Name: imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
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대부분의 작업과 관련된 인력은 NIH 보조금 NS060677에 의해 부분적으로 NIH가 MH099559과 (BSK에) MH10406​​9 부여에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 CHDI 재단에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 따라이었고, UCLA에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1.1) 마이크로 피펫 및 AAV2 / 5 바이러스로드 준비 <ol><li> 바이러스의 주입을위한 좋은 붕규산 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 수직 풀러와 두 단계 당기는 프로그램을 사용하여 마이크로 피펫을 당깁니다. 베벨 피펫 분쇄기를 이용하여 40 °의 각도로 피펫. 40 μm의 6 생크 길이 - - 7 MM 사용하기에 이상적이다 피펫 (20)의 팁 직경을 가질 것이다. 피펫 및 수술 도구를 압력솥. 드릴을 70 % 에탄올로 닦아 소독한다. </li><li> 10 μL 씩에 -80 ° C에서 바이러스 AAV2 / 5 GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 × 10 13 GC / ㎖)을 저장합니다. 그냥 수술 전, 냉동실에서 분주을 꺼내 번째를 채우기 사용까지 얼음에 저장전자 마이크로 피펫. </li><li> 바이러스가 시린지 펌프를 이용하여 함께 마이크로 피펫을 채운다. 단단히 강화 플런저 유리 주사기, 피팅 적절한 크기의 튜브 압축을 통해 튜브, 조각의 한쪽 끝을 연결합니다. 맞는 적절한 크기의 이동식 바늘 압축을 통해 튜브의 조각의 다른 쪽 끝으로 멸균 마이크로 피펫을 연결합니다. </li><li> 바이러스 벡터를 넣기 전에, 바늘 1ml의 주사기 수단 적색 IV (~ 1 ㎎ / 50ml)로 컬러 미네랄 오일 시스템 (27 G를 충전함으로써 튜브, 주사기 및 마이크로 피펫을 포함한 배기계로부터 공기 방울을 제거 ). </li><li> 유리 마이크로 피펫에서 파라 필름의 깨끗한 부분을 놓고 5 분배 - 파라 필름에 바이러스 벡터의 10 μl를. </li><li> 역방향 0.5 μL / 분으로 주사기의 플런저를 이동시킴으로써 바이러스 벡터를 빨아 및 유리 피펫에 벡터 및 오일 사이의 경계를 표시한다. </li></ol> 1.2) 마취, 머리 자르기, H개두술에 대한 EAD 고정 및 준비 <ol><li> N 2 O 및 O 2, 5 % 이소 플루 란 채워진 챔버 내로 마우스 (P49-63, C57BL / 6)을 넣어. 목적이있는 운동의 손실 둔화 호흡 (- 90 / 분 ~ 60)에 의해 마취의 깊이를 평가한다. 마우스를 마취 할 때 머리에 머리를 잘라. </li><li> 머리가 마취 및 환기 시스템에 배치 무딘 귀 바, 코에 의해 확보와 함께, 정위 프레임에 마우스를 맞 춥니 다. 2-3%에서 연속 이소 플루 란을 유지한다. 마우스가 마취하에 자신의 깜빡임을 잃게하기 때문에 두 눈에 인공 눈물 연고를 적용합니다. </li><li> 통증 완화를위한 피하 주사에 의해 프레 놀핀 (0.1 ㎎ / ㎖)의 0.05 mL로 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 10 % 포비돈 요오드 및 70 % 알코올로 3 회 면도 외과 영역, 두 용액 사이에서 교호 포비돈 요오드로 시작. 전면에서 시작하고 이미 잘라 머리카락을 제거하기 위해 뒤쪽으로 닦습니다. </li><li> 상단 O에 피부 절개를눈 사이에 시작하고 귀 사이에 끝나는 머리 F. </li></ol> 1.3) 개두술 Microinjections <ol><li> 면봉으로 쓸어 넘겨 골막을 분리 한 다음 치과 면봉과 두개골의 표면을 건조. 