نشكر MR Helmus لأكثر من صوت، CM Popelier، S. Ypenburg وC. يفيسك للحصول على المساعدة الفنية. ويدعم هذا البحث ماليا من قبل المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO)، وهولندا الأكاديمية الملكية للفنون والعلوم (KNAW) ومنظمة خدمات الطلاب اليابان (JASSO). وأيد هذا المنشور من منحة النفاذ المفتوح من NWO إلى JMK.

1. مرفق تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات من المنقعية الكبار الراكدة (L.) من ثقافة المختبر مثل واحد في جامعة VU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على المياه المنخفضة النحاس عند 20 درجة مئوية في كل مرفق تربية (molluscarium) والدبابات التجريبية، التي لديها صرف المياه المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين دورة الضوء / الظلام في 12 ساعة: 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتربية، تغذية القواقع الكبار الخالية من المبيدات الحشرية بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية الخس، وإطعام الصغار مع الأحداث TetraPhyll (الأسماك) رقائق. الحفاظ على القواقع في خزانات منفصلة وفقا لسنهم، بدءا من كتل البيض التي وضعت ضمن إطار زمني 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تتم إزالة القواقع من الدبابات تربية لا عادوا، لتجنب آثار بعد أن تبقى في ظل ظروف مختلفة قليلا وكذلك لمنع pseudoreplication. </li></ol> 2. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل القواقع ل1 أسبوع، وإطعامهم الإعلان بالمال وبالشهرة أيضا، لضمان ثار لديهم الحيوانات المنوية الكامل ومخازن السائل المنوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر ستيريو، لوحة تشريح مع دبابيس، مقص جراحي صغير، ملقط الخشنة وغرامة، وهي مل حقنة مليئة 10 50 ملي MgCl 2 الحل، والإبر الحقن (0.3 ملم × 13 ملم) وبعض المناشف الورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحلزون عن طريق حقن MgCl 2 الحل (عادة 3 مل أو أكثر لالقواقع الكبار بطول قذيفة من 31.6 ± 2.1 ملم والوزن الرطب من 2.89 ± 0.55 غ). اختراق القدم مع إبرة الحقن في زاوية 45 درجة وحقن عن طريق تطبيق الضغط بلطف بشكل مستمر حتى يرتاح الحلزون ويبقى الموسعة (في غضون ثوان). إزالة إبرة الحقن وتحقق ما إذا كان الموت الرحيم الحلزون (على سبيل المثال، عن طريق فحص ما إذا كان رد الفعل اللامسة انسحاب غائب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية قذيفة التالية انحناء لها باستخدام ملقط الخشنة. في منتصف الطريق، فصل بلطف العضلات columellar من قذيفة عن طريق كشط مع ملقط. بلطف تحريف رانه الحلزون قوقعته من بعد الاتجاه المتعرج للقذيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحلزون على لوحة التشريح وحصره في نهاية الجزء الخلفي من القدم. ثم، وضع دبوس من خلال الرأس ووضع بعض التوتر على الحلزون لتسهيل تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توطين gonopore الإناث، والتي ستكون في وقت لاحق على نقطة مرجعية للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص جراحي وملقط غرامة، وجعل شق الأولى، فقط تحت حافة عباءة وقطع نحو gonopore الإناث. عند واحد من شفرات مقص &quot;يتم الضغط تحت جدار الجسم، ورفع عنه قليلا فقط لضمان أن جدار الجسم، وأيا من الأعضاء الداخلية، يتم قطع. مواصلة قطع فوق gonopore نحو الرأس وقطع في خط مستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توطين غدة البروستاتا (الخلفي) والحويصلات المنوية (الأمامي). تشريح هذه بعناية والاحتفاظ بها على الجليد. استخدام هذه الحلول لجعل اختبار تحتوي على السائل المنوي و / أو الحيوانات المنوية. استخدام الفسيولوجية المنقعية سالالمعهد الوطني للإحصاء (5.83 ملمول / لتر و CaCl 2 · 2H 2 O، 3.76 مليمول / لتر MgCl 2 · 6H 2 O، 42.69 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم، 37.53 مليمول / لتر بوكل) كوسيلة الناقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع السائل المنوي التي موجود في تجويف غدة البروستاتا وكذلك الحيوانات المنوية من الحويصلات المنوية. بعد ذلك، وقف كل من في المياه