وقد أيد غالبية العمل والموظفين المشاركين من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS060677 وجزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MH099559 وMH104069 (لBSK). وأيد بعض الأعمال أيضا من قبل مؤسسة CHDI.

وكانت جميع البروتوكولات الحيوانية وفقا للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا. 1.1) إعداد ممص مكروى وAAV2 / 5 الفيروسات تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غرامة بال micropipettes الزجاج البورسليكات لحقن الفيروس. سحب ممص مكروى باستخدام برنامج سحب من خطوتين مع مجتذب العمودي. شطبة ماصة بزاوية 40 درجة باستخدام طاحونة ماصة. سوف ماصة الذي يعتبر مثاليا للاستخدام يكون قطرها غيض من 20 - 40 ميكرون، ويبلغ طوله عرقوب عن 6 - 7 مم. الأوتوكلاف ماصة والأدوات الجراحية. وتعقيم الحفر بواسطة المسح مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين فيروس AAV2 / 5-GfaABC 1-D.cyto GCaMP3.SV40 (1.5 × 10 13 GC / مل)، في -80 درجة مئوية في 10 مكل. فقط قبل الجراحة، واخراج مأخوذة من الثلاجة وتخزينها على الجليد حتى استخدامها لملء عشرالبريد ممص مكروى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ممص مكروى مع فيروس باستخدام مضخة الحقنة. ربط بإحكام واحدة من نهاية قطعة من الأنابيب، من خلال ضغط أنابيب بحجم مناسب المناسب، لحقنة زجاجية مع الغطاس المسلحة. إرفاق ممص مكروى تعقيمها إلى الطرف الآخر من قطعة من الأنابيب من خلال بحجم مناسب ضغط إبرة القابلة للإزالة المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحميل ناقلات فيروسية، وإزالة فقاعات الهواء من نظام الضخ بما في ذلك أنابيب، محقنة وممص مكروى عن طريق ملء النظام مع الزيوت المعدنية الملونة مع السودان رابعا الأحمر (~ 1 ملغ / 50 مل) في حقنة 1 مل مع إبرة (27 G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة نظيفة من بارافيلم تحت ممص مكروى الزجاج، والاستغناء من 5 - 10 ميكرولتر من ناقلات فيروسية على بارافيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتص ناقلات فيروسية عن طريق تحريك المكبس من حقنة الخلف عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة، وترسيم الحدود بين ناقلات النفط وعلى ماصة الزجاج. </li></ol> 1.2) التخدير، قص الشعر، HEAD التثبيت والإعداد للحج القحف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس (P49-63، C57BL / 6) في غرفة مليئة N 2 O و O 2 و 5٪ الأيزوفلورين. تقييم عمق التخدير عن فقدان حركة هادفة وتباطأ معدل التنفس (~ 60-90 / دقيقة). قص الشعر على الرأس عندما يتم تخدير الفأر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب الماوس في إطار التجسيمي، مع رئيسها تأمينها بواسطة القضبان الأذن حادة وأنفها وضعت في نظام التخدير والتهوية. الحفاظ على الأيزوفلورين المستمر عند 2 - 3٪. تطبيق مرهم الدموع الاصطناعية لكلتا العينين منذ الفئران تفقد المنعكس طرفة لهم تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة 0.05 مل من البوبرينورفين (0.1 ملغ / مل) عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة جراحية نظيفة مع 10٪ البوفيدون اليود والكحول 70٪ ثلاث مرات، بالتناوب بين الحلين وبدءا البوفيدون اليود. نبدأ من الجبهة ومسح نحو الخلف لإزالة أي قطع الشعر بالفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الجلد على كبار سو الرأس الذي يبدأ بين العينين وينتهي بين الأذنين. </li></ol> 1.3) حج القحف وإبر دقيقة جدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السمحاق عن طريق تمرير مع مسحة القطن ومن ثم تجف على سطح الجمجمة مع كرات القطن الأسنان. جعل علامة حول موقع الحقن، وحفر حول حافة علامة باستخدام لدغ الصلب الصغيرة مدعوم من الحفر بسرعة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العظام وتنظيف السطح مع المياه المالحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ماصة في ظهري ترك الوحشي المخطط مع الإحداثيات التالية (مم): +0.8 الأمامي الخلفي، وسطي الاطراف: +2.0، ظهري، بطني من سطح حنوني: -2.4 13. لاحظ أن هذه الإحداثيات تعني أن رأس الإبرة حقن