Biz teknik yardım için, ses için CM Popelier, S. Ypenburg ve C. Levesque MR Helmus teşekkür ederim. Bu araştırma, mali Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO), Fen ve Hollanda Kraliyet Akademisi (KNAW) ve Japonya Öğrenci Hizmetleri Örgütü (jasso) tarafından desteklenmektedir. Bu yayın JMK NWO Open Access hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Yetiştirme Tesisi <ol><li> VU Üniversitesi gibi bir laboratuvar kültür Lymnaea stagnalis (L.) erişkin örnekleri elde. </li><li> Sürekli su değişimi var damızlık tesisi (molluscarium) ve deneysel tanklarda, hem de 20 ° C&#39;de düşük bakır su koruyun. </li><li> 12 saat: 12 saatte aydınlık / karanlık döngüsünü ayarlayın. </li><li> Damızlık, yetişkin salyangoz pestisit içermeyen marul libitumdan beslemek TetraPhyll (Balık) gevreği ile genç gençlere beslemek. 24 saatlik zaman dilimi içinde serilir yumurta kitlelerden başlayarak, yaşlarına göre ayrı tanklarda salyangoz koruyun. </li><li> Salyangoz onlar etkileri önlemek için, iade edilir üreme tanklarından çıkarıldıktan sonra, hafifçe farklı koşullar altında hem de pseudoreplication önlemek için muhafaza edilerek. </li></ol> 2. Diseksiyon <ol><li> 1 hafta salyangoz izole ve tha sağlamak için, ad libitum beslemekt onlar tam sperm ve seminal sıvı mağaza var. </li><li> Bir stereo mikroskop, iğneli bir diseksiyon plaka, küçük bir cerrahi makas, kaba ve ince forseps, 50 mM MgCl2 çözeltisi, enjeksiyon iğneleri (0.3 mm x 13 mm) ve bir kağıt havlu ile doldurulmuş bir 10 ml şırınga hazırlayın. </li><li> MgCl (31.6 ± 2.1 mm ve ıslak ağırlığı 0.55 g ± 2.89 arasında bir kabuk uzunluğu ile erişkin salyangoz genelde 3 ml veya daha fazla) 2 solüsyonu enjekte tarafından bir salyangoz Euthanize. 45 ° açıyla enjeksiyon iğnesi ile ayak nüfuz ve salyangoz rahatlatır ve (saniyeler içinde) uzatılmış kalana kadar yavaşça sürekli basınç uygulanarak enjekte. Enjeksiyon iğnesi çıkarın ve salyangoz (tentacle geri çekilme refleksi yoktur olup olmadığını kontrol ederek, örneğin) ötenazi olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Dikkatle kaba forseps kullanarak kendi eğrilik aşağıdaki kabuk kaldırmak. Yarım, hafifçe forseps ile kazıyarak kabuğundan columellar kas ayırmak. Yavaşça t bükümo kabuğun sarma yönünü takip, kabuğundan dışarı salyangoz. </li><li> Diseksiyon plaka üzerinde salyangoz yerleştirin ve ayağın arka ucunu aşağı pin. Sonra, kafasına bir iğne yerleştirin ve diseksiyonu kolaylaştırmak için salyangoz bazı gerginlik koydu. </li><li> Daha sonra diseksiyon için bir referans noktası olacaktır kadın gonopore, lokalize. </li><li> Cerrahi makas ve ince forseps kullanarak, sadece manto kenarı altında, ilk kesi yapmak ve kadın gonopore doğru kesti. Makas &#39;kanatlarının biri beden duvarının altında itildiğinde, sadece vücut duvarı ve iç organların hiçbiri, kesilmiş olduğundan emin olmak için hafifçe yukarı kaldırın. Kafasına doğru gonopore yukarıdaki kesme devam edin ve düz bir çizgide kesti. </li><li> Prostat bezi (posterior) ve seminal (anterior) yerelleştirilmesine. Bunları dikkatle incelemek ve buz üzerinde saklayın. Seminal sıvı ve / veya sperm içeren test çözümler yapmak için bu kullanın. Fizyolojik Lymnaea sal kullanınine (5.83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3.76 mmol / L MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37.53 mmol / L KCl) bir taşıyıcı ortam olarak. </li><li> Prostat bezinin lümeni hem de seminal veziküller gelen sperm mevcut olan meni toplayın. Daha sonra, yavaşça onların içeriğini ifade ve bir forseps ile organ dokusuna kaldırarak ayrı şişelerde tuzlu hem de askıya. Buz üzerinde tutmak ve aynı gün