Nous remercions M. Helmus pour la voix-off, CM Popelier, S. et C. Levesque Ypenburg pour l&#39;assistance technique. Cette recherche est financée par l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), l&#39;Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (KNAW) et l&#39;Organisation des services aux étudiants au Japon (JASSO). Cette publication a été financée par une subvention de l&#39;Open Access de NWO à JMK.

1. Elevage installation <ol><li> Obtenir des spécimens adultes d&#39;(L.) de Lymnaea d&#39;une culture de laboratoire comme celui de l&#39;Université VU. </li><li> Maintenir l&#39;eau faible teneur en cuivre à 20 ° C dans la facilité de reproduction (de molluscarium) et bassins expérimentaux, qui ont l&#39;échange continu de l&#39;eau. </li><li> Réglez le cycle lumière / obscurité à 12 h: 12 h. </li><li> Pour l&#39;élevage, nourrir les escargots adultes laitue ad libitum sans pesticides, nourrir les juvéniles avec TetraPhyll (nourriture des poissons) de flocons. Maintenir escargots dans des réservoirs séparés en fonction de leur âge, à partir de masses d&#39;œufs qui sont prévues dans un délai de 24 heures. </li><li> Une fois les escargots sont retirés des bassins d&#39;élevage ne sont pas retournés, pour éviter les effets d&#39;avoir été maintenus dans des conditions légèrement différentes ainsi que pour prévenir pseudoréplication. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Isoler les escargots pendant 1 semaine, et les nourrir ad libitum, d&#39;assurer le that ils ont plein de sperme et le liquide séminal magasins. </li><li> Préparer un microscope stéréo, une plaque de dissection avec des épingles, des petits ciseaux chirurgicaux, pinces fines et grossières, une seringue de 10 ml remplie d&#39;un MgCl2 solution à 50 mM, aiguilles d&#39;injection (0,3 mm x 13 mm) et des serviettes en papier. </li><li> Euthanasier un escargot en injectant MgCl2 solution (généralement 3 ml ou plus pour les escargots adultes avec une longueur de coque de 31,6 ± 2,1 mm et un poids humide de 2,89 ± 0,55 g). Pénétrer dans le pied avec l&#39;aiguille d&#39;injection à un angle de 45 ° et injecter en appuyant légèrement en continu jusqu&#39;à ce que l&#39;escargot se détend et reste étendu (en quelques secondes). Retirez l&#39;aiguille d&#39;injection et vérifier si l&#39;escargot est euthanasié (par exemple, en vérifiant si le réflexe de retrait de tentacule est absent). </li><li> Retirez délicatement la coquille suivant sa courbure à l&#39;aide des pinces grossières. A mi-chemin, détachez le muscle columellaire de la coquille en grattant avec la pince. Tourner doucement til escargot de sa coquille, suivant le sens d&#39;enroulement de la coquille. </li><li> Placez l&#39;escargot sur la plaque de dissection et cerner l&#39;extrémité arrière du pied. Ensuite, placez une épingle à travers la tête et mettre un peu de tension sur l&#39;escargot pour faciliter la dissection. </li><li> Localisez l&#39;gonopore femelle, qui sera plus tard sur un point pour la dissection de référence. </li><li> En utilisant les ciseaux chirurgicaux et des pinces fines, faire la première incision, juste sous le bord du manteau et couper vers le gonopore femelle. Lorsque l&#39;un des lames de ciseaux est poussé les sous la paroi du corps, soulevez doucement pour s&#39;assurer que seule la paroi du corps, et aucun des organes internes, est coupé. Continuer la coupe au-dessus du gonopore vers la tête et couper en ligne droite. </li><li> Localiser la glande de la prostate (postérieure) et les vésicules séminales (antérieures). Disséquer les soigneusement et gardez-les sur de la glace. Les utiliser pour préparer les solutions d&#39;essai contenant un fluide et / ou du sperme séminal. Utilisez physiologique sal Lymnaeaine (5,83 mmol / l de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl 2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L KCl) en tant que milieu de support. </li><li> Recueillir le liquide séminal qui est présent dans la lumière de la glande de la prostate ainsi que le sperme des vésicules séminales. Par la suite, suspendre la fois dans une solution saline dans