Damos las gracias a MR Helmus para la voz en off, CM Popelier, S. y C. Ypenburg Levesque para la asistencia técnica. Esta investigación es financiada por la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), la Real Academia Holandesa de Artes y Ciencias (KNAW) y la Organización de Servicios Estudiantiles Japón (JASSO). Esta publicación fue apoyada por una beca de acceso abierto de la NWO a JMK.

1. Criadero <ol><li> Obtener ejemplares adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de un cultivo de laboratorio, como el de la Universidad VU. </li><li> Mantener el agua baja en cobre a 20 ° C, tanto en la instalación de cría (molluscarium) y los tanques experimentales, que tienen el cambio de agua continuo. </li><li> Ajuste el ciclo de luz / oscuridad de 12 h: 12 h. </li><li> Para la cría, alimentar a los caracoles adultos sin pesticidas lechuga ad libitum, alimentar a los jóvenes menores de edad con TetraPhyll (comida de pescado) copos. Mantener caracoles en tanques separados de acuerdo a su edad, a partir de las masas de huevos que se colocan dentro de un plazo de 24 horas. </li><li> Una vez que los caracoles son retirados de los tanques de cría que no se devuelven, para evitar los efectos de haber sido mantenido bajo condiciones ligeramente diferentes, así como para prevenir pseudoreplication. </li></ol> 2. Disección <ol><li> Aislar los caracoles durante 1 semana, y darles de comer a voluntad, para asegurar that tienen pleno esperma y almacena el líquido seminal. </li><li> Preparar un microscopio estéreo, una placa de disección con los pins, pequeñas tijeras quirúrgicas, fórceps gruesos y finos, una jeringa de 10 ml llena con una solución de MgCl 2 50 mM, agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm) y algunas toallas de papel. </li><li> La eutanasia a un caracol inyectando MgCl2 solución (generalmente 3 ml o más para los caracoles adultos con una longitud de concha de 31,6 ± 2,1 mm y el peso húmedo de 2.89 ± 0.55 g). Penetrar en el pie con la aguja de inyección en un ángulo de 45 ° y se inyecta mediante la aplicación de una suave presión de forma continua hasta que el caracol se relaja y se mantiene extendida (en segundos). Retire la aguja de inyección y comprobar si el caracol es sacrificado (por ejemplo, comprobar si el reflejo de retirada tentáculo está ausente). </li><li> Retire con cuidado la cáscara siguiendo su curvatura por el uso de fórceps gruesas. A mitad de camino, quite suavemente el músculo columelar de la cáscara raspando con los fórceps. Gire suavemente tél caracol de su concha, siguiendo la dirección de enrollado de la concha. </li><li> Coloque el caracol en la placa de disección y precisar la parte trasera del pie. Luego, coloque un alfiler a través de la cabeza y poner un poco de tensión en el caracol para facilitar la disección. </li><li> Localizar el gonoporo femenina, que más tarde será un punto de referencia para la disección. </li><li> El uso de las tijeras quirúrgicas y unas pinzas finas, hacer que la primera incisión, justo debajo del borde de la capa y cortar hacia el gonoporo hembra. Cuando una de las cuchillas de las tijeras es empujada bajo la pared del cuerpo, levántelo ligeramente para asegurarse de que sólo la pared del cuerpo, y ninguno de los órganos internos, se corta. Continuar el corte por encima de la gonoporo hacia la cabeza y cortar en línea recta. </li><li> Localizar la glándula de la próstata (posterior) y las vesículas seminales (anterior). Diseccionar éstos con cuidado y mantenerlos en hielo. Utilice estos para hacer las soluciones de ensayo que contiene líquido y / o esperma seminal. Utilice fisiológica sal Lymnaeaine (5.83 mmol / L CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / l MgCl 2 · 6H 2 O, 42.69 mmol / l de NaCl, 37.53 mmol / L KCl) como un medio portador. </li><li> Recoger el líquido seminal que está presente en el lumen de la glándula de la próstata, así como el esperma de las vesículas seminales. Posteriormente, suspender tanto en solución salina en viales separados, expresando con cuidado su contenido y eliminar el tejido de los órganos con una pinza. Mantener en hielo y utilizar el mismo día. Más tarde, mezclar estas suspensiones para crear las diferentes soluciones de tratamiento. </li></ol> 3. Intravaginal Inyección <ol><li> Antes de comenzar el procedimiento de inyección intravaginal, preparar una cáscara de molde de silicio (hecho para adaptarse a la punta de la cáscara), 1 jeringas mm, 10-12 cm de tubo de silicio con un diámetro de 1 mm, romos agujas de inyección (0,3 mm x 13 mm ), fórceps secundarios y la misma jeringa de 10 ml llena con una solución de 50 mM de MgCl 2 provista de una aguja de inyección agudo. </li><li> Se recoge el esperma, es necesario agregar al líquido seminal (o fluido seminal proteínas individuales) en algunos tratamientos; una dosis biológicamente