kullanın. Daha sonra, farklı tedavi çözümleri oluşturmak için bu süspansiyonlar karıştırın. </li></ol> 3.. İntravajinal Enjeksiyon <ol><li> Vajina içi enjeksiyon işlemi başlamadan önce, (kabuğun uç uyacak şekilde yapılmış) bir silikon kabuk kalıp hazırlanması, 1 mm şırınga, 1 mm bir çapa sahip, 10-12 cm silikon boru, (enjeksiyon iğneleri köreltilmiş 0.3 mm x 13 mm ), iri forseps ve keskin bir enjeksiyon iğnesi ile donatılmış bir 50 mM MgCl2 çözeltisi ile doldurulmuş 10 ml aynı şırınga. </li><li> Bazı tedavilerde seminal sıvı (ya da bireysel seminal sıvı proteinler) eklemek için gerekli sperm, toplayın; Bir biyolojik olarak uygun bir doz bir prostat ve seminal vezikül enjeksiyon başına arasında 1/3 eşittir. NOT: temsilcisi sonuç bölümünde (Şekil 1) üç farklı tedaviler ile deney sonuçları gösterilmiştir: Kontrol yalnız (taşıyıcı ortam, yani tuzlu su), Ovipostatin (tespit seminal sıvı proteinlerden biri) ve Ovipostatin sperm ile eşlik etti. Buna ek olarak, diğer türlerdeki biyolojik olarak uygun doz tahmin etmek için, son şeklindeki 16 ve cinsel yolla izole kalmış kişiler kişilerin prostat bezinin ağırlık farkı ifade eder. </li><li> Hazırlanan test çözeltileri her biri için 1 ml şırınga hazırlayın. Tek çözümü ile her şırınga doldurun ve içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> Her şırınga Köreldiğini enjeksiyon iğnesi takın. </li><li> Enjeksiyonu 1 kullanın10 sm bir minimum uzunluğa sahip mm çaplı silikon tüp. </li><li> Dikkatle tüpü delmek için değil emin olun, enjeksiyon iğnesi üzerinde silikon tüp kaydırın ve yavaşça şırınga basınç uygulayarak tüpten havayı çıkarın. </li><li> Noktası 2.3 ile aynı protokolü izleyerek bir salyangoz uyuşturan. Bu kez 50 mM MgCl2 fazla 2-3 ml enjekte etmek değil emin olun. </li><li> Sabit bir pozisyonda tutmak için kabuk-kalıba salyangoz yatıyordu. </li><li> (Bu konum aynı zamanda tatlı su salyangoz diğer türler için de geçerlidir) açıkça doğru tentacle ve erkek gonopore için hayvan, anterior sağ tarafında beyaz bir nokta olarak görülebilir kadın gonopore, bulun. Engelsiz erişim için emin olun. </li><li> Silikon tüpün ucunu tutun ve yavaşça dişi gonopore içine silikon tüp yaklaşık 2-4 mm eklemek için bir forseps kullanın. </li><li> Dikkatlice şırıngayla basınç uygulanır ve test çözeltisi 0.03 ml enjekte edilir. Yarım dakika bekleyinTüpü çıkarmadan önce dişi yolu içine yaymak için boru içindeki basıncın izin vermek için katkı sağlayacaktır. </li><li> O izlenebilir onun izolasyon, kapsayıcı, işlenmiş salyangoz dönün ve deneysel tankında sedasyon kurtarmak için izin verir. </li></ol> 4. Biyoassay <ol><li> Tanımlama için her salyangoz Etiket ve kabuk uzunluğu ölçer. İkincisi üreme çıktı hesaplarken alakalı boyutu, iyi bir göstergedir. </li><li> Deney tankı içinde su değişimi sağlamak için delikli bir 460 ml kap içinde her bir salyangoz izole edin. Bu, etkili bir su değişimi sağlamak için, suyun akış yönünde delikleri olan, doğru yönde kapları yerleştirmek önemlidir. </li><li> Biyoassay sırasında, marul standart bir miktarda düzenli salyangoz beslemek. Marul kesmek için yuvarlak, metal zımba kullanın. Bu protokolde 19.6 cm 2 marul diskleri a yaklaştığı, kullanılanonlar en fazla bir gün yiyebilirsiniz montaj. </li><li> Bir spatula düz tarafı kullanarak bir yumurta kitle toplamak ve konteyner duvardan yumurta kütlesi kazıyın. Yumurta kitle toplamak için kaşık tarafını kullanın. NOT: Sadece atılmıştır Opak yumurta kitleler (onlar döşeme sonra birkaç saat içinde saydam hale) Tarama için kullanılan olamaz. Onlar haftada 2-3 yumurta kitleleri üretmek için bu protokolü modeli türler için, Lymnaea stagnalis, her gün yumurta kitleler