des flacons séparés en exprimant doucement leur contenu et de retirer le tissu organique avec une pince. Garder sur la glace et utiliser le même jour. Plus tard, mélanger ces suspensions pour créer les différentes solutions de traitement. </li></ol> 3. Intravaginale injection <ol><li> Avant de commencer la procédure d&#39;injection intravaginale, préparer une coquille moule en silicone (fait pour s&#39;adapter à la pointe de la coque), 1 mm seringues, 10-12 tubes cm de silicium d&#39;un diamètre de 1 mm, émoussé aiguilles d&#39;injection (0,3 mm x 13 mm ), une pince grossiers et la même seringue de 10 ml rempli d&#39;une solution mM MgCl 2 50 équipé d&#39;une aiguille d&#39;injection pointue. </li><li> Recueillir le sperme, nécessaire pour ajouter de liquide séminal (ou protéines du liquide séminal individuels) dans certains traitements; une dose biologiquement pertinente est égale à 1/3 d&#39;une glande de la prostate et des vésicules séminales par injection. NOTE: Dans la section des résultats représentatifs (Figure 1) les résultats d&#39;une expérience de trois traitements différents sont présentés: Contrôle (milieu de support, c&#39;est à dire, une solution saline), Ovipostatin (une des protéines du liquide séminal identifiés) seul et Ovipostatin accompagné de sperme. En outre, pour estimer la dose biologiquement pertinente dans d&#39;autres espèces, déterminer la différence de poids de la glande de la prostate de personnes qui ont récemment accouplées et les individus qui sont restés sexuellement isolés 16. </li><li> Préparer seringues de 1 ml de chacune des solutions d&#39;essai préparées. Remplir chaque seringue d&#39;une solution et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air à l&#39;intérieur. </li><li> Monter une aiguille d&#39;injection émoussée sur chaque seringue. </li><li> Pour utiliser une injection 1tube de silicium mm de diamètre avec une longueur minimale de 10 cm. </li><li> Faites glisser délicatement le tube de silicium sur l&#39;aiguille d&#39;injection, en veillant à ne pas percer le tube, et retirer l&#39;air du tube en appuyant légèrement la pression sur la seringue. </li><li> Anesthésier un escargot en suivant le même protocole que dans le point 2.3. Cette fois, assurez-vous de ne pas injecter plus de 2-3 ml de 50 mM MgCl 2. </li><li> Poser l&#39;escargot dans la coquille moule à garder dans une position stable. </li><li> Localisez le gonopore femelle, qui est clairement visible, comme une tache blanche sur le côté droit de l&#39;animal, avant à droite tentacule et gonopore mâle (cet endroit est également valable pour d&#39;autres espèces d&#39;escargots d&#39;eau douce). Assurez-vous d&#39;avoir un accès libre. </li><li> Utiliser une pince pour maintenir l&#39;extrémité du tube de silicium et insérer doucement environ 4.2 mm du tube de silicium dans le gonopore femelle. </li><li> Appliquer soigneusement pression à la seringue et d&#39;injecter 0,03 ml de la solution d&#39;essai. Attendre une demi-minute pour permettre à la pression dans le tube de se propager dans le tube femelle avant de retirer le tube. </li><li> Retour de l&#39;escargot traité à son conteneur d&#39;isolement, où il peut être surveillé, et lui permettre de se remettre de la sédation dans le réservoir expérimental. </li></ol> 4. D&#39;essais biologiques <ol><li> Étiqueter chaque escargot pour l&#39;identification et mesurer sa longueur de coque. Ce dernier est un bon indicateur de la taille, ce qui est pertinent pour quantifier la reproduction. </li><li> Gardez chaque escargot isolé dans un ml contenant 460 qui est perforé pour permettre l&#39;échange de l&#39;eau dans le réservoir expérimental. Il est important de placer tous les conteneurs dans la bonne orientation, avec des perforations dans la direction de l&#39;écoulement de l&#39;eau, pour permettre l&#39;échange efficace de l&#39;eau. </li><li> Au cours de l&#39;essai biologique, nourrir les escargots régulièrement avec une quantité standardisée de laitue. Utilisez un tour, perforateur en métal pour couper la laitue. Dans ce protocole, les disques de laitue de 19,6 cm 2 sont utilisés, qui se rapproche