Agradecemos MR Helmus para o voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque para assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), a Academia Real Holandesa de Artes e Ciências (KNAW) ea Organização Student Services Japan (JASSO). Esta publicação foi apoiada por uma bolsa de Acesso Aberto de NWO para JMK.

1. Criatório <ol><li> Obter espécimes adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de uma cultura de laboratório como o da Universidade VU. </li><li> Manter a água baixo teor de cobre a 20 ° C, tanto no criatório (molluscarium) e tanques experimentais, que têm troca de água contínuo. </li><li> Definir o ciclo claro / escuro de 12 horas: 12 horas. </li><li> Para reprodução, alimentar os caramujos adultos sem pesticidas ad libitum alface, alimentar os jovens juvenis com TetraPhyll (alimentos peixes) flocos. Manter caramujos em tanques separados de acordo com sua idade, a partir de massas de ovos que são colocados dentro de um prazo de 24 horas. </li><li> Uma vez que os caracóis são removidas dos tanques de criação não são devolvidas, para evitar os efeitos de terem sido mantidos em condições ligeiramente diferentes, bem como para prevenir pseudoreplicação. </li></ol> 2. Dissecção <ol><li> Isolar os caracóis por 1 semana, e alimentá-los à vontade, para garantir that têm esperma completo e lojas fluido seminal. </li><li> Prepare um microscópio estéreo, uma placa de dissecação com pinos, pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps finos e grossos, uma seringa de 10 ml preenchida com uma solução de MgCl2 50 mM, agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm) e algumas toalhas de papel. </li><li> Eutanásia um caracol através da injeção de solução de MgCl2 (geralmente de 3 ml ou mais para caramujos adultos com um comprimento de concha de 31,6 ± 2,1 mm e peso úmido de 2,89 ± 0,55 g). Penetrar o pé com a agulha de injecção em um ângulo de 45 ° e injectar através da aplicação de uma pressão suave de forma contínua até o caracol relaxa e permanece estendida (em segundos). Retire a agulha de injeção e verifique se o caracol é sacrificado (por exemplo, verificar se o reflexo de retirada tentáculo está ausente). </li><li> Com cuidado, retire a casca após a sua curvatura, usando uma pinça grossa. No meio do caminho, retire delicadamente o músculo columela da concha, raspando com a pinça. Gire suavemente tele caracol fora de seu escudo, seguindo a direção do enrolamento da concha. </li><li> Coloque o caracol na placa de dissecação e de definir a extremidade traseira do pé. Em seguida, coloque um alfinete através da cabeça e coloque um pouco de tensão sobre o caracol para facilitar a dissecção. </li><li> Localize o gonóporo feminino, que irá, mais tarde, ser um ponto de referência para dissecção. </li><li> Usando a tesoura cirúrgica e uma pinça fina, fazer a primeira incisão, logo abaixo da borda do manto e cortou para o gonóporo feminino. Quando uma das lâminas das tesouras é empurrado para debaixo da parede do corpo, levante um pouco para garantir que apenas a parede do corpo, e nenhum dos órgãos internos, é cortado. Continue cortando acima da gonóporo para a cabeça e cortar em uma linha reta. </li><li> Localize a próstata (posterior) e vesículas seminais (anterior). Dissecar estes para fora com cuidado e mantê-los no gelo. Use-os para fazer as soluções de ensaio contendo fluido e / ou esperma seminal. Use fisiológico sal Lymnaeaina (5,83 mmol / L de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L de KCl) como um meio de suporte. </li><li> Recolhe-se o fluido seminal que está presente no lúmen da glândula da próstata, bem como o esperma das vesículas seminais. Subsequentemente, suspende, tanto em solução salina, em frascos separados, expressando suavemente o seu conteúdo e removendo o tecido do órgão com uma pinça. Manter em gelo e usar o mesmo dia. Mais tarde, misturar estas suspensões para criar as diferentes soluções de tratamento. </li></ol> 3. Intravaginal Injeção <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de injeção intravaginal, prepare um silício shell-molde (feito para caber a ponta do shell), seringas de 1 mm, 10-12 cm tubos de silicone com um diâmetro de 1 mm, embotada agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm ), fórceps grosseiras e da mesma seringa de 10 ml cheio com uma solução de 50 mM de MgCl 2 equipada com uma agulha de injecção afiada. </li><li> Recolhe-se o esperma, necessário adicionar ao líquido seminal (ou proteínas de fluidos seminais individuais) em alguns