주사 부위 주위에 마크를 만들고, 고속 드릴에 의해 구동 소형 강철 버어를 사용하여 마크의 에지 주위 드릴. </li><li> 뼈를 제거하고 식염수로 표면을 청소합니다. </li><li> 전후방 0.8, 내측 - 외측 : 다음 좌표 (mm)과 선조체 (striatum) 측면 왼쪽 지느러미에 피펫을 놓고 +2.0, 지느러미 - 복부를 pial 표면 : -2.4 (13). 이 좌표는 미세 주사 바늘의 끝이 약간이 핵 내에 침투 즉, 단지 배 외측 선조체 (그림 1A, B) 위에 앉아 있다는 것을 의미합니다. 손상 혈관을 피하십시오. 피펫은 혈관에 바로 될 일이있는 경우, 버스를 조정0.2 mm - 0.1 ~에 의해 조정합니다. </li><li> 0.2 μL / 분으로 설정 주입 속도로 주입을 시작하고 일반적으로 바이러스의 1-1.5 μl를 주입. </li><li> 10 분 동안 주입 한 후 장소에 피펫을두고 천천히 피펫을 철회. </li><li> 연속 봉합 외부 나일론 봉합 수술 상처를 닫아 마칩니다. </li></ol> 1.4) 복구 <ol><li> 24 시간 동안 가열 패드에 깨끗한 케이지에 마우스를 넣습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. </li><li> 트리 메소 프림 Sulfamethoxiazole 추가 일주일 동안 물 (40 mg을 트리 메소 프림과 200 mg을 sulfamethoxiazole이 포함 된 500 ml의 물에 5 ml의). 수술 후 프레 놀핀에게 최대 3 일 동안 하루에 두 번 관리합니다. </li><li> , 먹이 12 시간 명암주기에 마우스를 유지하고 매일 물을차 수술 후 3 일에 한 번 일까지 당 가중된다. 이 3 일 동안, 10 % 이상의 체중 감량과 함께 임의의 마우스는 손실, 대신 실험 실시되는 안락사 될 것으로 간주된다. </li><li> 별도로, 일주일에 두 번 마우스 케이지를 변경하고, 적어도 하루에 한 번 건강을 모니터링. 정위 microinjections 후 3 주 - 일반적으로 마우스는 2 내에서 사용된다. </li></ol> 공 초점 칼슘 이미징 2. 급성 뇌 조각 준비 절단 및 녹화 솔루션 2.1) 준비. <ol><li> (MM)을 포함하는 용액을 절단 준비 : 194 크로즈, 30의 NaCl, 4.5 KCl을 10 D 글루코스, 하나의 MgCl 2, 1.2의 NaH 2 PO 4, 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 된 26의 NaHCO3를. </li><li> 포함하는 기록 용액 (mM)을 준비한다 (124)의 NaCl, 4.5 KCl을, 하나의 MgCl 2, D-10 글루코스,이 CaCl2를 1.2의 NaH 2 PO 4 </서브&gt;, 26의 NaHCO3; pH가 7.3-7.4을, 290 - 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 295 mOsm. 레코딩 솔루션과 뇌 조각을 들고 비커를 입력하고 34 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 2.2) 슬라이스 <ol><li> 2-3 주 정위 microinjections 후, 깊이와 끝으로 마우스를 마취 한 다음 목을 벨. </li><li> 뇌를 추출하고, uninjected 우반구를 제거하는 블레이드를 사용하고, 강력 접착제를 사용하여 vibratome 트레이에 왼쪽을 탑재합니다. 차가운 얼음 절단 버퍼와 vibratome 트레이를 입력하고 95 % O 2 5 % CO 2로 포화 유지. </li><li> 300 μm의 두께로 관상 또는 시상 선조체의 뇌 조각을 잘라. 일반적으로, 4-5 관상, 또는 6-7 시상 선조체 슬라이스는 수집 할 수 있습니다. </li><li> 34 ° C에서 따뜻하게 슬라이스 잡고 비커에 조각을 이동하고, 이후 recordi 실온에서 그들을 저장하기 전에 30 분 동안 그들을 거기 유지NG. </li><li> [칼슘] 난 촬상 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 산화 된 기록 버퍼에서 뇌 조각 부화. </li></ol> 3. 