de l&#39;uneils peuvent monter au maximum manger en une seule journée. </li><li> Recueillir une masse d&#39;œufs avec le côté plat d&#39;une spatule et racler la masse d&#39;oeufs de la paroi du récipient. Utilisez le côté de la cuillère pour recueillir la masse d&#39;oeufs. NOTE: les masses d&#39;œufs opaques qui viennent d&#39;être fixées ne peuvent être utilisés pour la numérisation (ils deviennent transparents en quelques heures après la pose). Pour les espèces modèles de ce protocole, Lymnaea stagnalis, vérifier des masses d&#39;œufs tous les jours, car ils produisent 2-3 masses d&#39;œufs par semaine. Cela peut varier dans d&#39;autres espèces. </li><li> Balayez les masses d&#39;œufs collectés numériquement à l&#39;aide d&#39;un (ordinateur portable) ordinateur contenant le pilote du scanner, un scanner à plat, une échelle millimétrique standard, une spatule, transférer plaques et carreaux de verre. </li><li> Placez chaque masse d&#39;œufs sur les plaques de transfert et répéter jusqu&#39;à ce que les plaques sont pleins. Par la suite, tamponnez les masses d&#39;œufs sécher sur une serviette en papier et de les transférer sur les carreaux de verre dans le même ordre que sur les plaques de transfert. </li><li> Tournez chaque carreau à l&#39;envers (l&#39;masses d&#39;œufs collent à la tuile de verre) et placer soigneusement sur le scanner à plat, un peu moins de l&#39;échelle millimétrique. Appliquer un peu de pression pour aplatir les masses d&#39;œufs, qui distribue les œufs uniformément de sorte qu&#39;ils sont tous visibles dans le même plan de mise au point. Monter les carreaux avec une quantité standardisée de ruban autour de deux bords pour assurer que tous les oeufs sont aplaties aussi. </li><li> Réglez les paramètres du scanner. Il est important de régler la résolution à son maximum, faire un scan de prévisualisation, recadrer la zone de travail, et de régler la luminosité et le contraste. Balayez les masses d&#39;œufs. </li><li> Placez chaque masse d&#39;oeufs dans sa propre étiquette flacon de 20 ml en verre pour le développement et l&#39;éclosion. </li><li> Rafraîchir l&#39;eau dans des flacons d&#39;incubation tous les jours pour garder correctement oxygéné. Pour ce faire, selon le nombre de nouveau-nés et la taille dans l&#39;ordre suivant: décantation / décanter (pas de nouveau-nés), débordant (début de l&#39;éclosion), et l&#39;extraction hors de l&#39;eau avec une pipette (de nombreux nouveau-nés). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Mesure et de comptage des oeufs <ol><li> Installez le ImageJ logiciel d&#39;analyse d&#39;image librement disponible (NIH, USA) et le compteur de cellules plugin. </li><li> Ouvrir ImageJ ainsi que d&#39;un tableur pour transférer les données. Ensuite, ouvrez une image scannée de masses d&#39;œufs dans ImageJ. </li><li> Réglez l&#39;échelle à l&#39;aide de l&#39;outil de zoom pour naviguer à l&#39;échelle millimétrique. Zoomer et ajuster la fenêtre de 1 mm pour remplir l&#39;écran. Tracez une ligne en utilisant l&#39;outil de ligne de démarcation entre les deux lignes qui indiquent 1 mm. Accédez à analyser, et Set échelle. Dans le menu pop-up de l&#39;option de mesure de longueur devient visible, ajuster la distance connu à 1 et l&#39;unité de longueur de mm. Cochez la case mondial, et fermer la fenêtre. </li><li> Définissez les mesures privilégiées (longueur, largeur, circonférence) en accédant à analyser, et Set mesures en sélectionnant régionaux et le diamètre de Feret (longueur et largeur). Cliquez sur OK pour confirmer et continuer avec l&#39;analyse de l&#39;image. </li><li> Pour mesurer les oeufs, zoom sur un oeuf dans de la première masse d&#39;oeuf qui doit être mesuré. Un zoom de 800% est recommandé. Puis, en utilisant l&#39;outil elliptique dessiner un ovale exactement autour de l&#39;oeuf, appuyez sur CTRL + D pour dessiner la circonférence sur l&#39;image (pour empêcher la mesure de la même œuf deux fois). Ensuite, appuyez sur Ctrl + M pour enregistrer la mesure des propriétés de l&#39;ovale (longueur, largeur, circonférence); un écran pop-up s&#39;ouvre et affiche les mesures. NOTE: L&#39;utilisation de l&#39;outil elliptique pour mesurer les oeufs ne s&#39;applique pas à toutes les espèces. Pour les espèces aux oeufs en forme de manière non uniforme, utiliser les sélections à main levée à la place. </li><li> Mesurer autant d&#39;œufs que nécessaires, puis enregistrer les mesures. Xls feuille de calcul. Eventuellement, copier les données directement dans une feuille de calcul. </li><li> Par la suite compter les œufs dans une masse d&#39;œufs, à l&#39;aide de la fenêtre du compteur et de mettre les chiffres manuellement dans la feuille de calcul. </li><li> Sinon, compter les œufs individuels par la masse des oeufs à l&#39;aide de la cellule contre le plug-in. Pour cela, accédez à des plug-ins,alors, analyser et sélectionner portable compteur. La fenêtre du compteur de cellule s&#39;affiche, cochez la case &quot;garder originale&quot; boîte et appuyez sur &quot;initialiser&quot;. Une nouvelle fenêtre du compteur apparaît, sélectionnez l&#39;outil en forme de croix de la barre d&#39;outils et sélectionnez un type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Compter les œufs individuels en cliquant sur les œufs individuels dans la fenêtre du compteur de cellule. Observer le nombre total en regard du type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Copiez ce numéro manuellement à une feuille de calcul ou d&#39;obtenir les résultats en appuyant sur les résultats. </li><li> Comptez plusieurs masses d&#39;œufs dans un événement de comptage en ajoutant types de compteurs, si nécessaire. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le protocole présenté montre comment recueillir le liquide séminal et comment tester ce d&#39;une manière biologiquement significative. Bien que cette procédure est représenté ici à l&#39;aide de l&#39;extrait de la glande de la prostate, l&#39;effet d&#39;une seule protéine purifiée liquide séminal peut également être testée en suivant la même procédure. Évidemment, dans ces tests, il est toujours crucial d&#39;inclure des contrôles appropriés (traitements fictifs) de veiller à ce que la procédure et / ou le moyen de transport n&#39;affectent pas les paramètres en question 14,16. En utilisant ce procédé, il a déjà été montré qu&#39;il existe une seule protéine de liquide séminal, à savoir Ovipostatin, qui médie une réduction de la ponte 14,16. Cette protéine, produite dans la glande de la prostate et transféré au cours de l&#39;accouplement avec les spermatozoïdes, représente le premier composant liquide séminal entièrement caractérisé par un hermaphrodite simultané et n&#39;a, jusqu&#39;à présent, ne montre aucune ressemblance avec des protéines connues. La constatation que Ovipostaétain réduit la production de masse d&#39;oeufs dans le récipient corrobore les travaux antérieurs indiquant que les substances dans le sperme peuvent influencer la ponte 13-15. En transférant biologiquement montants concernés (voir 3.2 16), on peut démontrer de façon convaincante que c&#39;est une protéine liquide séminal, et non la présence de spermatozoïdes eux-mêmes, qui intervient dans la réduction observée de la ponte (Figure 1). Étant donné que la réception répétée de liquide séminal par croisements naturels augmente l&#39;investissement par oeuf 15, il devient maintenant très pertinent pour quantifier d&#39;autres paramètres de la ponte. Le protocole présenté fournit maintenant les méthodes nécessaires pour le faire. Bien qu&#39;aucun effet n&#39;a été trouvée de Ovipostatin sur le succès des œufs pondus par le destinataire 16 à couver, il peut y avoir d&#39;autres protéines du liquide séminal qui agissent de concert avec cette protéine. Par conséquent, les paramètres qui doivent être quantifiés dans ce contexte - à côté de la pose nombre de fréquences et des œufs - comprennent la taille des œufs, hatctemps hing, le développement des nouveau-nés et la taille des nouveau-nés. En outre, il est possible d&#39;examiner les effets sur d&#39;autres processus femmes que la ponte, telles que le stockage de sperme et l&#39;utilisation, ainsi que l&#39;allocation des ressources vers la fonction de reproduction mâle