيا من كتل البيض في ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المقياس باستخدام أداة التكبير للانتقال إلى النطاق ملليمتر. تكبير وضبط نافذة لل1 ملم إلى ملء الشاشة. رسم خط باستخدام أداة الخط الفاصل بين الخطين التي تشير إلى 1 ملم. انتقل إلى تحليل، وتعيين نطاق واسع. في القائمة المنبثقة يصبح الخيار طول قياس واضحة، وضبط المسافة معروف إلى 1 وحدة طول لمم. ضع علامة في المربع العالمية، وإغلاق النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين القياسات فضل (الطول، العرض، محيط) قبل الانتقال إلى تحليل، وضبط المقاييس من خلال تحديد المساحة والقطر فيريه في (الطول والعرض). انقر فوق موافق لتأكيد والاستمرار مع تحليل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس البيض، زويام في يوم بيضة من أول كتلة البيض الذي يحتاج إلى أن يقاس. ينصح التكبير من 800٪. ثم، وذلك باستخدام أداة رسم شكل بيضاوي بيضاوي الشكل بالضبط حول البيض، اضغط CTRL + D لرسم محيط على الصورة (لمنع قياس نفس البيض مرتين). ثم اضغط CTRL + M لتسجيل قياس خصائص البيضاوي (الطول، العرض، محيط)؛ يفتح الشاشة المنبثقة عرض القياسات. ملاحظة: لا يتم تطبيق استخدام الأداة بيضاوي الشكل لقياس البيض لجميع الأنواع. الأنواع مع البيض على شكل غير منتظم، استخدم التحديدات مرفوعة بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس العديد من البيض حسب الضرورة ثم قم بحفظ التدابير ما. XLS ورقة العمل. اختياريا، نسخ البيانات مباشرة في ورقة عمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد لاحقا البيض ضمن كتلة البيض، باستخدام نافذة العداد ووضع التهم يدويا في ورقة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، عد البيض الفردية في كتلة البيض بمساعدة الخلية مضادة في المكونات. لهذا، انتقل إلى بلج انس،ثم، تحليل وتحديد العداد الخلية. سوف نافذة العداد الخلية يطفو على السطح، والتحقق من &quot;إبقاء الأصلي&quot; مربع واضغط على &#39;تهيئة&#39;. تظهر نافذة جديدة مضادة، حدد أداة التقاطع من شريط الأدوات وحدد نوع العداد في القائمة العداد الخلية. عد البيض الفردية من خلال النقر على البيض الفردية في إطار مكافحة الخلية. مراقبة العد الكلي بجانب نوع العداد في القائمة العداد الخلية. نسخ هذا الرقم يدويا إلى جدول بيانات أو الحصول على النتائج عن طريق الضغط على النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعول الجماهير البيض متعددة داخل الحدث العد واحدة عن طريق إضافة أنواع مضادة، إذا لزم الأمر. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يبين بروتوكول المعروضة كيفية جمع السائل المنوي وكيفية اختبار هذه بطريقة ذات مغزى من الناحية البيولوجية. على الرغم من أن هذا الإجراء هنا يظهر البروستاتا باستخدام مستخلص الغدة، وأثر من البروتين النقي السائل المنوي احد ويمكن أيضا اختبار باتباع نفس الإجراء. من الواضح، في مثل هذه الاختبارات هو دائما حاسمة لتشمل الضوابط المناسبة (علاجات صورية) للتأكد من أن الإجراء و / أو متوسطة الناقل لا تؤثر على المعلمات في الأسئلة 14،16. باستخدام هذا الأسلوب، وقد تم بالفعل تبين أن هناك واحد من البروتين السائل المنوي، وهما Ovipostatin، التي تتوسط انخفاض في وضع البيض 14،16. هذا البروتين، ينتج في غدة البروستاتا ونقل خلال التزاوج مع الحيوانات المنوية، يمثل أول تتميز بالكامل المكون السائل المنوي في وقت واحد وخنثى لا، حتى الآن، لم تظهر أي تشابه البروتينات المعروفة. النتيجة التي مفادها أن Ovipostaالقصدير يقلل الإنتاج الضخم البيض في المتلقي يعزز العمل في وقت سابق تشير إلى أن المواد الموجودة في السائل المنوي قد تؤثر على وضع البيض 13-15. عن طريق تحويل مبالغ بيولوجيا ذات الصلة (انظر 3.2 16)، يمكن للمرء أن تبرهن بشكل مقنع أنه هو السائل المنوي البروتين، وليس وجود الحيوانات المنوية نفسها، التي تتوسط الحد الملحوظ في وضع البيض (الشكل 1). بالنظر إلى أن استلام المتكررة من السائل المنوي عن طريق التزاوج الطبيعي يزيد من الاستثمار في البيض 15، يصبح الآن ذات أهمية كبيرة لقياس البارامترات الأخرى من وضع البيض. بروتوكول قدمت يوفر الآن الأساليب اللازمة للقيام بذلك. على الرغم من أن تم العثور على أي أثر للOvipostatin على الفقس نجاح البيض الذي تضعه المتلقي 16، قد يكون هناك غيرها من البروتينات السائل المنوي التي تعمل بالتنسيق مع هذا البروتين. وبالتالي، المعلمات التي تحتاج إلى أن يكون كميا في هذا السياق - إلى جانب وضع أرقام التردد والبيض - وتشمل حجم البيض، hatcالوقت هينج والتنمية فقس البيض وفقس البيض حجم. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن ننظر إلى الآثار المترتبة على عمليات امرأة أخرى من وضع البيض، مثل تخزين الحيوانات المنوية والاستخدام، فضلا عن تخصيص الموارد نحو الإنجابية وظيفة الإناث والذكور 14،17. بوضوح، وطريقة عرض يستفاد منه في معالجة هذه القضايا متابعة، سواء في المنقعية الراكدة وغيرها من القواقع في المياه العذبة. باختصار، هذا المعرض التجارب باستخدام بروتوكول نقل البروتينات السائل المنوي تؤثر على الأداء التناسلي الأنثوي للمتلقي في هذه المنحرفين في وقت واحد. بالنظر إلى أن تناولت دراسات قليلة هذا، فإنه من المرجح أن يكون أكثر شيوعا في تسميد داخليا من المنحرفين وينعكس حاليا في الأدبيات العلمية. وخصوصا عندما يدرك المرء أن اختيار زميله قبل كوبولاتوري والمنافسة الحيوانات المنوية وقد ثبت أن تلعب دورا هاما في هذه المنحرفين 14، والتي highlighنهاية الخبر إمكانات ذكر مثل البروتينات الغدة الإكسسوارات التي سيتم اختيارها عن طريق الاتصال الجنسي في هذا النظام. أخيرا، يساعد هذا البحث لدعم الفكرة النامية التي بروتينات السائل المنوي لهما أهمية متساوية للالمنحرفين في وقت واحد كما هي بالنسبة للأنواع منفصلة تلاعب.