면역 조직 화학 (IHC) <ol><li> 두 주 바이러스 주사 후, PBS로 transcardially 가진 마우스 PBS에서 10 % 포르말린 관류 하였다. </li><li> 제거 하룻밤 후 수정, 적어도 2 일 동안 버퍼링 30 % 자당의 뇌를 cryoprotect. </li><li> 그라 이오 스탯 마이크로톰을 사용하여 40 μm의 섹션을 준비합니다. </li><li> 10 분 간격으로 섹션을 PBS로 3 회 헹군다. </li><li> 10 % 정상 염소 혈청과 PBS에서 1 시간 동안 0.5 % 트리톤 X-100으로 섹션을 품어. </li><li> 0.5 % 트리톤 X-100와 PBS에서 준비 차 항체로 4 ℃에서 하룻밤 섹션을 품어. 다음과 같이 사용되는 일차 항체이었다 : 닭 항 GFP 1 : 1,000, 마우스 항 S100β 1 : 400, 마우스 항 NeuN 1 : 600, 마우스 항 글루타민 신테 1 : 300. </li><li> 10m에서 섹션을 PBS로 3 회 씻어간격. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 10 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 제조 된 이차 항체 섹션을 인큐베이션. 다음 두 번째 항체는 같았다 : 염소 항 - 마우스 Alexa546 1 : 500, 염소 항 - 닭 Alexa488 1 : 500. </li><li> 천천히 유리 커버 슬립과 섹션을 포함, 건조 유리 슬라이드에 섹션을 마운트하고 antifade 설치 매체의 몇 방울을 적용합니다. 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li><li> 1.3의 개구와 40X 기름 침지 렌즈와 공 초점 현미경에서 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 공 초점 [칼슘 2 +] 나는 영상 참고 : [칼슘 2 +] 나는 0.8의 개구와 40 배 침수 대물 렌즈와 공 초점 현미경을 사용하여 수행되었다 이미징. <ol><li> 1 ㎖ 당 2 - 시간 1 ~ 5의 기록 챔버 내에서, 도시 슬라이스 및 슬라이스 (1)의 유량을 갖는 실온에서 산소 기록 버퍼와 superfuse 후분. 그 후 실험 기간 동안 움직임을 최소화하기 위해 슬라이스 위에 나일론 문자열 백금 하프 배치. </li><li> 시각화 및 10 배 침수 목적에서 밝은 필드 발광과 등쪽 선조체 (striatum)를 찾습니다. </li><li> 40 배 침수 대물 렌즈로 전환 한 아르곤 레이저의 488 nm의 라인을 켭니다. 초점면을 변경, 소마, 지점과 branchlets의 기초 형광 표시, 약 20 μm의 슬라이스 표면 아래에있는 세포를 찾을 수 있습니다. 참고로, 손상된 세포는 일반적으로 피해야한다 평균 이상 형광 수준을 표시합니다. </li><li> 스캔을 시작하는 &#39;프레임 스캔&#39;모드를 사용합니다. 통상적으로, 0.5로 조정 한 레이저 강도 - 최대 출력의 5 % [칼슘] 전 사이토-GCaMP3 가진 이미지에 충분하다. 성상 세포의 전체 영역에 [칼슘 2 +] 나는 역학을 모니터링하기위한 프레임 이상의 속도 당 1 초의 스캔 속도와 &#39;프레임 스캔&#39;추천!입니다nded하지만,이 문제의 실험에 따라 결정해야합니다. </li><li> 보기의 전체 필드 2 성상 세포 - 1을 모니터 3 배 - 필요한 경우, 이미지에 [칼슘 2 +] 나는 과정에서, 2의 디지털 배율을 사용합니다. </li><li> 녹화 중에 포화 픽셀을 방지하기 위해, 세포를 사색하는 &#39;히로&#39;조회 모드를 사용합니다. 항상 붉은 색은 채도의 표시로 나타나는 경우 테스트하기 위해, 약 5 분 동안 &quot;파일럿 녹화&quot;로 시작합니다. 이 경우, 레이저 출력을 낮추거나 PMT를 낮추고 / 이득 / 오프셋 값과 화소 값은 비 포화 영역에있는 테스트하는 다른 파일럿 기록을 수행한다. - 5 % (10 메가 와트), PMT 550-650 볼트, 게인 2.0 - 레이저 출력 전력 0.5 3.5 배, 0 오프셋 : 일반적으로 결합 된 매개 변수 영상 성상 세포에 사용 [칼슘] 선조체에서 나는 다음과 같습니다 - 5 %. </li></ol>