et femelle 14,17. De toute évidence, la méthode présentée est instrumentale dans la résolution de ces questions suivi, à la fois dans Lymnaea stagnalis et dans d&#39;autres escargots d&#39;eau douce. En somme, les expériences utilisant ce protocole montrent que les protéines transférées liquide séminal affectent la performance de reproduction féminin du bénéficiaire dans ces hermaphrodites simultanés. Étant donné que peu d&#39;études ont abordé ce, il est susceptible d&#39;être beaucoup plus fréquent dans la fertilisation interne hermaphrodites que actuellement reflété dans la littérature scientifique. Surtout quand on sait que le choix du partenaire pré-copulation et de la concurrence de sperme ont été montré à jouer un rôle important dans ces hermaphrodites 14, qui highlights le potentiel de ces protéines mâles de la glande accessoire à être sélectionné sexuellement dans ce système. Enfin, cette recherche contribue à soutenir le développement de la notion que les protéines du liquide séminal sont d&#39;égale importance pour hermaphrodites simultanés car ils sont des espèces distinctes-sexué.

Lors du transfert, les spermatozoïdes sont habituellement accompagné par le liquide séminal produit par les glandes accessoires mâles. Alors que certains composants éjaculat jouent un rôle dans l&#39;activation de sperme nourrissante et 1, d&#39;autres influencent la physiologie féminine en vue d&#39;accroître le succès de la fécondation du donneur de sperme 2-4. Ces effets sont particulièrement choisis pour, par la sélection sexuelle, quand une espèce est très promiscuité et a de stockage de sperme et le sperme efficace digestion. Dans ces conditions, les donneurs de sperme concurrence fortement pour la fécondation des œufs 5. Bien qu&#39;il existe des preuves abondantes de corrélation de l&#39;importance des substances liquide séminal pour le succès de la fécondation mâle, la preuve directe est plus rare et peu d&#39;études ont puisé dans les détails de la modification et / ou substances impliquées 6 physiologique. Chez les espèces à sexes séparés (c&#39;est à dire, hommes et femmes; gonochorists) il ya un peu modèle spéci bien étudiées quand il s&#39;agit de la composition de fluide séminal et de leurs effets. Les exemples incluent la mouche des fruits, Drosophila melanogaster 6, le moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae 7, et le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum 8. Ces études liquide séminal sont beaucoup plus rares quand il s&#39;agit pour les espèces qui sont en même temps hermaphrodite (c&#39;est à dire, les individus sont fonctionnellement mâles et femelles en même temps), même si ce mode de reproduction est courante dans le règne animal 9. L&#39;exemple le plus notable hermaphrodite du transfert d&#39;une substance de la glande accessoire est probablement la prise de vue de ce qu&#39;on appelle l&#39;amour-fléchettes dans les escargots terrestres 2,10, où la substance est transférée par le donneur de sperme par injection hypodermique 11,12, c&#39;est-à-pas avec les spermatozoïdes. Mais il ya beaucoup hermaphrodites simultanés qui transfèrent mâles produits de la glande accessoire avec leur sperme,tels que les espèces modèles utilisés ici, le grand étang Lymnaea stagnalis. Des recherches antérieures ont déjà démontré que la réception du liquide séminal influe sur la capacité reproductrice femelle de cette espèce 13-15, et plusieurs des protéines du liquide séminal impliqués ont été identifiés 16,17. L&#39;objectif global de ce protocole, qui est une extension des méthodes présentées dans Koene et al 16, est de tester les effets des protéines du liquide séminal sur les différents paramètres de la ponte dans les mollusques gastéropodes. Ceci est accompli par la dissection de la glande de la prostate (par exemple, la glande accessoire mâle produire le liquide séminal) des escargots sexuellement isolé à partir d&#39;une culture de laboratoire normalisé donateurs. Deuxièmement, le sperme du donneur est collecté à partir des vésicules séminales et des solutions de traitement différents sont faits. Par la suite, les escargots