يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العملية التي يتم من خلالها تحويل مجموعة أوسع من بروتينات السلائف المنفصلة ، بما في ذلك أفراد عائلة TGF-beta ، إلى بروتينات نشطة بعد الانقسام البروتيوليكي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يوفر أساليب سريعة جدا وغير مكلفة للحصول على المنتج TGF بيتا الانقسام عالية التركيز في الجسم الحي في ظل حالة تصور. في البداية ، بعد الحقن في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول Ficoll وأي أجنة ميتة أو تحتضر ، ثم شطف الأجنة مرة أو مرتين مع MBS وزراعة الأجنة في MBS على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة أو عند 16 درجة مئوية في الحاضنة لإبطاء التطور.
الحرارة وسحب الشعيرات الدموية الزجاج إلى نقطة غرامة باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات المطلوبة. باستخدام ملقط، مقطع قبالة غيض من إبرة سحبت. لمنع انسداد, يجب أن يكون فتح إبرة طموح blastocele أكبر من إبرة microinjection.
أدخل إبرة الشفط في حامل الإبرة المتصل بالمزلق الدقيق واربط حامل الإبرة بالميكرومانيبواتور. ضع أجنة مرحلة الغازترولا في وقت مبكر إلى منتصفها في صينية حقن مملوءة ب MBS أو طبق. أدخل الإبرة أسفل سطح الجنين بالقرب من القطب الحيواني.
اضغط على زر التعبئة على المحقن الدقيق أثناء مراقبة الإبرة والجنين من خلال مجهر تشريح. على مدى بضع ثوان ، يرتفع مستوى السائل الواضح في الإبرة وينهار الجنين ويصبح مقعرا. نبض زر الحقن مرة واحدة أو أكثر لإخراج أي مادة بيضاء غائمة تدخل الإبرة التي تحتوي على الحطام أو proteases.
للكشف عن المنتجات الانقسام على مناعة، يستنشق السائل الكيسي من 10 إلى 20 جنينا أو أكثر اعتمادا على الأجسام المضادة. ماصة واحدة ميكرولتر من الماء الخالي من النواة على قطعة البارافين وضعت على صينية الحقن. غمر الإبرة في قطرة الماء واضغط على زر الحقن لتبديل سائل الكيسة الأريمية في الماء.
بدلا من ذلك، لإخراج السائل مباشرة على البارافيلم ومنعه من تسطيح بها، نبض زر الحقن لطرد السائل تحت ضغط أقل. نقل السائل blastocele حصادها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق العقيمة على الجليد وإضافة المياه الخالية من النواة لضبط حجم النهائي إلى 30 ميكرولتر. للكشف عن بروتينات السلائف TGF-beta، قم بنقل أجنة سائل الكيسة الأريمية المستنفدة إلى أنبوب منفصل على الجليد.
إزالة MBS الزائدة وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة قبل lysate الجنين المبردة. لتجانس الأجنة بشكل كامل، ماصة صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرة حتى لا تبقى كتل. الطرد المركزي الأجنة المتجانسة في جهاز الطرد المركزي المبردة في 10،000 مرة G لمدة 10 دقائق، ثم إزالة 160 ميكرولتر من supernatant باستخدام ماصة P200 ونقلها إلى أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب بروتينات صفار البيض وغيرها من الحطام الخلوي في النصف السفلي من الأنبوب.
كرر الطرد المركزي الدقيق مرة واحدة ونقل 128 ميكرولتر من الفائقة واضحة إلى أنبوب جديد على الجليد. عند هذه النقطة، يمكن تخزين lysates الأجنة تطهيرها والسوائل blastocele التي تم جمعها في ناقص 80 درجة مئوية لطالما رغبت في ذلك. Deglycosylate البروتينات المشقوقة الموجودة في سائل الكيسة الأريمية المعدلة من خلال شبكة ترانس غولجي مع PNGase F باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
وهاجر المنتجات deglycosylated كشريط أكثر كثافة على المواد الهلامية SDS، والتي يمكن أن تساعد في تحديد دقيق. لتقييم مونومرات جزء البرودمين والبروتينات التي تكشفت في blastocele وlysate، وتحليل البروتينات في ظل ظروف الحد من خلال إضافة خمسة ميكرولترات من الحد من العازلة عينة 4X إلى 15 ميكروليتر سائل الكيسة الأريمية و 15 ميكرولتر من lysate الجنين أوضح. لتقييم تشكيل المشقوقات المشقوقة أو الليجانات الهتيريوديميرية في الأريميوسيلي ، قم بتحليل البروتينات في ظل ظروف غير متناقصة عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من العازلة عينة 4X غير المخفضة إلى ال 15 ميكرولتر المتبقية من سائل الأريميوكل ، ثم تسخينها لمدة خمس دقائق ووضعها على الجليد.
بعد استخدام هذا البروتوكول ، تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE وتم فحص الأجسام المناعية مع الأجسام المضادة التي تعرفت على علامة epitope myc. في ظل ظروف التخفيض ، في الليسات من الأجنة التي تعبر فقط عن Bmp4 أو Bmp7 ، تم اكتشاف نطاق واحد مقابل مونومر Bmp4 المشقوق و نطاق مهاجر أبطأ مقابل مونومرات Bmp7 المشقوقة. تم الكشف عن كلا النطاقين في الأجنة التي تشارك في التعبير عن Bmp4 و Bmp7.
عندما تم فصل البروتينات في ظل ظروف غير الحد، تم الكشف عن Bmp4 ناضجة واحدة و 7 نطاق heterodimer من التنقل المتوسط جنبا إلى جنب مع كمية ضئيلة من homodimer Bmp4 في الأجنة المشاركة في التعبير عن Bmp4 وBmp7. لوحظ أيضا تشكيل الهتروديمر Bmp4 وBmp7 عندما كانت مستويات البروتين Bmp7 عالية. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، شكلت Bmp7 الزائدة التجانس والأجنة التي أعرب عنها المشترك Bmp4 و Bmp7.
وأظهرت هذه النتائج أن Bmp4 و 7 شكل تفضيلي heterodimers عندما أعرب المشتركة في الأجنة Laevis Xenopus. في هذه التجربة، وجمع blastocele نقية هي الخطوة الأكثر أهمية التي تتطلب تجربة التعامل مع إبرة دقيقة. لذا استمر في المحاولة وإصلاح الأخطاء.
هذا الإجراء اختبارات ما إذا كان شكل الهيروديمير BMP والأحماض الأمينية التي هي مهمة لهذا الغرض. الخطوة التالية، يمكن أن تتولد الماوس knockin أن نسأل ما إذا كانت هذه الأحماض الأمينية مهمة وظيفيا أثناء تطور الثدييات.