tratamentos; uma dose biologicamente relevante é igual a 1/3 de uma glândula da próstata e vesícula seminal por injecção. NOTA: Na seção representante resultados (Figura 1) os resultados de um experimento com três tratamentos diferentes são mostrados: controle (meio transportador, ou seja, solução salina), Ovipostatin (uma das proteínas do líquido seminal identificados) sozinho e Ovipostatin acompanhado com esperma. Além disso, para calcular a dose biologicamente relevante em outras espécies, determinar a diferença no peso da glândula da próstata de indivíduos que foram recentemente acasaladas e indivíduos que permaneceram sexualmente isolado 16. </li><li> Prepare seringas de 1 ml para cada uma das soluções de teste preparadas. Encha cada seringa com uma solução e garantir que não há bolhas de ar no interior. </li><li> Coloque uma agulha de injeção embotada em cada seringa. </li><li> Para injecção utilizar um 1tubo de silicone mm de diâmetro, com um comprimento mínimo de 10 cm. </li><li> Deslize cuidadosamente o tubo de silicone ao longo da agulha de injecção, tendo cuidado para não furar o tubo e remover o ar a partir do tubo, aplicando suavemente a pressão no êmbolo da seringa. </li><li> Anestesiar um caracol, seguindo o mesmo protocolo que no ponto 2.3. Desta vez, certifique-se não injetar mais de 2-3 ml de 50 mM de MgCl2. </li><li> Coloque o caracol no shell-mold para mantê-lo em uma posição estável. </li><li> Localize o gonóporo feminina, que é claramente visível como uma mancha branca no lado direito do animal, anterior ao tentáculo direito e gonóporo masculino (este local também se aplica a outras espécies de caramujos de água doce). Certifique-se de ter acesso livre. </li><li> Use uma pinça de segurar a extremidade do tubo de silicone e suavemente inserir cerca de 2-4 mm do tubo de silicone para o gonóporo fêmea. </li><li> Cuidadosamente aplicar pressão para a seringa e injectar 0,03 ml da solução de teste. Espere meia minute para permitir que a pressão no tubo para se propagar no tracto fêmea antes da remoção do tubo. </li><li> Devolver o caracol tratada para o seu recipiente de isolamento, em que ele pode ser monitorizada, e permitir a recuperação a partir de sedação no tanque experimental. </li></ol> 4. Bioensaio <ol><li> Identifique cada caracol para a identificação e medir o seu comprimento de concha. Este último é um bom indicador do tamanho, o que é relevante ao quantificar a produção de descendência. </li><li> Mantenha cada caracol isolado em um recipiente de 460 ml que é perfurado para permitir a troca de água dentro do tanque experimental. É importante colocar todos os recipientes na orientação correcta, com as perfurações na direcção do fluxo de água, para permitir a troca de água eficiente. </li><li> Durante o ensaio biológico, alimentar os caracóis regularmente com uma quantidade padronizada de alface. Use uma rodada, perfurador de metal para cortar alface. Neste protocolo são usados ​​discos de alface de 19,6 cm 2, que se aproxima a umamontar eles máximo pode comer em um dia. </li><li> Coletar uma massa de ovos usando o lado liso de uma espátula e raspe a massa de ovos da parede do recipiente. Use o lado da colher para recolher a massa de ovos. NOTA: massas de ovos opacas que acabam de ser definidos não pode ser usado para a digitalização (que se tornem transparentes dentro de algumas horas após a postura). Para as espécies modelo neste protocolo, stagnalis Lymnaea, verifique se há massas de ovos todos os dias, uma vez que produzem 2-3 massas de ovos por semana. Isto pode variar em outras espécies. </li><li> Digitalize as massas de ovos coletadas digitalmente, utilizando um (laptop) computador que contém o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala de milímetros standard, uma espátula, transferir placas e telhas de vidro. </li><li> Coloque cada massa de ovos sobre as placas de transferência e repetir até que as placas estão cheios. Posteriormente, dab as massas de ovos secar em papel toalha e transferi-los para as telhas de vidro na mesma ordem como nas placas de transferência. </li><li> Vire cada telha de cabeça para baixo (omassas de ovos vai ficar com a telha de vidro) e colocá-lo cuidadosamente no scanner de mesa, logo abaixo da escala milimétrica. Aplique um pouco de pressão para achatar as massas de ovos, que irá distribuir os ovos uniformemente para todos eles são visíveis dentro do mesmo plano de foco. Coloque os azulejos com uma quantidade padronizada de fita em torno de dois gumes para assegurar que todos os