المالحة في قنينات منفصلة بالإعراب بلطف محتوياتها وإزالة الأنسجة الجهاز مع ملقط. الحفاظ على الجليد واستخدام نفس اليوم. في وقت لاحق، مزج هذه المعلقات لإنشاء حلول معاملة مختلفة. </li></ol> 3. مهبلى حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إجراء الحقن مهبلى، وإعداد السيليكون قذيفة العفن (مصنوعة لتناسب غيض من قذيفة)، 1 ملم المحاقن، 10-12 سم السيليكون الأنابيب التي يبلغ قطرها 1 مم، قلل الإبر الحقن (0.3 ملم × 13 ملم )، ملقط الخشنة ونفس 10 مل حقنة مليئة 50 ملي MgCl 2 الحل مزودة حقن إبرة حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحيوانات المنوية، وهناك حاجة لإضافة إلى السائل المنوي (أو فرد بروتينات السائل المنوي) في بعض العلاجات؛ جرعة ذات الصلة بيولوجيا يعادل 1/3 من غدة البروستاتا والحويصلة المنوية في الحقن. ملاحظة: في نتائج قسم ممثل (الشكل 1) وأظهرت نتائج تجربة مع ثلاثة علاجات مختلفة: التحكم (متوسطة الناقل، أي المياه المالحة)، Ovipostatin (واحد من البروتينات السائل المنوي المحددة) وحده، وOvipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. بالإضافة إلى ذلك، لتقدير الجرعات ذات الصلة بيولوجيا في الأنواع الأخرى، وتحديد الفرق في وزن غدة البروستاتا من الأفراد الذين تزاوج والأفراد التي بقيت معزولة جنسيا 16 في الآونة الأخيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل المحاقن لكل من حلول اختبار استعداد. ملء كل المحاقن مع حل واحد وضمان عدم وجود فقاعات هواء داخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب إبرة حقن اضعافها على كل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدام حقن 1مم أنبوب السيليكون بطول لا يقل عن 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة بعناية أنبوب السيليكون على إبرة الحقن، والتأكد من عدم اختراق أنبوب، وإزالة الهواء من الأنبوب بلطف من خلال تطبيق الضغط على حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحلزون باتباع نفس البروتوكول كما هو الحال في النقطة 2.3. هذه المرة تأكد من عدم ضخ أكثر من 2-3 مل من 50 ملي MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحلزون في وعاء العفن لإبقائه في وضع مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع gonopore الإناث، وهو أمر واضح كما بقعة بيضاء على الجانب الأيمن للحيوان، الأمامي إلى اللامسة الحق وgonopore الذكور بشكل واضح (وينطبق هذا الموقع أيضا إلى الأنواع الأخرى من القواقع في المياه العذبة). تأكد من أن يكون الوصول دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لعقد نهاية أنبوب السيليكون وبلطف إدراج ما يقرب من 2-4 ملم من أنبوب السيليكون في gonopore الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بعناية الضغط على حقنة وحقن 0.03 مل من محلول الاختبار. انتظر نصف دقيقةيوت للسماح للضغط في الأنبوب لتنتشر في المسالك الإناث قبل إزالة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الحلزون المعالجة إلى حاوية عزلتها، حيث يمكن رصدها، والسماح لها للتعافي من التخدير في خزان التجريبية. </li></ol> 4. الأحيائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كل الحلزون لتحديد وقياس طول غلافه. وهذا الأخير يعد مؤشرا جيدا لحجم، والتي هي ذات الصلة عند قياس الناتج الإنجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء كل الحلزون معزولة في حاوية مل 460 الذي مثقبة للسماح لتبادل المياه داخل الخزان التجريبية. من المهم أن تضع كافة الحاويات في الاتجاه الصحيح، مع ثقوب في اتجاه تدفق المياه، للسماح لتبادل المياه بكفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الأحيائي، وإطعام القواقع بانتظام مع كمية قياسية من الخس. استخدام جولة، الناخس المعادن لخفض الخس. في هذا البروتوكول وتستخدم أقراص الخس من 19.6 سم 2، الذي يقترب من وجبل أنها الحد الأقصى يمكن أن يأكل في يوم واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كتلة البيض باستخدام الجانب المسطح من ملعقة وتتخلص من كتلة البيض من جدار الحاوية. استخدام الجانب ملعقة لجمع كتلة البيض. ملاحظة: كتل البيض كامد التي وضعت للتو لا يمكن أن تستخدم للمسح الضوئي (أنها تصبح شفافة في غضون ساعات قليلة بعد أن وضع). لأنواع نموذجية في هذا البروتوكول، المنقعية الراكدة، تحقق من وجود كتل البيض كل يوم، لأنها تنتج 2-3 كتل البيض في الأسبوع. وهذا يمكن أن تختلف في الأنواع الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح كتل البيض التي تم جمعها رقميا، وذلك باستخدام (كمبيوتر محمول) الكمبيوتر الذي يحتوي على برنامج تشغيل الماسح الضوئي، الماسح الضوئي سرير مسطح، وعلى نطاق ملليمتر القياسية، ملعقة، ونقل لوحات والبلاط والزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل كتلة البيض على لوحات نقل وتكرار حتى لوحات مليئة. في وقت لاحق، ربت الجماهير البيض الجاف على منشفة ورقية ونقلها على البلاط والزجاج في نفس الترتيب كما في لوحات نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل كل البلاط رأسا على عقب (وسوف كتل البيض التمسك البلاط والزجاج) ووضعه بعناية على الماسحة الضوئية المسطحة، فقط تحت نطاق ملليمتر. تطبيق قليلا من الضغط لشد الجماهير البيض، والتي سوف توزع بالتساوي البيض بحيث تكون مرئية فقط داخل الطائرة التركيز نفسه. تناسب البلاط مع كمية قياسية من الشريط حول حواف اثنين للتأكد من أن كل البيض يتم بالارض على قدم المساواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات الماسح الضوئي. من المهم لضبط القرار إلى الحد الأقصى، وجعل معاينة المسح الضوئي، والمحاصيل مجال العمل، وضبط السطوع والتباين. مسح كتل البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل البيض في الكتلة الخاصة صفت 20 مل قارورة من الزجاج من أجل مزيد من التطوير والفقس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث المياه في قوارير التفريخ كل يوم للحفاظ على الاوكسيجين بشكل صحيح. القيام بذلك وفقا لأرقام فقس البيض وحجم بالترتيب التالي: الصب / صب قبالة (أي سلحفاة صغيرة)، تفيض (بداية من الفقس)، واستخراج من الماء مع ماصة (سلحفاة صغيرة كثيرة). </li></ol> &lt;ع الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. قياس والعد بيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت بحرية المتاحة برمجيات تحليل صورة يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية) والمساعد العداد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مفتوحة يماغيج فضلا عن برنامج جداول البيانات لنقل البيانات ل. ثم فتح صورة ممسوحة ضوئيا من كتل البيض في ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المقياس باستخدام أداة التكبير للانتقال إلى النطاق ملليمتر. تكبير وضبط نافذة لل1 ملم إلى ملء الشاشة. رسم خط باستخدام أداة الخط الفاصل بين الخطين التي تشير إلى 1 ملم. انتقل إلى تحليل، وتعيين نطاق واسع. في القائمة المنبثقة يصبح الخيار طول قياس واضحة، وضبط المسافة معروف إلى 1 وحدة طول لمم. ضع علامة في المربع العالمية، وإغلاق النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين القياسات فضل (الطول، العرض، محيط) قبل الانتقال إلى تحليل، وضبط المقاييس من خلال تحديد المساحة والقطر فيريه في (الطول والعرض). انقر فوق موافق لتأكيد والاستمرار مع تحليل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس البيض، زويام في يوم بيضة من أول كتلة البيض الذي يحتاج إلى أن يقاس. ينصح التكبير من 800٪. ثم، وذلك باستخدام أداة رسم شكل بيضاوي بيضاوي الشكل بالضبط حول البيض، اضغط CTRL + D لرسم محيط على الصورة (لمنع قياس نفس البيض مرتين). ثم اضغط CTRL + M لتسجيل قياس خصائص البيضاوي (الطول، العرض، محيط)؛ يفتح الشاشة المنبثقة عرض القياسات. ملاحظة: لا يتم تطبيق استخدام الأداة بيضاوي الشكل لقياس البيض لجميع الأنواع. الأنواع مع البيض على شكل غير منتظم، استخدم التحديدات مرفوعة بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس العديد من البيض حسب الضرورة ثم قم بحفظ التدابير ما. XLS ورقة العمل. اختياريا، نسخ البيانات مباشرة في ورقة عمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد لاحقا البيض ضمن كتلة البيض، باستخدام نافذة العداد