مكروي يجلس فوق المخطط ظهراني (الشكل 1A، B)، وهذا يعني أن يخرقها إلا قليلا داخل هذه النواة. تجنب الأوعية الدموية الضارة. إذا يحدث ماصة ليكون الحق على الأوعية الدموية، وضبط قليلاتنسق كتبها ~ 0،1-0،2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء حقن بمعدل حقنة وضعت في 0.2 ميكرولتر / دقيقة، وعادة حقن 1-1،5 ميكرولتر من الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك ماصة في المكان بعد الحقن لمدة 10 دقيقة، ثم سحب ماصة ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من طريق إغلاق الجرح الجراحي مع خياطة مستمرة النايلون الخارجي خياطة. </li></ol> 1.4) الإنعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في قفص نظيفة على وسادة التدفئة لمدة 24 ساعة. لا عودة ماوس أن خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميثوبريم Sulfamethoxiazole (5 مل لكل 500 مل من الماء، تحتوي على 40 ملغ و 200 ملغ ميثوبريم sulfamethoxiazole) في الماء لمدة أسبوع. إدارة البوبرينورفين مرتين يوميا لمدة تصل إلى 3 أيام بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس على ضوء الظلام دورة 12 ساعة، الطعام والماء يوميا، والثانية هي المرجحة مرة واحدة في اليوم الواحد يصل إلى 3 أيام بعد الجراحة. في هذه الأيام 3، وتعتبر أي الفأر مع فقدان أكثر من 10٪ من وزن الجسم كما للخطر، وسيتم الموت الرحيم بدلا من التعرض للالتجريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بشكل منفصل، قم بتغيير القفص الماوس مرتين في الأسبوع، ورصد للصحة العامة مرة واحدة يوميا على الأقل. عادة، يتم استخدام الماوس غضون 2 - 3 أسابيع بعد إبر دقيقة جدا التجسيمي. </li></ol> 2. إعداد شريحة الدماغ الحاد للمتحد البؤر الكالسيوم 2+ التصوير 2.1) إعداد وتسجيل القطع الحلول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قطع حل تضم (مم): 194 السكروز، 30 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 10 D-الجلوكوز، 1 MgCl 2، 1.2 ناه 2 ص 4، و 26 NaHCO 3، مشبعة 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تسجيل تضم (مم): 124 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 1 MgCl 2، 10 D-الجلوكوز، 2 CaCl 2، 1.2 ناه 2 ص 4 </الفرعية&gt;، و 26 NaHCO 3؛ درجة الحموضة 7،3-7،4، 290-295 الميلي أسمول، مشبعة 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. ملء كوب شريحة المخ بمحلول عقد التسجيل، والاحتفاظ بها في 34 درجة مئوية. </li></ol> 2.2) التقطيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع إبر دقيقة جدا التجسيمي، بعمق والميؤوس تخدير الماوس، ثم قطع رأس ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الدماغ، واستخدام شفرة لإزالة النصف الأيمن uninjected، وجبل اليسار واحدة على علبة vibratome باستخدام الغراء عظمى. ملء علبة vibratome مع العازلة قطع الجليد الباردة، والحفاظ على تشبع مع ​​95٪ O 2 و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع شرائح الدماغ الاكليلية الجسم المخطط أو السهمي في سمك 300 ميكرون. عادة، 5 - 4 الاكليلية، أو 6-7 شرائح الجسم المخطط السهمي يمكن جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى عقد الكأس شريحة تحسنت في 34 درجة مئوية، والاحتفاظ بها هناك لمدة 30 دقيقة قبل تخزينها في درجة حرارة الغرفة لاحق recordiنانوغرام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح الدماغ في المخزن تسجيل الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل [كا 2+] ط التصوير. </li></ol> 3. المناعية (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوعين من حقن الفيروس، يروي الماوس transcardially مع برنامج تلفزيوني تليها 10٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة، إصلاح آخر، بين عشية وضحاها، وcryoprotect الدماغ مخزنة في 30٪ سكروز لمدة 2 يوما على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 40 ميكرومتر المقاطع باستخدام مشراح ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجزاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في 10 دقيقة الفاصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام احتضان لمدة 1 ساعة في برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل الماعز العادي ومع 0.5٪ تريتون X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الأجسام المضادة الأولية التي أعدت في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ تريتون X-100. كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة كما يلي: الدجاج مكافحة GFP 1: 1000، والماوس المضادة للS100β 1: 400، والماوس مكافحة NeuN 1: 600، والماوس مخلقة مكافحة الجلوتامين 1: 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجزاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في 10 مفي فترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية أعدت في برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل الماعز العادي لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كانت الأجسام المضادة الثانية على النحو التالي: الماعز المضادة للماوس Alexa546 1: 500، الماعز المضادة للدجاج Alexa488 1: 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الأقسام على الشرائح الزجاجية وجافة وتطبيق عدة قطرات من antifade المتوسطة المتزايدة، ثم تغطية ببطء الأقسام مع ساترة الزجاج. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور على المجهر متحد البؤر مع 40X عدسة الغمر النفط مع الفتحة العددية 1.3. </li></ol> 4. متحد البؤر [كا 2+] ط التصوير ملاحظة: [كا 2+] ط التصوير تم باستخدام مجهر متحد البؤر مع الغمر بالماء 40X عدسة الهدف مع الفتحة العددية 0.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مل لكل - ما بين 1 و 5 ساعة تشريح، مكان شريحة في غرفة تسجيل وsuperfuse مع العازلة تسجيل الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة مع معدل التدفق من 1 بعددقيقة. ثم وضع القيثارة البلاتين مع خيوط النايلون على أعلى شريحة لتقليل الحركة أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور وتحديد المخطط الظهري مع التلألؤ مشرق الميدان تحت هدف الغمر بالماء 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى غمر المياه 40X عدسة الهدف، وتشغيل خط 488 نانومتر ليزر الأرجون. عن طريق تغيير البؤري، والعثور على خلايا تقع على بعد حوالي 20 ميكرون تحت سطح شريحة، عرض مضان القاعدية في سوما والفروع والأفرع. من المذكرة، وخلايا للخطر عادة مضان عرض مستوى أعلى من المتوسط، والتي ينبغي تجنبها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وضع &quot;إطار مسح&quot; لبدء المسح الضوئي. عادة، لشدة الليزر تعديل إلى 0.5 - 5٪ من الحد الأقصى لانتاج كافية لصورة [كا 2+] أنا مع خلوي GCaMP3. لرصد [كا 2+] ط ديناميكية في كامل أراضي النجمية، و &quot;مسح إطار &#39;مع معدل المسح من 1 ثانية لكل إطار أو أسرع هو recommended، ولكن هذا يحتاج إلى أن قرر اعتمادا على التجربة في السؤال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، إلى صورة [كا 2+] i في العمليات، واستخدام التكبير الرقمي من 2 - 3 أضعاف لمراقبة 1 - 2 الخلايا النجمية في مجال كامل من الرأي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب بكسل المشبعة أثناء التسجيل، واستخدام وضع البحث &quot;حلو&quot; لpseudocolor الخلايا. تبدأ دائما مع &quot;تسجيل طيار&quot; لمدة 5 دقائق، لاختبار إذا ظهر اللون الأحمر كما يدل على التشبع. إذا كان الأمر كذلك، خفض انتاج الليزر السلطة، أو خفض PMT / كسب / موازنة القيم وإجراء تسجيل تجريبي آخر لاختبار القيم بكسل هي في حدود غير المشبعة. عادة، المعلمات مجتمعة استخدمت لتصوير نجمية [كا 2+] i في المخطط هي كما يلي: الليزر انتاج الطاقة 0،5-5٪ (10 ميغاواط)، PMT 550-650 فولت، وزيادة 2.0 - 3.5X، وتعويض 0 - 5٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد أتاحت الطرق الموصوفة هنا لنا للتعبير عن خلوي GCaMP3 الخلايا النجمية في الجسم المخطط في الجسم الحي لاحق [كا 2+] ط التصوير في الموقع. هذا الأسلوب له مزايا أكثر باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في، بما في ذلك التعبير القوي للاستهدا?...

الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية في كل مكان وفيرة من الدماغ. ومن الثابت أن الخلايا النجمية خدمة الدعم الحيوي والأدوار التماثل الساكن بما في ذلك التخفيف من K + التركيز في الفضاء خارج الخلية، امتصاص الناقلات العصبية، فضلا عن توفير المواد المغذية. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة أنها أيضا عرض [كا 2+] ط إشارات، والتي تحدث بشكل عفوي وبنسبة نشاط الخلايا العصبية 1. وجود نجمية [كا 2+] ط إشارات لقد كان يعتقد على نحو متزايد لتحريك تواصلهم مع الخلايا العصبية، وعلى هذا النحو قد تفسر على أنها شكل من أشكال &quot;كا 2+ استثارة&quot; داخل الخلايا النجمية. وتشير البيانات المتاحة على مدى العقدين الماضيين في ضبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية التي قد تواصل، ربما بطريقة ثنائية الاتجاه. أولا، تستجيب الخلايا النجمية في كثير من الأحيان مع زيادة في [كا 2+] أنا عندما تفعيلها من خلال الموصلات العصبية وneuromodulators سراحهم من الخلايا العصبية 2. الثانية، [كا 2+] ط زيادات في الخلايا النجمية تسبب اطلاق سراح يشير الجزيئات من الخلايا النجمية التي بدورها قد تؤثر على الخلايا العصبية والأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن الجزيئات التي صدرت من الخلايا النجمية تؤدي إلى تغيرات في وظائف من نقاط الاشتباك العصبي، والدوائر والسلوك في نهاية المطاف 3-5 عبر نجمية إلى إشارات الخلايا العصبية. ومع ذلك، يظل هذا المجال البحوث تتطور بسرعة، وقيل أن فهم أفضل ومفصل نجمية [كا 2+] هناك حاجة ط لحل بعض الشكوك الحالية 6. في الأعمال السابقة، وقد تبين أن تحميل الجزء الأكبر من العضوية الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر إلى فشل الخلايا النجمية لكشف موثوق [كا 2+] ط إشارات داخل الخلايا النجمية بكاملها في الثقافة و7-10 في الموقع. وقد نوقشت هذه النتائج من قبل الولايات المتحدة وغيرها 6،11،12. ومؤسسة Emerginز الصورة هي أن [كا 2+] ط إشارات ضمن عمليات نجمية (على سبيل المثال، الفروع والأفرع)، وهي المواقع الأساسية للتفاعل مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية، ونادرا ما يتم استكشافها بالتفصيل. في الآونة الأخيرة، واستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP3 عصاري خلوي، GCaMP5G وGCaMP6 وغشاء البلازما الإصدارات المربوطة (على سبيل المثال، LCK-GCaMP3) قد يسمح دراسة [كا 2+] ط إشارات في مقصورات صغيرة من الخلايا النجمية مثل هذه عمليات رقيقة، بالقرب من غشاء البلازما وداخل الأراضي كلها 7،8. ومع ذلك، GECIs ديك عيب واحد على العضوية الكالسيوم 2+ مؤشر الأصباغ وهذا هو الشرط للطرق الوراثية لتقديم جينات ترميز بشكل انتقائي على الخلايا النجمية في الجسم الحي لفترات تتراوح بين أسابيع لGECIs أن يكون مناسب التعبير عنها. وعادة ما يتحقق التعبير في الجسم الحي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا، الضربة القاضية في الفئران أو مع فيروس أساس تسليم التطبيقالصراصير. في المقالة إن الرب الحالية نفيدكم الأساليب والإجراءات المستخدمة لتقديم GECIs إلى الخلايا النجمية الجسم المخطط باستخدام فيروسات الغدة المرتبطة. ونحن نركز على خلوي GCaMP3 كمثال على ذلك، ولكن يعمل نفس الإجراء الأساسي لأي GECI الآخرين أو البروتين الفلوري مراسلة مقرها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette grinder</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >EG-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>44331</td>
			<td >a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >I mL syringe</td>
			<td >BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV2/5 virus</td>
			<td >UPenn vector core</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan red IV</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >67386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >CVS Pharmacy</td>
			<td>152355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryostat</td>
			<td >Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td >900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td >FOREDOM</td>
			<td >K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Santa cruz biotechnology</td>
			<td >sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super Glue</td>
			<td>Krazy&#174;Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microslicer</td>
			<td >Ted Pella</td>
			<td >DTK-Zero 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscopes</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >FV300 and FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal goat serum</td>
			<td >Vector</td>
			<td >S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken anti-GFP</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-s100&#946;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-NeuN</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-glutamine synthetase</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-mouse-Alexa546</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken-Alexa488</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-548-5J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting Medium</td>
			<td >Vector</td>
			<td >H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

للتعبير محدد نجمية من خلوي GCaMP3 في المخطط، استخدمنا الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) من 5 المصلي، وGFAP GfaABC 1 D المروج (الشكل 1A)، وهو ما ثبت سابقا أن يقود GCaMP3 قوية ومراسل الجين التعبير في قرن آمون والقشرية الخلايا النجمية 8،14. بعد أسبوعين من حقن مكروي الفير...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

التصوير الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في الجسم المخطط النجمية من الفئران الكبار باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Views.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

الردود تصوير الخلايا العصبية في الجهاز الاستعدادات لقطات للالميكعي تعرب عن جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

التصوير غشاء المحتملة مع اثنين من أنواع مشفرة وراثيا نيون الجهد مجسات

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

مؤشرات سينابس واحدة من الإفراج عن الغلوتامات والابوجدافي في شرائح الدماغ الحادة من الفئران العادية وهنتنغتون

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

تقليل نقص الأكسجة في شرائح فرس النهر من الكبار والشيخوخة الفئران

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.