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여기에 설명 된 방법은 우리가 현장에서 후속 [칼슘 2 +] 나는 영상을 위해 생체 내에서 선조체의 성상 세포에서 사이토-GCaMP3을 표현 할 수있다. 이 방법은 형질 전환 또는 강력한 대상 단백질, 신속성의 표현과 실험적인 구현 및 해부학 적 특이성의 유연성을 포함 노크에서 마우스를 사용하여보다 이점이있다. AAV2 / 5 사용 GCaMP3의 발현은 구체적이고 강력한 것으로 밝?...

성상 세포는 뇌의 유비쿼터스와 풍부한 신경 교세포 있습니다. 그것은 잘 성상 세포가 중요한 지원 및 세포 외 공간에서의 K + 농도의 버퍼링, 흡수 신경 전달 물질의를 제공 할뿐만 아니라 영양소를 포함 항상성 역할을 역할을한다는 설정됩니다. 그러나, 최근의 연구들은 또한 자연적으로 발생하여 신경 세포의 활동을 1 증가 [칼슘] 내가 신호를 표시하는 것을 알 수있다. 성상 세포의 존재는 [칼슘 2+] I 시그널링 점점 뉴런과의 통신을 유발하는 것으로 생각되고 있으며, 이와 같이 성상 내의 &quot;칼슘 흥분성&quot;의 형태로 해석되었다. 지난 20 년 동안 사용할 수있는 데이터는 성상 세포와 신경 세포는 아마도 양방향 방식으로 통신 할 수있는 두 가지 설정을 제안한다. 첫째, 성상 세포는 종종 내가 신경 전달 물질에 의해 활성화 [칼슘]의 증가로 응답신경이 해제 신경 조절. 둘째, [칼슘 2 +] 성상 세포 내에서 내가 증가는 다시 신경과 혈관에 영향을 미칠 수있는 성상 세포에서 신호 전달 분자의 방출을 야기한다. 증거는 성상 세포에서 방출 분자가 성상 세포 간 신경 신호를 통해 ​​시냅스 회로와 궁극적으로 행동 3-5의 기능의 변화로 이어질 것이 좋습니다. 그러나이 급속히 발전 연구 분야 남아 있고, 이는 성상 세포의 더 상세한 이해는 [칼슘 2+] I는 현재의 불확실성 (6)의 일부를 해결하기 위해 필요하다고 주장하고있다. 과거의 연구에서,이 성상 세포에 유기 칼슘 지표 염료의 대량로드가 확실하게 감지하지 못하는 것을 증명했다 [칼슘 2 +] 문화 및 현장 7-10에서 전체 성상 세포 내에서 내가 신호. 이러한 연구 결과는 우리와 다른 사람 6,11,12에 의해 논의되었다. emerginG 사진은 [칼슘 2 +] 나는 신경과 혈관과의 상호 작용에 대한 기본 사이트입니다 성상 세포 프로세스 (예를 들면, 지점 및 branchlets) 내에서 신호를 거의 자세히 살펴되어 있지 않은 것입니다. 최근에는 세포질 GCaMP3, GCaMP5G 및 GCaMP6 및 세포막과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 사용이 닿는 버전 (예를 들어, Lck에-GCaMP3)는 성상 세포 등의 작은 구획에 [칼슘] 내가 신호의 연구를 허용하고있다 얇은 프로세스, 세포막 근처 전체 지역 7,8 내. 그러나 GECIs 유기 칼슘 2 + 지표 염료를 통해 한 가지 단점을 가지고 GECIs 적절하게 할 표현하는 유전 적 방법은 주 단위로 생체 내에서 성상 세포에 선택적으로 인코딩 유전자를 전달하기 위해 그 요구 사항입니다. 생체 내에서 발현은 일반적으로 노크에 쥐 또는 바이러스를 기반으로 배달 응용 프로그램과 함께, 형질 전환 마우스를 사용하여 달성된다바퀴벌레. 본 조브 기사에서 우리는 아데노 - 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상 세포에 GECIs을 제공하기 위해 사용되는 방법과 절차를보고합니다. 우리는 예를 들어 사이토-GCaMP3에 초점을 동일한 기본 절차는 다른 GECI 또는 형광 단백질 기반 기자 모든 작동합니다.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

줄무늬 체에서 사이토-GCaMP3의 성상 세포 특이 적 발현을 위해, 우리는 이전에 견고 GCaMP3 및 리포터 유전자를 구동하는 도시 된 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 5 혈청 형 및 GFAP GfaABC 한 D 촉진제 (도 1A)를 사용 해마와 대뇌 피질의 성상 세포 8, 14의 식입니다. 2 주 마우스 선조체에 바이러스 미세 주입 한 후, 마우스 (~ 10 주)을 관류하고 IHC는 선조체 (그림 1B)의 ?...

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

이미징 세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.8K 조회수.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

신경과학

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

생쥐의 치상동맥 세포에서 뉴런 활성을 위한 실시간 이미징 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

저자 스포트라이트: Investigating Neural Activity of Dentate Gyrus Granule Cells with Miniature Microscope(소형 현미경으로 치상골 과립 세포의 신경 활동 조사)

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

이미징 세포 내 칼슘

요약

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