ووضع التهم يدويا في ورقة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، عد البيض الفردية في كتلة البيض بمساعدة الخلية مضادة في المكونات. لهذا، انتقل إلى بلج انس،ثم، تحليل وتحديد العداد الخلية. سوف نافذة العداد الخلية يطفو على السطح، والتحقق من &quot;إبقاء الأصلي&quot; مربع واضغط على &#39;تهيئة&#39;. تظهر نافذة جديدة مضادة، حدد أداة التقاطع من شريط الأدوات وحدد نوع العداد في القائمة العداد الخلية. عد البيض الفردية من خلال النقر على البيض الفردية في إطار مكافحة الخلية. مراقبة العد الكلي بجانب نوع العداد في القائمة العداد الخلية. نسخ هذا الرقم يدويا إلى جدول بيانات أو الحصول على النتائج عن طريق الضغط على النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعول الجماهير البيض متعددة داخل الحدث العد واحدة عن طريق إضافة أنواع مضادة، إذا لزم الأمر. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يبين بروتوكول المعروضة كيفية جمع السائل المنوي وكيفية اختبار هذه بطريقة ذات مغزى من الناحية البيولوجية. على الرغم من أن هذا الإجراء هنا يظهر البروستاتا باستخدام مستخلص الغدة، وأثر من البروتين النقي السائل المنوي احد ويمكن أيضا اختبار باتباع نفس الإجراء. من الواضح، في مثل هذه الاختبارات هو دائما حاسمة لتشمل الضوابط المناسبة (علاجات صورية) للتأكد من أن الإجراء و / أو متوسطة الناقل لا تؤثر على المعلمات في الأسئلة 14،16. باستخدام هذا الأسلوب، وقد تم بالفعل تبين أن هناك واحد من البروتين السائل المنوي، وهما Ovipostatin، التي تتوسط انخفاض في وضع البيض 14،16. هذا البروتين، ينتج في غدة البروستاتا ونقل خلال التزاوج مع الحيوانات المنوية، يمثل أول تتميز بالكامل المكون السائل المنوي في وقت واحد وخنثى لا، حتى الآن، لم تظهر أي تشابه البروتينات المعروفة. النتيجة التي مفادها أن Ovipostaالقصدير يقلل الإنتاج الضخم البيض في المتلقي يعزز العمل في وقت سابق تشير إلى أن المواد الموجودة في السائل المنوي قد تؤثر على وضع البيض 13-15. عن طريق تحويل مبالغ بيولوجيا ذات الصلة (انظر 3.2 16)، يمكن للمرء أن تبرهن بشكل مقنع أنه هو السائل المنوي البروتين، وليس وجود الحيوانات المنوية نفسها، التي تتوسط الحد الملحوظ في وضع البيض (الشكل 1). بالنظر إلى أن استلام المتكررة من السائل المنوي عن طريق التزاوج الطبيعي يزيد من الاستثمار في البيض 15، يصبح الآن ذات أهمية كبيرة لقياس البارامترات الأخرى من وضع البيض. بروتوكول قدمت يوفر الآن الأساليب اللازمة للقيام بذلك. على الرغم من أن تم العثور على أي أثر للOvipostatin على الفقس نجاح البيض الذي تضعه المتلقي 16، قد يكون هناك غيرها من البروتينات السائل المنوي التي تعمل بالتنسيق مع هذا البروتين. وبالتالي، المعلمات التي تحتاج إلى أن يكون كميا في هذا السياق - إلى جانب وضع أرقام التردد والبيض - وتشمل حجم البيض، hatcالوقت هينج والتنمية فقس البيض وفقس البيض حجم. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن ننظر إلى الآثار المترتبة على عمليات امرأة أخرى من وضع البيض، مثل تخزين الحيوانات المنوية والاستخدام، فضلا عن تخصيص الموارد نحو الإنجابية وظيفة الإناث والذكور 14،17. بوضوح، وطريقة عرض يستفاد منه في معالجة هذه القضايا متابعة، سواء في المنقعية الراكدة وغيرها من القواقع في المياه العذبة. باختصار، هذا المعرض التجارب باستخدام بروتوكول نقل البروتينات السائل المنوي تؤثر على الأداء التناسلي الأنثوي للمتلقي في هذه المنحرفين في وقت واحد. بالنظر إلى أن تناولت دراسات قليلة هذا، فإنه من المرجح أن يكون أكثر شيوعا في تسميد داخليا من المنحرفين وينعكس حاليا في الأدبيات العلمية. وخصوصا عندما يدرك المرء أن اختيار زميله قبل كوبولاتوري والمنافسة الحيوانات المنوية وقد ثبت أن تلعب دورا هاما في هذه المنحرفين 14، والتي highlighنهاية الخبر إمكانات ذكر مثل البروتينات الغدة الإكسسوارات التي سيتم اختيارها عن طريق الاتصال الجنسي في هذا النظام. أخيرا، يساعد هذا البحث لدعم الفكرة النامية التي بروتينات السائل المنوي لهما أهمية متساوية للالمنحرفين في وقت واحد كما هي بالنسبة للأنواع منفصلة تلاعب.