relevante es igual a 1/3 de una glándula de la próstata y vesícula seminal por inyección. NOTA: En la sección de resultados representativos (Figura 1) se muestran los resultados de un experimento con tres tratamientos diferentes: Control (medio de soporte, es decir, la solución salina), Ovipostatin (una de las proteínas del líquido seminal identificados) solo y Ovipostatin acompañado con el esperma. Además, para estimar la dosis biológicamente relevante en otras especies, determinar la diferencia en el peso de la glándula prostática de los individuos que se han apareado y las personas que quedaron aisladas sexual-16 recientemente. </li><li> Preparar jeringas de 1 ml para cada una de las soluciones de ensayo preparadas. Llene cada jeringa con una solución y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el interior. </li><li> Coloque una aguja de inyección romo en cada jeringa. </li><li> Para utilizar la inyección de un 1tubo de silicona diámetro mm con una longitud mínima de 10 cm. </li><li> Deslice con cuidado el tubo de silicona sobre la aguja de inyección, teniendo cuidado de no perforar el tubo, y quitar el aire del tubo aplicando suavemente la presión sobre la jeringa. </li><li> Anestesiar un caracol, siguiendo el mismo protocolo que en el punto 2.3. Esta vez asegúrese de no inyectar más de 2 a 3 ml de 50 mM MgCl 2. </li><li> Coloque el caracol en el molde de la cáscara para mantenerlo en una posición estable. </li><li> Localice el gonoporo femenina, que es claramente visible como una mancha blanca en el lado derecho del animal, anterior al tentáculo derecho y gonoporo masculino (esta ubicación también se aplica a otras especies de caracoles de agua dulce). Asegúrese de tener acceso sin obstáculos. </li><li> Utilice una pinza para sujetar el extremo del tubo de silicona y suavemente inserto de aproximadamente 2-4 mm del tubo de silicio en el gonoporo hembra. </li><li> Con cuidado aplique presión a la jeringa e inyectar 0,03 ml de la solución de ensayo. Espere medio minutoUte para permitir que la presión en el tubo que se extienda en el tracto femenino antes de retirar el tubo. </li><li> Devuelva el caracol tratado a su contenedor de aislamiento, donde puede ser monitoreado, y permitir que se recupere de la sedación en el tanque experimental. </li></ol> 4. Bioensayo <ol><li> Etiquetar cada caracol para la identificación y medir su longitud de concha. Este último es un buen indicador del tamaño, que es relevante al tiempo de cuantificar el rendimiento reproductivo. </li><li> Mantenga cada caracol aislado en un recipiente 460 ml que está perforada para permitir el intercambio de agua dentro del tanque experimental. Es importante colocar todos los contenedores en la orientación correcta, con las perforaciones en la dirección del flujo de agua, para permitir el intercambio de agua eficiente. </li><li> Durante el bioensayo, caracoles alimentar regularmente con una cantidad estandarizada de lechuga. Utilice un golpeador de metal redondo para cortar lechuga. En este protocolo se utilizan discos de lechuga de 19,6 cm 2, que se aproxima a la de unmontaje que como máximo se puede comer en un día. </li><li> Reunir una masa de huevos usando el lado plano de una espátula y raspar la masa de huevos de la pared del recipiente. Use el lado cuchara para recoger la masa de huevos. NOTA: masas de huevos opacos que acaban de ser establecidas no se pueden utilizar para el escaneado (que se vuelven transparentes dentro de unas pocas horas después de la construcción). Para la especie modelo en este protocolo, stagnalis Lymnaea, compruebe si hay masas de huevos todos los días, ya que producen 2-3 masas de huevos por semana. Esto puede diferir en otras especies. </li><li> Escanear las masas de huevos recogidos de forma digital, utilizando una (laptop) de ordenador que contiene el controlador del escáner, un escáner de cama plana, una escala milimétrica estándar, una espátula, la transferencia de placas y baldosas de vidrio. </li><li> Coloque cada masa de huevos en las placas de transferencia y repetir hasta que los platos están llenos. Posteriormente, haga presión sobre las masas de huevos en seco en la toalla de papel y transferirlos a los azulejos de cristal en el mismo orden que en las placas de transferencia. </li><li> Gire cada azulejo boca abajo (lamasas de huevos se adhieren a las baldosas de vidrio) y se coloca cuidadosamente en el escáner de superficie plana, justo debajo de la escala milimétrica. Aplique un poco de presión para aplanar las masas de huevos, que se distribuyen los huevos de manera uniforme para todos ellos son visibles dentro del mismo plano de enfoque. Colocar los azulejos con una cantidad estandarizada de cinta alrededor de dos bordes para asegurar que todos los huevos se aplanan por igual. </li><li> Ajuste la configuración del escáner. Es importante ajustar la resolución al máximo, hacer una exploración preliminar, recortar el área de trabajo, y ajustar el brillo y el contraste. Escanear las masas de huevos. </li><li> Coloque cada masa de huevos en su propia etiqueta del vial de vidrio de 20 ml para un mayor desarrollo y eclosión. </li><li> Actualizar el agua en la eclosión viales cada dos días para mantenerlo adecuadamente oxigenado. Para ello, de acuerdo a los números de neonatos y el tamaño en el orden siguiente: decantación / vertiendo (sin crías), desbordando (inicio de la eclosión), y extraer el agua con una pipeta (muchas crías). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Medir y contar los huevos <ol><li> Instale el software de análisis de imágenes ImageJ libre disposición (NIH, EE.UU.) y el plugin contador de células. </li><li> ImageJ abierto, así como un programa de hoja de cálculo para transferir los datos. A continuación, abra una imagen escaneada de masas de huevos en ImageJ. </li><li> Ajuste la escala con la función de zoom para desplazarse a la escala milimétrica. Acercar y ajustar la ventana de 1 mm para llenar la pantalla. Dibuja una línea con la herramienta de línea entre las dos líneas que indican 1 mm. Vaya a analizar, y Set escala. En el menú emergente de la opción de longitud medida se hace visible, ajuste la distancia conocido a 1 y unidad de longitud de mm. Marque la casilla Global, y cerrar la ventana. </li><li> Establecer las medidas preferidas (largo, ancho, circunferencia) navegando a analizar, y establecer medidas, seleccionando Área y diámetro de Feret (largo y ancho). Haga clic en Aceptar para confirmar y continuar con el análisis de la imagen. </li><li> Para medir los huevos, la zoOM en en un huevo de la primera masa de huevo que debe ser medido. Se recomienda utilizar un zoom de 800%. Entonces, usando la herramienta elíptica dibujar un óvalo exactamente alrededor del huevo, pulse Ctrl + D para dibujar la circunferencia sobre la imagen (para evitar que la medición del mismo huevo dos veces). A continuación, pulse Ctrl + M para registrar la medida de las propiedades de la ovalada (largo, ancho, circunferencia); una pantalla emergente se abre mostrando las mediciones. NOTA: El uso de la herramienta elíptica para medir los huevos no se aplica a todas las especies. Para las especies con huevos en forma no uniforme, utilice las selecciones a mano alzada en su lugar. </li><li> Mida tantos huevos como sea necesario y guarde las medidas. Hoja de cálculo xls. Opcionalmente, copiar los datos directamente en una hoja de cálculo. </li><li> Posteriormente contar los huevos dentro de una masa de huevos, mediante el uso de la ventana del contador y poner las cuentas manualmente en la hoja de trabajo. </li><li> Por otra parte, contar los huevos individuales por masa de huevos con la ayuda de la célula contra plug-in. Para ello, vaya a los plug-ins,a continuación, analizar y seleccionar Contador de células. La ventana del contador de células aparecerá, marque la casilla &#39;Guardar original &quot;caja y pulsa&#39; inicializar &#39;. Aparecerá una nueva ventana del contador, seleccione la herramienta en forma de cruz de la barra de herramientas y seleccione un tipo de contador en el menú de contador de células. Cuente los huevos individuales haciendo clic sobre los huevos individuales en la ventana Contador de células. Observe el recuento total de al lado del tipo de contador en el menú de contador de células. Copia este número manualmente a una hoja de cálculo o de obtener los resultados pulsando Resultados. </li><li> Cuente múltiples masas de huevos dentro de un evento de conteo añadiendo tipos de contador, si es necesario. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado muestra cómo recolectar líquido seminal y la forma de probar esto en una forma biológicamente significativa. Aunque este procedimiento aquí se muestra usando el extracto de glándula de la próstata, el efecto de una sola proteína de fluido seminal purificado también se puede probar siguiendo el mismo procedimiento. Obviamente, en este tipo de pruebas, siempre es crucial incluir controles adecuados (tratamientos simulados) para garantizar que el procedimiento y / o el medio portador no afectan los parámetros en preguntas 14,16. Utilizando este método, ya se ha demostrado que existe una única proteína fluido seminal, a saber Ovipostatin, que media una reducción en la puesta de huevos 14,16. Esta proteína, producida en la glándula de la próstata y se transfiere durante el apareamiento junto con los espermatozoides, representa el primer componente líquido seminal caracterizaron completamente en un hermafrodita simultáneo y no, hasta ahora, no muestra ninguna similitud con las proteínas conocidas. El hallazgo de que Ovipostaestaño reduce la producción de masa de huevo en el recipiente corrobora trabajos