için kontrol edin. Bu, diğer türlerinde farklılık gösterebilir. </li><li> Tarayıcı sürücüsünü içeren bir (dizüstü) bilgisayar, bir düz yatak tarayıcı, standart bir milimetre ölçek, bir spatula, tabak ve cam karoları kullanarak, dijital toplanan yumurta kitleleri tarayın. </li><li> Transfer plakaları her yumurta kitle yerleştirin ve plakaları tam kadar tekrarlayın. Daha sonra, yumurta kitleler kağıt havlu üzerinde hafifçe dokunmak kurutmak ve aktarma kalıplarda olduğu gibi aynı sırada cam karo üzerine aktarın. </li><li> (Baş aşağı her karo çevirinyumurta kitleler cam karo sopa) ve dikkatle sadece milimetre ölçeği altında, flatbed tarayıcıya yerleştirin olacaktır. Hepsi aynı odak düzlemi içinde görünür böylece eşit yumurta dağıtacak olan yumurta kitleleri düzleştirmek için basınç biraz uygulayın. Tüm yumurtalar eşit basık olduğunu sağlamak için iki kenarlarında bir bant standart miktarda karoları Fit. </li><li> Tarayıcı ayarlarını ayarlayın. Bu, onun maksimum çözünürlüğü ayarlamak bir önizleme taraması yapmak, çalışma alanı kırpma ve parlaklık ve kontrastı ayarlamak için önemlidir. Yumurta kitleleri tarayın. </li><li> Daha da geliştirilmesi ve kuluçka için kendi etiketli 20 ml bir cam şişe içinde, her yumurta kitle yerleştirin. </li><li> Düzgün oksijenli tutmak için her gün şişeleri kuluçka suyu yenileyin. Aşağıdaki sırayla yavru sayı ve büyüklüğüne göre bu yapın: (hayır yavru) dökülen / boşaltılarak (kuluçka başlangıcını) taşan ve bir pipet (birçok yavru) ile suyu dışarı çıkarmak. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Yumurta Ölçme ve Sayma <ol><li> Özgürce kullanılabilir görüntü analiz yazılımı ImageJ (NIH, ABD) ve hücre sayaç eklentisini yükleyin. </li><li> Açık ImageJ yanı sıra veri aktarmak için bir elektronik tablo programı. Sonra ImageJ yumurta kitlelerin taranmış bir resim açın. </li><li> Milimetre ölçeğine gitmek için zoom aracını kullanarak ölçeği ayarlayın. Yakınlaştırmak ve ekranı doldurmak için 1 mm penceresini ayarlamak. 1 mm belirtmek iki çizgi arasındaki satırı aracını kullanarak bir çizgi çizin. Analiz gidin ve ölçeğini ayarlayın. Açılır menüde ölçülen uzunluk seçeneği 1 olarak bilinen mesafeyi ayarlamak ve uzunluk birimi mm, görünür hale gelir. Kutu Küresel kontrol edin ve pencereyi kapatın. </li><li> Analiz gezinme tarafından tercih edilen ölçümler (uzunluk, genişlik, çevresi) ayarlayın ve Alan ve Feret Çapı (uzunluk ve genişlik) seçerek Ölçümleri ayarlayın. Onaylamak ve görüntü analizleri ile devam etmek için Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Yumurta ölçmek için, zoölçülmesi gerekiyor ilk yumurta kütlesinin bir yumurta üzerinde om. % 800 bir zoom tavsiye edilir. Ardından, eliptik alet tam yumurta, ctrl etrafında bir oval çizin kullanarak + D (iki kez aynı yumurta ölçme önlemek için) görüntü üzerinde çevresini çizin. Sonra oval (uzunluk, genişlik, çevresi) özelliklerinin ölçümünü kaydetmek için ctrl + M tuşuna basın; Bir pop-up ekran ölçümlerini görüntüleyerek açılır. NOT: yumurta ölçmek için eliptik araç kullanımı tüm türler için geçerli değildir. Homojen olmayan şekilli yumurta olan türler için, bunun yerine serbest seçimleri kullanın. </li><li> Gerektiği kadar çok yumurta ölçün ve sonra. Xls çalışma sayfası olarak tedbirleri kaydedin. İsteğe bağlı olarak, doğrudan bir çalışma sayfasına verileri kopyalamak. </li><li> Daha sonra sayaç penceresini kullanarak, bir yumurta kitle içinde yumurta sayısı ve manuel çalışma içine sayıları koydu. </li><li> Alternatif olarak, hücre sayacı plug-in yardımı ile yumurta kütlesi başına birey yumurtaları saymak. Bunun için, Plug-ins gidinDaha sonra, analiz ve Hücre sayacı