عند نقله، وعادة ما يرافق الحيوانات المنوية عن طريق السائل المنوي التي تنتجها الغدد التبعي الذكور. في حين لعب بعض مكونات السائل المنوي الأدوار في تغذية الحيوانات المنوية وتفعيل 1، والبعض الآخر تؤثر فسيولوجيا الإناث من أجل زيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة 2-4. ويتم اختيار هذه الآثار وخاصة بالنسبة لل، عن طريق الانتقاء الجنسي، عندما الأنواع غير منحل للغاية ولديه تخزين الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية كفاءة الهضم. في ظل هذه الظروف، تتنافس الجهات المانحة الحيوانات المنوية بشكل كبير للإخصاب البيض 5. في حين أن هناك أدلة وفيرة علائقية لأهمية المواد السائل المنوي للنجاح الإخصاب الذكور، دليل مباشر هو أكثر نادرة ولقد يفتش دراسات قليلة في تفاصيل التغيير الفسيولوجية و / أو المواد المعنية 6. في الأنواع ذات الجنسين منفصلة (أي الذكور والإناث؛ gonochorists) هناك عدد قليل من التحقيق جيدا نموذج SPECIوفاق عندما يتعلق الأمر تكوين السائل المنوي وآثارها. وتشمل الأمثلة على ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن 6، والبعوض والملاريا، والأنوفيلة الغامبية 7، وخنفساء الدقيق الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم 8. مثل هذه الدراسات السائل المنوي هي أكثر ندرة بكثير عندما يتعلق الأمر الأنواع التي هي خنثوي في وقت واحد (أي الأفراد وظيفيا الذكور والإناث في نفس الوقت)، على الرغم من هذا النمط من الاستنساخ هو شائع في جميع أنحاء المملكة الحيوانية 9. المثال خنثوي أبرز نقل مادة الغدة التبعي هو على الارجح اطلاق النار ما يسمى الحب والسهام في القواقع الأرض 2،10، حيث يتم نقل المادة من قبل الجهة المانحة عن طريق الحقن تحت الجلد الحيوانات المنوية 11،12، أي لا جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية. ولكن هناك العديد من المنحرفين المتزامنة التي نقل المنتجات التبعي الغدة الذكور جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية، ومثل الأنواع النموذج المستخدم هنا، والبركة العظيمة الحلزون المنقعية الراكدة. وقد أظهرت أبحاث سابقة بالفعل أن تلقي السائل المنوي يؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى من هذا النوع 13-15، ولقد تم تحديد العديد من البروتينات تشارك السائل المنوي 16،17. الهدف العام من هذا البروتوكول، والذي هو امتداد الطرق التي أعلن عنها في Koene 16 آخرون، هو اختبار آثار البروتينات السائل المنوي على معايير مختلفة من وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات. ويتم إنجاز ذلك عن طريق تشريح غدة البروستاتا (أي الغدة التبعي الذكور إنتاج السائل المنوي) من القواقع المانحة معزولة جنسيا من ثقافة المختبر القياسية. الثانية، يتم جمع الحيوانات المنوية المتبرع من الحويصلات المنوية ومصنوعة حلول معاملة مختلفة. بعد ذلك، يتم اختبار القواقع مخدرة وحقن intravaginally مع حل الاختبار (على سبيل المثال،البروستاتا غدة استخراج وحده والبروستاتا غدة مع استخراج الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية وحدها، متوسطة الناقل وحده). ومن ثم يتم رصد هذه القواقع اختبار للأيام التالية لأسابيع تحت الظروف القياسية، لتسجيل وضع البيض. يتم جمع كتل البيض، مسحها رقميا لحساب وقياس معايير مختلفة، ومن ثم وضعها في قارورة الفردية لتفقيس. بعد حوالي أسبوعين، يتم الاعتماد على سلحفاة صغيرة ومسحها رقميا. جميع بالاشعة، كل من كتل البيض وسلحفاة صغيرة، ثم يتم تحليلها باستخدام بحرية المتاحة حزمة برامج تحليل الصور. لهذا البروتوكول يستخدم سلالة المختبر من الحلزون بركة كبيرة، المنقعية الراكدة، والتي يتم تربيتها في جامعة VU في أمستردام. يخدم هذا النوع كنظام نموذج للتحقيق في أسئلة حول الانتقاء الجنسي والتكاثر في المنحرفين. حجم الحيوان كبير نسبيا يجعل من التجربة للوصول للغاية. بالإضافة إلى ذلك، لأنه يستخدم كنوع النموذج في كثير من بالتخصصات iological نحن نعرف بالفعل الكثير عن بيولوجيا الأساسية لهذه الحيوانات. وهذه الطريقة تساعد على دراسة تساؤلات حول عمليات الانتقاء الجنسي التي يتم بوساطة بروتينات السائل المنوي عن طريق بصفة عامة. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه هي المنحرفين في وقت واحد، فمن الممكن لمعالجة ما إذا كانت هذه البروتينات تعمل بطرق مشابهة و / أو مختلفة كما هو الحال في الأنواع حيث يتم فصل الجنسين 16،17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