ovos são achatados de forma igual. </li><li> Ajuste as configurações do scanner. É importante para ajustar a resolução para o máximo, fazer uma digitalização de visualização, corte a área de trabalho, e ajustar o brilho eo contraste. Digitalize as massas de ovos. </li><li> Coloque cada massa de ovos em seu próprio rotulado frasco de vidro de 20 ml para o desenvolvimento e eclosão. </li><li> Atualize a água em frascos de incubação todos os dias para mantê-lo devidamente oxigenado. Faça isso de acordo com números hatchling e tamanho, na seguinte ordem: decantação / escorrendo (sem filhotes), transbordando (início da incubação), e extrair a água com uma pipeta (muitos filhotes). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Medição e Contagem Eggs <ol><li> Instale o software de análise de imagens ImageJ livremente disponível (NIH, EUA) eo contador de células plugin. </li><li> Abrir ImageJ, bem como um programa de folha de cálculo para transferir os dados. Em seguida, abra a imagem digitalizada de massas de ovos em ImageJ. </li><li> Defina a escala usando a ferramenta de zoom para navegar até a escala milimétrica. Zoom e ajustar a janela de um milímetro para encher a tela. Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas que indicam um milímetro. Navegue para Analisar e Definir escala. No menu pop-up a opção comprimento medido torna-se visível, ajuste a distância conhecida a 1 ea unidade de comprimento para mm. Marque a caixa Global, e fechar a janela. </li><li> Defina as medidas preferenciais (comprimento, largura, circunferência), navegando para Analisar e definir medidas a seleção de Área e Diâmetro de Feret (comprimento e largura). Clique em OK para confirmar e continuar com a análise da imagem. </li><li> Para medir os ovos, zoom em em um ovo da primeira massa de ovos que precisa ser medido. Recomenda-se um zoom de 800%. Em seguida, usando a ferramenta elíptica desenhar um oval exatamente em torno do ovo, pressione Ctrl + D para desenhar a circunferência na imagem (para evitar que a medição do mesmo ovo duas vezes). Em seguida, pressione Ctrl + M para gravar a medida das propriedades do oval (comprimento, largura, circunferência); uma tela pop-up é aberto exibindo as medições. NOTA: O uso da ferramenta elíptica para medir os ovos não se aplica a todas as espécies. Para as espécies com ovos em forma de maneira não uniforme, use as seleções à mão livre em seu lugar. </li><li> Meça quantos ovos necessários e, em seguida, salvar as medidas planilha xls.. Opcionalmente, copiar os dados diretamente em uma planilha. </li><li> Posteriormente contar os ovos dentro de uma massa de ovos, usando a janela do balcão e colocou a contagem manualmente na planilha. </li><li> Alternativamente, contar os ovos individuais por massa de ovos, com a ajuda da célula contra plug-in. Para isso, vá até Plug-ins,em seguida, analisar e selecionar Contador de células. A janela de contador de células irá aparecer, marque a opção &quot;manter original&quot; caixa e pressione &#39;inicializar&#39;. Uma nova janela do contador aparece, selecione a ferramenta mira da barra de ferramentas e selecione um tipo de contador no menu contador de células. Conte os ovos individuais clicando nos ovos individuais na janela do contador de células. Observe a contagem total ao lado do tipo de contador no menu contador de células. Copie esse número manualmente para uma folha de cálculo ou obter os resultados pressionando Resultados. </li><li> Contagem múltiplas massas de ovos dentro de um evento de contagem, adicionando tipos de contador, se necessário. </li></ol>

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M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado mostra como coletar fluido seminal e como testar isso de uma forma biologicamente significativa. Embora este procedimento aqui é mostrada utilizando o extracto da glândula da próstata, o efeito de uma única proteína do fluido seminal purificado também podem ser testados seguindo o mesmo procedimento. Obviamente, em tais testes é sempre crucial incluir controlos adequados (tratamentos simulados) para assegurar que o processo e / ou o material de suporte não afecta os parâmetros de perguntas 14,16. Usando este método, que já foi demonstrado que existe uma única proteína de fluido seminal, nomeadamente Ovipostatin, que medeia uma redução na postura dos ovos, 14,16. Esta proteína, produzida na glândula da próstata e transferida durante o acasalamento, juntamente com os espermatozóides, representa o primeiro componente de