seçin. Hücre sayacı penceresi &#39;başlatmak&#39; kutusunu ve basın &#39;orijinal tutmak&#39; kontrol açılır. Yeni bir sayaç penceresi araç çubuğundan crosshair aracını seçin ve hücre sayacı menüsünde bir sayaç türü seçin, görünür. Hücre sayacı penceresinde tek yumurta tıklayarak tek tek yumurtaları saymak. Hücre sayacı menüsünden sayaç türünün yanındaki toplam sayısını dikkate alınız. Bir e-tabloya elle bu numarayı kopyalamak veya Sonuçlar basarak sonuç elde. </li><li> Gerekirse, sayaç türleri ekleyerek tek sayma olay içinde birden fazla yumurta kitleleri saymak. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sunulan protokol seminal sıvı ve nasıl bir biyolojik olarak anlamlı bir şekilde bu test toplamak için nasıl gösterir. Burada bu yöntem, prostat bezi ekstraktı kullanılarak gösterilmiş olmasına rağmen, bir tek saflaştırılmış seminal sıvı proteinin etkisi de aynı prosedür izlenerek test edilebilir. Açıktır ki, bu gibi testlerde bu prosedür ve / veya taşıyıcı ortam soru 14,16 parametreleri etkilemez sağlamak için uygun kontroller (sham tedavileri) eklemek için her zaman çok önemlidir. Bu yöntem kullanılarak, daha önce 14,16 yumurta koyan bir azalmaya aracılık eden bir tek seminal akışkan protein, yani Ovipostatin, olduğu gösterilmiştir. Prostat bezinde üretilir ve sperm ile birlikte çiftleşme sırasında transfer bu protein, bir eş zamanlı hermafrodit ilk olarak tam anlamıyla karakterize seminal sıvı bileşenini ifade eder, ve şu ana kadar bilinen proteinlere herhangi bir benzerlik göstermez. Bulgu Ovipostakalay alıcı yumurta seri üretim meni içindeki maddeler 13-15 döşeme yumurta etkileyebileceğini belirten daha önceki çalışmaları doğrular azaltır. Biyolojik ilgili miktarları aktararak (3.2 16 bakınız), bir ikna edici bu yumurtada gözlenen azalma döşeme (Şekil 1) aracılık eden seminal sıvı protein değil, sperm varlığı kendileri olduğunu gösterebilir. Doğal çiftleşmelerin yoluyla seminal sıvı tekrarlanan makbuz yumurta başına 15 yatırımı artırır göz önüne alındığında, artık yumurtlamanın diğer parametreleri ölçmek için son derece uygun olur. Sunulan protokol şimdi bunu yapmak için gerekli yöntemleri sağlamaktadır. Hiçbir etkisi alıcı 16 tarafından atılmıştır yumurta başarısını kuluçkalık Ovipostatin bulundu rağmen, bu protein ile uyum içinde hareket diğer seminal sıvı protein olabilir. Dolayısıyla, bu bağlamda değerlendirilmesi gerekir parametreleri - Bir sonraki frekansı ve yumurta sayıları döşeme - yumurta büyüklüğü, hatc dahilhing zaman, yavru geliştirme ve yavru boyutu. Buna ek olarak, bu tür sperm depolama ve kullanım yanı sıra, erkek ve dişi üreme fonksiyonunun 14,17 karşı kaynak tahsisi gibi yumurtlama dışında dişi süreçleri, etkilerine bakmak mümkündür. Açıkçası, sunulan bir yöntem Lymnaea stagnalis ve diğer tatlı su salyangozları, hem bu izlem konuların ele vesile oluyor. Özetle, seminal sıvı proteinleri aktarılan bu protokolü show kullanarak deneyler bu eşzamanlı çift cinsiyetli alıcının kadın üreme performansını etkileyebilir. Birkaç çalışmada bu ele sahip olduğu göz önüne alındığında, çok daha yaygın şu anda bilimsel literatürde yansıtılır daha dahili çift cinsiyetli gübreleme olması muhtemeldir. Bir ön-çiftleşme arkadaşı seçimi ve sperm rekabet, bu çift cinsiyetli 14, önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir olduğunu fark Özellikle hangi highlights bu tür erkek donatım bez proteinlerin potansiyel cinsel bu sistemde seçilmelidir. Son olarak, bu araştırma bunlar ayrı-cinsiyetli türler için olduğu gibi seminal sıvı proteinler aynı anda çift cinsiyetli için eşit öneme sahip olduğu, gelişmekte fikrini desteklemeye yardımcı olur.