عند نقله، وعادة ما يرافق الحيوانات المنوية عن طريق السائل المنوي التي تنتجها الغدد التبعي الذكور. في حين لعب بعض مكونات السائل المنوي الأدوار في تغذية الحيوانات المنوية وتفعيل 1، والبعض الآخر تؤثر فسيولوجيا الإناث من أجل زيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة 2-4. ويتم اختيار هذه الآثار وخاصة بالنسبة لل، عن طريق الانتقاء الجنسي، عندما الأنواع غير منحل للغاية ولديه تخزين الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية كفاءة الهضم. في ظل هذه الظروف، تتنافس الجهات المانحة الحيوانات المنوية بشكل كبير للإخصاب البيض 5. في حين أن هناك أدلة وفيرة علائقية لأهمية المواد السائل المنوي للنجاح الإخصاب الذكور، دليل مباشر هو أكثر نادرة ولقد يفتش دراسات قليلة في تفاصيل التغيير الفسيولوجية و / أو المواد المعنية 6. في الأنواع ذات الجنسين منفصلة (أي الذكور والإناث؛ gonochorists) هناك عدد قليل من التحقيق جيدا نموذج SPECIوفاق عندما يتعلق الأمر تكوين السائل المنوي وآثارها. وتشمل الأمثلة على ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن 6، والبعوض والملاريا، والأنوفيلة الغامبية 7، وخنفساء الدقيق الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم 8. مثل هذه الدراسات السائل المنوي هي أكثر ندرة بكثير عندما يتعلق الأمر الأنواع التي هي خنثوي في وقت واحد (أي الأفراد وظيفيا الذكور والإناث في نفس الوقت)، على الرغم من هذا النمط من الاستنساخ هو شائع في جميع أنحاء المملكة الحيوانية 9. المثال خنثوي أبرز نقل مادة الغدة التبعي هو على الارجح اطلاق النار ما يسمى الحب والسهام في القواقع الأرض 2،10، حيث يتم نقل المادة من قبل الجهة المانحة عن طريق الحقن تحت الجلد الحيوانات المنوية 11،12، أي لا جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية. ولكن هناك العديد من المنحرفين المتزامنة التي نقل المنتجات التبعي الغدة الذكور جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية، ومثل الأنواع النموذج المستخدم هنا، والبركة العظيمة الحلزون المنقعية الراكدة. وقد أظهرت أبحاث سابقة بالفعل أن تلقي السائل المنوي يؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى من هذا النوع 13-15، ولقد تم تحديد العديد من البروتينات تشارك السائل المنوي 16،17. الهدف العام من هذا البروتوكول، والذي هو امتداد الطرق التي أعلن عنها في Koene 16 آخرون، هو اختبار آثار البروتينات السائل المنوي على معايير مختلفة من وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات. ويتم إنجاز ذلك عن طريق تشريح غدة البروستاتا (أي الغدة التبعي الذكور إنتاج السائل المنوي) من القواقع المانحة معزولة جنسيا من ثقافة المختبر القياسية. الثانية، يتم جمع الحيوانات المنوية المتبرع من الحويصلات المنوية ومصنوعة حلول معاملة مختلفة. بعد ذلك، يتم اختبار القواقع مخدرة وحقن intravaginally مع حل الاختبار (على سبيل المثال،البروستاتا غدة استخراج وحده والبروستاتا غدة مع استخراج الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية وحدها، متوسطة الناقل وحده). ومن ثم يتم رصد هذه القواقع اختبار للأيام التالية لأسابيع تحت الظروف القياسية، لتسجيل وضع البيض. يتم جمع كتل البيض، مسحها رقميا لحساب وقياس معايير مختلفة، ومن ثم وضعها في قارورة الفردية لتفقيس. بعد حوالي أسبوعين، يتم الاعتماد على سلحفاة صغيرة ومسحها رقميا. جميع بالاشعة، كل من كتل