في تسميد داخليا الحيوانات، وعادة ما أضيف السائل المنوي إلى الحيوانات المنوية، وتشكيل معا المني أو السائل المنوي. إلى جانب الحيوانات المنوية مغذية وتفعيل، يمكن للمكونات في السائل المنوي تؤثر أيضا على علم وظائف الأعضاء الإناث لزيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة. في حين أفادت العديد من الدراسات هذه الآثار في الأنواع مع الجنسين منفصلة، ​​وقد تناولت دراسات قليلة في هذا خنثوي الحيوانات في وقت واحد. ويعرض هذا البروتوكول الفيديو وسيلة لدراسة آثار السائل المنوي في الرخويات، وذلك باستخدام المياه العذبة الحلزون خنثوي في وقت واحد، والبركة الحلزون كبيرة المنقعية الراكدة، والنموذج الحي. في حين يظهر الإجراء باستخدام كاملة البروستاتا مقتطفات الغدة، والمكونات الفردية (أي البروتينات والببتيدات، ومركبات أخرى) من السائل المنوي يمكن اختبارها في نفس الطريق. آثار استلام مكونات السائل المنوي على وضع البيض يمكن قياسها كميا من حيث تواتر وضع البيض وتقديرات أكثر دقة من الأداء التناسلي للأنثى مثل أرقام بيضة داخل بيضة كل الجماهير. تظهر النتائج أن بروتينات السائل المنوي تؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى في هذه خنثى في وقت واحد، وتسليط الضوء على أهميتها لاختيار الجنسي.