Devirden sonra spermler genellikle erkek aksesuar bezleri tarafından üretilen seminal sıvı eşlik ediyor. Bazı söyleyivermek bileşenler besleyici ve aktive sperm 1 rol oynarken, diğerleri sperm donör 2-4 fertilizasyon başarısını artırmak amacıyla kadın fizyolojisini etkileyebilir. Bir tür çok karışık ve etkili sperm depolama ve sindirim sperm olduğunda Bu etkiler, özellikle de cinsel seçimi ile, için seçilir. Bu koşullar altında, sperm donör yumurta 5 döllenme için yoğun rekabet. Erkek döllenme başarı için seminal sıvı maddelerin önemi bol correlational kanıtlar olsa da, doğrudan bir kanıt daha nadirdir ve birkaç çalışma fizyolojik değişikliği ve / veya 6 katılan maddelerin ayrıntıları dalmıştır var. Türlerin ayrı cinsiyette (yani, erkek ve kadın; gonochorists) ile bir kaç iyi araştırılmış bir model speci vardırBu seminal sıvı bileşimi ve etkileri söz konusu olduğunda es. Örnekler, meyve sineği, Drosophila melanogaster 6, sıtma sivrisinek, Anopheles gambiae 7 ve kırmızı un böceği, Tribolium castaneum 8 bulunmaktadır. Bu üreme bu mod hayvanlar aleminin 9 boyunca yaygın olsa bile, (yani, bireyler aynı zamanda işlevsel erkek ve kadın) aynı anda çift cinsiyetli olan türler söz konusu olduğunda bu tür meni çalışmalar çok nadirdir. Bir aksesuar bez maddenin transferi en önemli hermaphroditic örneği muhtemelen madde derialtı enjeksiyon 11,12, yani, değil yoluyla sperm donör tarafından aktarılır kara salyangoz 2,10, sözde aşk-dart çekim olduğunu sperm ile birlikte. Ama sperm ile birlikte erkek aksesuar bez ürünleri transferi aynı anda pek çok çift cinsiyetli vardırgibi burada kullanılan modeli türler gibi, büyük gölet Lymnaea stagnalis salyangoz. Önceki araştırma zaten seminal sıvı alınması bu türlerin dişi üreme çıkışını 13-15 etkilediğini ortaya koymuştur ve ilgili seminal sıvı proteinlerin birkaç 16,17 tespit edilmiştir. Koene ark 16 bildirilen yöntemlerden bir uzantısı olan bu protokol, genel amacı, karındanbacaklı yumuşakçalar yumurtlama çeşitli parametreleri üzerindeki seminal sıvı proteinlerin etkisini test etmektir. Bu, prostat bezi (yani, seminal sıvı üreten erkek donatım bez) standart bir laboratuvar kültürden izole edilmiş cinsel verici salyangoz arasında diseksiyon ile gerçekleştirilir. İkincisi, donörün sperm seminal keseciklerin toplanan ve farklı tedavi çözümleri yapılır. , Daha sonra, deney anestezi salyangoz ve intravajinal, örneğin bir test solüsyonu (enjekteYalnız prostat bezi özü, sperm ile prostat bezi özü, yalnız sperm, yalnız taşıyıcı orta). Bu test salyangoz sonra yumurtlama kaydetmek için, standart koşullar altında, hafta için aşağıdaki gün izlenir. Yumurta kitleler dijital sayma ve çeşitli parametreleri ölçmek için taranmış, toplanmış ve daha sonra kuluçka için ayrı ayrı şişelere konur. Yaklaşık iki hafta sonra, yavru sayıldı ve dijital olarak taranır. Yumurta kütleleri ve yavru hem de tüm taramalar, daha sonra, bir serbest mevcut görüntü analiz yazılım paketi kullanılarak analiz edilmiştir. Bu protokol için büyük gölet salyangoz, Lymnaea stagnalis, laboratuvar suşu Amsterdam VU Üniversitesi