fluido seminal totalmente caracterizados em hermafrodita simultânea e que, até agora, não mostra qualquer semelhança com as proteínas conhecidas. A constatação de que Ovipostalata reduz a produção de massa de ovos no recipiente corrobora trabalhos anteriores, indicando que as substâncias no sêmen pode influenciar oviposição 13-15. Ao transferir quantidades biologicamente relevantes (ver 3.2 16), pode-se convincentemente demonstrar que é uma proteína de fluido seminal, e não a presença de espermatozóides si, que medeia a redução observada na postura de ovos (Figura 1). Tendo em conta que o recebimento repetido de fluido seminal através de cruzamentos naturais aumenta o investimento por ovo 15, torna-se altamente relevante para quantificar outros parâmetros de postura de ovos. O protocolo apresentado agora fornece os métodos necessários para fazê-lo. Embora nenhum efeito foi encontrado de Ovipostatin sobre o sucesso de eclosão dos ovos postos por o recipiente 16, pode haver outras proteínas do líquido seminal que agem em conjunto com essa proteína. Por isso, os parâmetros que precisam ser quantificados neste contexto - ao lado, que os números de freqüência e de ovos - incluem o tamanho do ovo, hatctempo hing, desenvolvimento e tamanho hatchling hatchling. Além disso, é possível olhar para efeitos sobre outros processos sexo feminino do que a postura de ovos, como o armazenamento de esperma eo uso, bem como a alocação de recursos para a função reprodutiva feminina e masculina 14,17. Claramente, o método apresentado é fundamental para abordar estas questões de seguimento, tanto em Lymnaea stagnalis e em outros caramujos de água doce. Em suma, os experimentos que utilizam este protocolo mostram que transferidos proteínas do líquido seminal afetam o desempenho reprodutivo feminino do destinatário nestes hermafroditas simultâneos. Dado que poucos estudos têm abordado este, é provável que seja muito mais comum em fertilizar internamente hermafroditas que se reflete atualmente na literatura científica. Especialmente quando se percebe que a escolha do companheiro de pré-cópula e competição do esperma foram mostrados a desempenhar um papel importante nestes hermafroditas 14, que highlights o potencial de tais proteínas da glândula acessória masculina de ser sexualmente seleccionado neste sistema. Finalmente, a pesquisa ajuda a apoiar a noção de desenvolvimento que as proteínas do líquido seminal são de igual importância para hermafroditas simultâneos como eles são para espécies separadas-sexuado.

Após a transferência, os espermatozóides são geralmente acompanhadas de líquido seminal produzido por glândulas acessórias masculinas. Enquanto alguns componentes ejaculação desempenham papéis em nutrir e ativar um esperma, outros influenciam a fisiologia feminina, a fim de aumentar o sucesso de fertilização do doador de esperma 2-4. Tais efeitos são especialmente selecionados para, através da seleção sexual, quando uma espécie é altamente promíscuo e tem capacidade de armazenamento de espermatozóides e eficiente digestão de esperma. Sob tais condições, os dadores de esperma competem fortemente para a fertilização de ovos 5. Embora não haja evidência correlacional abundante para a importância de substâncias do líquido seminal para o sucesso de fertilização masculino, prova direta é mais rara e poucos estudos investigou os detalhes da mudança fisiológica e / ou substâncias envolvidas 6. Nas espécies com sexos separados (ou seja, machos e fêmeas; gonochorists) há um modelo de poucos especi bem investigadoes quando se trata de composição de fluido seminal e os seus efeitos. Exemplos incluem a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, o mosquito da malária, o Anopheles gambiae 7, eo besouro de farinha vermelho, Tribolium castaneum 8. Tais estudos fluidos seminais são muito mais raros quando se trata de espécies que são, simultaneamente, hermafrodita (ou seja, os indivíduos são funcionalmente macho e fêmea ao mesmo tempo), mesmo que este modo de reprodução é comum em todo o reino animal 9. O exemplo mais notável hermafrodita da transferência de uma substância glândula acessória é, provavelmente, o tiroteio dos chamados dardos de amor em caracóis terrestres 2,10, onde a substância é transferido pelo doador de esperma através de injeção hipodérmica 11,12, ou seja, não juntamente com os espermatozóides. Mas há muitos hermafroditas simultâneos que transferem produtos glândula acessória masculina junto com seu esperma,como as espécies modelo usados ​​aqui, a grande lagoa