anteriores que indica que las sustancias en el semen pueden influir en la puesta de huevos 13-15. Mediante la transferencia de cantidades biológicamente relevantes (ver 3.2 16), uno puede demostrar de manera convincente que es una proteína de líquido seminal, y no la presencia de espermatozoides a sí mismos, que media la reducción observada en la puesta de huevos (Figura 1). Teniendo en cuenta que la recepción repetida del líquido seminal a través de apareamientos naturales aumenta la inversión por huevo 15, ahora se vuelve altamente relevante para cuantificar otros parámetros de la puesta de huevos. El protocolo presentado ahora proporciona los métodos necesarios para hacerlo. Aunque no se encontró efecto de Ovipostatin en el éxito de los huevos puestos por el receptor 16 de la eclosión, puede haber otras proteínas de fluidos seminales que actúan en concierto con esta proteína. Por lo tanto, los parámetros que deben ser cuantificados en este contexto - al lado por el que se números de la frecuencia y de los huevos - incluyen el tamaño del huevo, hatctiempo Hing, el desarrollo de crías y el tamaño de crías. Además, es posible observar los efectos sobre otros procesos femeninos que la puesta de huevos, como el almacenamiento y el uso de esperma, así como la asignación de recursos hacia la función reproductiva femenina y masculina 14,17. Es evidente que el método presentado es un instrumento para hacer frente a estas cuestiones de seguimiento, tanto en Lymnaea stagnalis y en otros caracoles de agua dulce. En resumen, los experimentos con este espectáculo protocolo que transfieren fluido seminal proteínas afectan el desempeño reproductivo de la mujer del destinatario en estos hermafroditas simultáneos. Dado que pocos estudios han abordado este, es probable que sea mucho más común en la fertilización internamente hermafroditas que se refleja en la actualidad en la literatura científica. Especialmente cuando uno se da cuenta de que la elección de pareja pre-copulador y la competencia espermática se ha demostrado que desempeñan un papel importante en estos hermafroditas 14, que importanTS el potencial de tales proteínas de las glándulas accesorias masculinas a ser seleccionado sexualmente en este sistema. Por último, esta investigación ayuda a apoyar la noción de que el desarrollo de las proteínas del líquido seminal son de igual importancia para los hermafroditas simultáneos, ya que son para las especies separadas sexuado.

Tras la transferencia, los espermatozoides son por lo general acompañada de líquido seminal producido por las glándulas accesorias masculinas. Mientras que algunos componentes del eyaculado juegan un papel en la activación de los espermatozoides nutritiva y 1, otros influyen en la fisiología femenina con el fin de aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma 2-4. Estos efectos son especialmente seleccionados para, a través de la selección sexual, cuando una especie es altamente promiscua y tiene el almacenamiento de esperma eficiente y la digestión de los espermatozoides. Bajo tales condiciones, los donantes de esperma compiten fuertemente para la fertilización de los huevos 5. Si bien existe abundante evidencia correlacional de la importancia de las sustancias líquido seminal para el éxito de la fertilización masculina, prueba directa es más raro y pocos estudios han profundizado en los detalles del cambio y / o sustancias que intervienen 6 fisiológica. En especies con sexos separados (es decir, machos y hembras; Gonocorista) hay unos pocos modelos especi bien investigadoES cuando se trata de la composición del fluido seminal y sus efectos. Algunos ejemplos son la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster 6, el mosquito de la malaria, Anopheles gambiae 7, y el escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum 8. Tales estudios de fluidos seminales son mucho más raras cuando se trata de especies que son simultáneamente hermafrodita (es decir, los individuos son funcionalmente macho y hembra al mismo tiempo), a pesar de que este modo de reproducción es común en todo el reino animal 9. El ejemplo más notable hermafrodita de la transferencia de una sustancia de las glándulas accesorias es probablemente el rodaje de los llamados amorosos dardos en los caracoles de tierra de 2,10, cuando la sustancia se transfiere por el donante de esperma a través de inyección hipodérmica 11,12, es decir, no junto con los espermatozoides. Pero hay muchos hermafroditas simultáneos que transfieren productos de las glándulas accesorias masculinas junto con su esperma,tales como la especie modelo utilizado aquí, el gran estanque de caracol Lymnaea stagnalis. La investigación anterior ha demostrado ya que la recepción de líquido seminal influye en el rendimiento reproductivo femenino de esta especie 13-15, y varias de las proteínas del líquido