d&#39;essai sont anesthésiés par voie intravaginale et injectés avec une solution d&#39;essai (par exemple,extrait de glande prostate seul, extrait de glande prostate avec le sperme, le sperme seul, moyen de support seul). Ces escargots de test sont ensuite suivis pendant les jours suivants à quelques semaines, dans des conditions standard, pour enregistrer la ponte. Les masses d&#39;œufs sont collectés, numériquement, pour compter et mesurer les différents paramètres, et ensuite mis dans des flacons individuels à couver. Après environ deux semaines, les nouveau-nés sont comptés et numériquement analysés. Toutes les analyses, de deux masses d&#39;œufs et les nouveau-nés, sont ensuite analysées à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;analyse d&#39;images librement disponibles. Pour ce protocole la souche de laboratoire de la grande escargot étang, Lymnaea stagnalis, est utilisé, ce qui est élevé à l&#39;Université VU d&#39;Amsterdam. Cette espèce constitue un système modèle pour étudier des questions sur la sélection sexuelle et de la reproduction dans les hermaphrodites. Relativement grande taille de l&#39;animal, il est expérimentalement très accessible. En outre, parce qu&#39;il est utilisé comme espèce modèle dans de nombreux bdisciplines siologiques nous savons déjà beaucoup sur la biologie de base de ces animaux. Cette méthode permettra d&#39;étudier les questions relatives aux processus de sélection sexuelle qui sont médiés par des protéines du liquide séminal en général. En outre, parce que ce sont hermaphrodites simultanés, il est possible d&#39;indiquer si ces protéines agissent de manière similaire et / ou différentes comme c&#39;est le cas dans les espèces où les sexes sont séparés 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

Dans la fertilisation interne animaux, le liquide séminal est habituellement ajouté aux spermatozoïdes, formant ensemble le sperme ou éjaculat. Outre l&#39;activation de sperme et nourrissante, les composants dans le liquide séminal peut également influencer la physiologie féminine pour augmenter le succès de la fécondation du donneur de sperme. Alors que de nombreuses études ont rapporté ces effets chez les espèces à sexes séparés, peu d&#39;études ont abordé cette chez les animaux hermaphrodites simultanément. Ce protocole vidéo présente une méthode pour étudier les effets de liquide séminal chez les gastéropodes, en utilisant un escargot d&#39;eau douce en même temps hermaphrodite, le grand escargot étang Lymnaea stagnalis, comme organisme modèle. Alors que la procédure est représenté en utilisant des extraits complets de la glande de la prostate, les composants individuels (à savoir, des protéines, des peptides, et d&#39;autres composés) du liquide séminal peuvent être testés de la même manière. Effets de la réception de composants éjaculer sur la ponte peuvent être quantifiés en termes de fréquence de ponte etestimations les plus subtiles de la performance de reproduction des femmes telles que les numéros d&#39;oeuf dans chacune des masses d&#39;œufs. Les résultats montrent que les protéines du liquide séminal affectent la reproduction des femmes dans ce hermaphrodite simultané, en soulignant leur importance pour la sélection sexuelle.

La figure 1 montre le pourcentage d&#39;animaux pondent des œufs après l&#39;injection intra-vaginale ou l&#39;autre de la substance témoin (solution saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al 16 pour plus de détails et des statistiques (Source: Figure 3 de Koene et al 2010, la revue PLoS ONE.).. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Effet de Ovipostatin sur la production d&#39;oeufs de masse de Lymnaea stagnalis. Le graphique montre le pourcentage d&#39;animaux pondent des œufs après l&#39;injection intravaginale soit la substance de contrôle (saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al. 2010 Détails et statistiques. Réimpression avec la permission de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Vidéo: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Recherche

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...