البيض وسلحفاة صغيرة، ثم يتم تحليلها باستخدام بحرية المتاحة حزمة برامج تحليل الصور. لهذا البروتوكول يستخدم سلالة المختبر من الحلزون بركة كبيرة، المنقعية الراكدة، والتي يتم تربيتها في جامعة VU في أمستردام. يخدم هذا النوع كنظام نموذج للتحقيق في أسئلة حول الانتقاء الجنسي والتكاثر في المنحرفين. حجم الحيوان كبير نسبيا يجعل من التجربة للوصول للغاية. بالإضافة إلى ذلك، لأنه يستخدم كنوع النموذج في كثير من بالتخصصات iological نحن نعرف بالفعل الكثير عن بيولوجيا الأساسية لهذه الحيوانات. وهذه الطريقة تساعد على دراسة تساؤلات حول عمليات الانتقاء الجنسي التي يتم بوساطة بروتينات السائل المنوي عن طريق بصفة عامة. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه هي المنحرفين في وقت واحد، فمن الممكن لمعالجة ما إذا كانت هذه البروتينات تعمل بطرق مشابهة و / أو مختلفة كما هو الحال في الأنواع حيث يتم فصل الجنسين 16،17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

في تسميد داخليا الحيوانات، وعادة ما أضيف السائل المنوي إلى الحيوانات المنوية، وتشكيل معا المني أو السائل المنوي. إلى جانب الحيوانات المنوية مغذية وتفعيل، يمكن للمكونات في السائل المنوي تؤثر أيضا على علم وظائف الأعضاء الإناث لزيادة نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية المانحة. في حين أفادت العديد من الدراسات هذه الآثار في الأنواع مع الجنسين منفصلة، ​​وقد تناولت دراسات قليلة في هذا خنثوي الحيوانات في وقت واحد. ويعرض هذا البروتوكول الفيديو وسيلة لدراسة آثار السائل المنوي في الرخويات، وذلك باستخدام المياه العذبة الحلزون خنثوي في وقت واحد، والبركة الحلزون كبيرة المنقعية الراكدة، والنموذج الحي. في حين يظهر الإجراء باستخدام كاملة البروستاتا مقتطفات الغدة، والمكونات الفردية (أي البروتينات والببتيدات، ومركبات أخرى) من السائل المنوي يمكن اختبارها في نفس الطريق. آثار استلام مكونات السائل المنوي على وضع البيض يمكن قياسها كميا من حيث تواتر وضع البيض وتقديرات أكثر دقة من الأداء التناسلي للأنثى مثل أرقام بيضة داخل بيضة كل الجماهير. تظهر النتائج أن بروتينات السائل المنوي تؤثر على الانتاج التناسلي للأنثى في هذه خنثى في وقت واحد، وتسليط الضوء على أهميتها لاختيار الجنسي.

ويبين الشكل 1 النسبة المئوية للحيوانات وضع البيض بعد الحقن مهبلى إما مادة التحكم (المالحة)، Ovipostatin، أو Ovipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. N = 15 لكل معاملة؛ انظر Koene وآخرون 16 للحصول على التفاصيل والإحصاءات (المصدر: الشكل 3 من Koene وآخرون 2010، بلوس وان). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. تأثير Ovipostatin على انتاج كميات كبيرة من البيض المنقعية الراكدة. ويبين الرسم البياني النسبة المئوية للحيوانات وضع البيض بعد الحقن مهبلى إما مادة التحكم (المالحة)، Ovipostatin، أو Ovipostatin ترافق مع الحيوانات المنوية. N = 15 لكل معاملة؛ انظر Koene وآخرون. 2010 تفاصيل وإحصاءات. طبع بإذن من Koene آخرون، 2010 بلوس وان 5: E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

تأثير الغدة ذكر ملحق المنتجات على وضع البيض في بطني الأرجل الرخويات

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

ككل جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em&gt; الراكدة المنقعية</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...