caracol Lymnaea stagnalis. Pesquisa anterior já demonstrado que a recepção do fluido seminal influencia a produção de descendência feminina desta espécie 13-15, e várias das proteínas dos fluidos seminais envolvidos foram identificados 16,17. O objetivo geral deste protocolo, que é uma extensão dos métodos relatados em Koene et al 16, é testar os efeitos das proteínas do líquido seminal em vários parâmetros de postura de ovos em moluscos gastrópodes. Isto é conseguido por meio de dissecção da glândula da próstata (isto é, a glândula acessória masculina que produz o fluido seminal) de caracóis doadores sexualmente isolados a partir de uma cultura de laboratório padronizado. Em segundo lugar, o esperma do doador é coletado a partir das vesículas seminais e soluções de tratamento diferentes são feitas. Subsequentemente, os caracóis do teste são anestesiados e injectados por via intravaginal com uma solução de teste (por exemplo,extrato de próstata glândula sozinho, extrato de glândula da próstata com o esperma, esperma sozinho, meio transportador sozinho). Estes moluscos de teste são então monitorizados durante os dias seguintes, a semanas, sob condições padrão, para gravar a postura de ovos. Massas de ovos são coletados, digitalizados para a contagem e medição de vários parâmetros, e em seguida, colocar em frascos individuais para incubação. Após cerca de duas semanas, os filhotes são contados e digitalizados. Todos os exames, de ambos massas de ovos e filhotes, são então analisados ​​por meio de um pacote de software de análise de imagem livremente disponível. Para este protocolo a cepa de laboratório do grande caracol lagoa, stagnalis Lymnaea, é usado, que é produzido na Universidade VU de Amsterdã. Esta espécie serve como um sistema modelo para investigar perguntas sobre seleção sexual e reprodução em hermafroditas. Relativamente grande tamanho do animal faz com que seja muito acessível experimentalmente. Além disso, uma vez que é usado como uma espécie de modelo em muitos bdisciplinas iological já sabemos muito sobre a biologia básica destes animais. Este método vai ajudar a estudar questões sobre processos de seleção sexual que são mediadas através de proteínas do líquido seminal em geral. Além disso, porque estes são hermafroditas simultâneos, é possível tratar se estas proteínas actuam em formas semelhantes e / ou diferentes, como o fazem na espécie em que os sexos são separados 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

Na adubação internamente animais, o fluido seminal é geralmente adicionado para os espermatozóides, que formam o sêmen ou ejaculação. Além esperma nutritivo e activação, os componentes no fluido seminal, também pode influenciar a fisiologia feminina para aumentar o sucesso de fertilização do esperma de um doador. Enquanto muitos estudos têm relatado tais efeitos em espécies com sexos separados, poucos estudos têm abordado este em animais simultaneamente hermafroditas. Este protocolo de vídeo apresenta um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando um caramujo de água doce, simultaneamente, hermafrodita, o grande caracol lagoa stagnalis Lymnaea, como organismo modelo. Enquanto que o procedimento é mostrado utilizando extractos completos de glândula da próstata, os componentes individuais (isto é, proteínas, peptídeos e outros compostos) do fluido seminal pode ser testada do mesmo modo. Efeitos do recebimento dos componentes do ejaculado sobre a postura de ovos pode ser quantificado em termos de frequência de postura de ovos eestimativas mais sutis de desempenho reprodutivo feminino, tais como números de ovos dentro de cada ovo massas. Os resultados mostram que as proteínas do líquido seminal afetar reprodutivo das fêmeas neste hermafrodita simultâneo, destacando sua importância para a seleção sexual.

A Figura 1 mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al 16 para obter mais detalhes e estatísticas (Fonte: Figura 3 a partir de 2010 Koene et al, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Efeito de Ovipostatin na produção em massa de ovo de Lymnaea stagnalis. O gráfico mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al. 2,010 detalhes e estatísticas. Reimpressão com permissão de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K visualizações.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Vídeo: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biologia

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

Resumo

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