seminal involucrados se han identificado 16,17. El objetivo general de este protocolo, que es una extensión de los métodos reportados en Koene et al 16, es poner a prueba los efectos de las proteínas del líquido seminal sobre diversos parámetros de la puesta de huevos en los moluscos gasterópodos. Esto se logra mediante la disección de la glándula de la próstata (es decir, el macho de las glándulas accesorias producir el líquido seminal) de aislados sexual caracoles donantes de un cultivo de laboratorio normalizado. En segundo lugar, el esperma del donante se obtiene de las vesículas seminales y diferentes soluciones de tratamiento se hacen. Posteriormente, los caracoles de ensayo se anestesian y por vía intravaginal inyectadas con una solución de ensayo (por ejemplo,extracto de glándula de próstata solo, extracto de glándula de la próstata con el esperma, los espermatozoides solo, medio portador). Estos caracoles de prueba se siguen de cerca para los siguientes días o semanas, en condiciones normales, para grabar la puesta de huevos. Las masas de huevos se recogen, digitalmente escaneada para contar y medir varios parámetros, y luego poner en viales individuales para incubar. Después de dos semanas, las crías son contados y escaneados digitalmente. Todos los análisis, tanto de las masas de huevos y crías, son luego analizados utilizando un paquete de software de análisis de imágenes de libre disposición. Para este protocolo se utiliza la cepa de laboratorio de la gran caracol estanque, stagnalis Lymnaea, que se cría en la Universidad VU en Amsterdam. Esta especie sirve como un sistema modelo para investigar preguntas sobre selección y reproducción en hermafroditas sexual. Tamaño relativamente grande del animal hace que sea muy accesible experimentalmente. Además, ya que se utiliza como especie modelo en muchos bdisciplinas iológica que ya saben mucho sobre la biología básica de estos animales. Este método le ayudará a estudiar las preguntas acerca de los procesos de selección sexual que están mediadas a través de fluido seminal proteínas en general. Además, debido a que estos son hermafroditas simultáneos, es posible abordar si tales proteínas actúan en formas similares y / o diferentes como lo hacen en especies en las que los sexos están separados 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

En fertilizar internamente animales, el fluido seminal se suele añadir a los espermatozoides, formando el semen o eyaculado. Además de esperma nutritiva y la activación de, los componentes en el líquido seminal también pueden influir en la fisiología femenina para aumentar el éxito de la fertilización del donante de esperma. Aunque muchos estudios han informado de tales efectos en las especies con sexos separados, pocos estudios han abordado este en animales hermafroditas simultáneamente. Este protocolo de vídeo presenta un método para estudiar los efectos de líquido seminal en gasterópodos, el uso de un caracol de agua dulce de forma simultánea hermafrodita, la gran caracol Lymnaea stagnalis estanque, como organismo modelo. Mientras se muestra el procedimiento utilizando extractos completos de la glándula de la próstata, los componentes individuales (es decir, proteínas, péptidos, y otros compuestos) de líquido seminal pueden ser probadas de la misma manera. Efectos de la recepción de los componentes del eyaculado en la puesta de huevos se pueden cuantificar en términos de frecuencia de la puesta de huevos yestimaciones más sutiles de comportamiento reproductivo femenino, como el número de huevos dentro de cada masa de huevos. Los resultados muestran que las proteínas del líquido seminal afectan el rendimiento reproductivo de la mujer en esta hermafrodita simultáneo, destacando su importancia para la selección sexual.

La Figura 1 muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal de cualquiera de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin, o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al 16 para obtener más información y estadísticas (Fuente: Figura 3 de Koene et al 2010, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Efecto de Ovipostatin en la producción masiva de huevos de Lymnaea stagnalis. El gráfico muestra el porcentaje de animales que ponen huevos después de la inyección intravaginal ya sea de la sustancia de control (solución salina), Ovipostatin o Ovipostatin acompañados con el esperma. N = 15 para cada tratamiento; ver Koene et al. 2010 Detalles y estadísticas. Reimpresión con permiso de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efecto de la Mujer Accesorios Glándula productos en la puesta de huevos en gasterópodos

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vistas.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Investigación

Biología

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...