yetiştirilmiş, hangi kullanılır. Bu tür cinsel seçimi ve çift cinsiyetli üreme hakkında sorular araştırmak için bir model sistem olarak hizmet vermektedir. Hayvanın görece büyük boyutlu deneysel çok erişilebilir hale getirir. İlave olarak, bir çok b tür bir model olarak kullanılıriological disiplinler biz zaten bu hayvanların temel biyolojisi hakkında çok şey biliyorum. Bu yöntem genel olarak seminal sıvı proteinler aracılığıyla olur cinsel seçilim süreçleri hakkında çalışma soruları için yardımcı olacaktır. Bu eş zamanlı çift cinsiyetli olduğu için ek olarak, bunların cinste 16,17 ayrılır türlerde olduğu gibi bu proteinler olarak benzer ve / veya farklı şekillerde hareket olup ele mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

Içten hayvanlar gübreleme seminal sıvı genellikle birlikte sperm veya meniyi oluşturan, sperm eklenir. Besleyici ve aktive sperm yanı sıra, seminal sıvı içindeki bileşenler de sperm donörün fertilizasyon başarısını artırmak için dişi fizyolojisi etkileyebilir. Birçok çalışma ayrı cinste olan türlerde böyle etkileri olduğu bildirilmiştir ederken, birkaç çalışmaların eşzamanlı hermaphroditic hayvanlarda bu ele sahip. Bu video protokol model organizma olarak bir anda hermafrodit tatlı su salyangozu, büyük gölet salyangoz Lymnaea stagnalis kullanarak, gastropodlar seminal sıvı etkilerini incelemek için bir yöntem sunar. Prosedür tamamlandıktan prostat bezi özleri kullanılarak gösterilmişse de, ayrı ayrı parçalar seminal sıvı (örneğin, proteinler, peptidler ve diğer bileşikler) aynı şekilde test edilebilir. Yumurtlama tarihinde ejekulat bileşenlerinin alınmasından etkileri yumurtlama sıklığı açısından sayısal edilebilirBöyle her bir yumurta kitleleri içinde yumurta sayı olarak kadın üreme performansının daha ince tahminleri. Sonuçlar seminal sıvı proteinler cinsel seçimi için önemini vurgulayarak, bu eşzamanlı hermafrodit kadın üreme çıkışını etkilediğini göstermektedir.

Şekil 1, bu madde kontrol (tuzlu su) ya da vajinal yolla enjeksiyondan sonra yumurta hayvanların yüzdesini gösterir, Ovipostatin veya Ovipostatin sperm ile birlikte. N, her tedavi için 15 =; . detayları ve istatistikleri için Koene ark 16 (bakınız Kaynak:. Koene ark 2010, PLoS ONE itibaren Şekil 3). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. Lymnaea stagnalis yumurta seri üretimine Ovipostatin Etkisi. Grafiği kontrol madde (tuz) ya da vajinal yolla enjeksiyonundan sonra yumurta atma hayvanların yüzdesini gösterir Ovipostatin veya Ovipostatin sperm ile eşlik etti. N, her tedavi için 15 =; Koene ark bakın. 2010 detayları ve istatistikleri. Koene ark izni ile yeniden yazdırın 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Gastropod Molluskların Yumurta döflenmesi erkek Aksesuar Bezi Ürünlerinin Etkisi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Görüntüleme.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Biyoloji

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Whole Dağı<em&gt; In Situ</emGastropoda yumuşakça için&gt; Hibridizasyon Yöntemi<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...