ويبين الشكل 1 النسبة المئوية للحيوانات وضع البيض بعد الحقن مهبلى إما مادة التحكم (المالحة)، Ovipostatin، أو Ovipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. N = 15 لكل معاملة؛ انظر Koene وآخرون 16 للحصول على التفاصيل والإحصاءات (المصدر: الشكل 3 من Koene وآخرون 2010، بلوس وان). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. تأثير Ovipostatin على انتاج كميات كبيرة من البيض المنقعية الراكدة. ويبين الرسم البياني النسبة المئوية للحيوانات وضع البيض بعد الحقن مهبلى إما مادة التحكم (المالحة)، Ovipostatin، أو Ovipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. N = 15 لكل معاملة؛ انظر Koene وآخرون. 2010 تفاصيل وإحصاءات. طبع بإذن من Koene آخرون، 2010 بلوس وان 5: E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

تأثير الغدة ذكر ملحق المنتجات على وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

والطريقة موسع لل<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; تحديد النجاح في التزاوج أنثى الكركند الأمريكية (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Environment

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

الفصل الميكانيكية والسولوبيلية البروتين من الطبقات الفرعية Perivitelline الخارجي والداخلي من البيض الحنة

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Biochemistry

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Developmental Biology

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscience

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

نوعان من فحوصات الكشف عن الضفدع Chemoattraction الحيوانات المنوية

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

ككل جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em&gt; الراكدة المنقعية</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

توحيد طريقه غير مميته لتوصيف الحالة الانجابيه وتنميه اليرقات من بلح المياه العذبة (Bivalvia: النقابات)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

استئصال ساق العين لزيادة نضج المبيض في سرطان الطين

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

ذبابة الفاكهة تشريح الغدة الذكرية: طريقة لعزل الخلايا الثانوية

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

تأثير الغدة ذكر ملحق المنتجات على وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

والطريقة موسع لل