La majorité des travaux et le personnel impliqués ont été pris en charge par le NIH subvention NS060677 et en partie par les NIH accorde MH099559 et MH104069 (à BSK). Une partie du travail a également été soutenu par la Fondation CHDI.

Tous les protocoles d&#39;animaux étaient en conformité avec les Instituts nationaux américains de la santé Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;UCLA. 1.1) Préparer Micropipette et AAV2 / 5 Virus de chargement <ol><li> Utilisation de fines micropipettes en verre borosilicaté pour l&#39;injection du virus. Tirez la micropipette en utilisant un programme de traction en deux étapes avec un extracteur vertical. Biseau la pipette à un angle de 40 ° en utilisant un broyeur de pipette. La pipette qui est idéal pour être utilisé aura un diamètre de pointe de 20 à 40 um et une longueur de tige de 6-7 mm. Autoclaver la pipette et instruments chirurgicaux. Le foret est stérilisée par essuyage avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Stocker le virus AAV2 / 5-GfaABC une D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), à -80 ° C dans des aliquotes de 10 pi. Juste avant la chirurgie, prendre les aliquotes du congélateur et stocker sur la glace jusqu&#39;à son utilisation pour le remplissage ee micropipette. </li><li> Remplir la micropipette avec le virus en utilisant une pompe à seringue. Relier hermétiquement une extrémité d&#39;un morceau de tuyau, à travers un tube de compression raccord de taille appropriée, d&#39;une seringue en verre avec un piston renforcé. Attacher la micropipette autoclave à l&#39;autre extrémité du morceau de tube par l&#39;intermédiaire d&#39;une compression de l&#39;aiguille de taille appropriée raccord amovible. </li><li> Avant de charger le vecteur viral, d&#39;éliminer les bulles d&#39;air du système de pompage comprenant un tube, seringue et micropipette par remplissage de l&#39;installation avec une huile minérale de couleur avec du Soudan IV rouge (~ 1 mg / 50 ml) dans une seringue de 1 ml avec une aiguille (27 G ). </li><li> Placez un morceau de parafilm propre sous la micropipette de verre, et distribuer 5 - 10 pi du vecteur viral sur le parafilm. </li><li> Sucer le vecteur viral en déplaçant le piston de la seringue vers l&#39;arrière à 0,5 pi / min, et marquer la limite entre le vecteur et l&#39;huile sur la pipette de verre. </li></ol> 1.2) Anesthésie, coupe de cheveux, HEAD fixation et préparation pour Craniotomy <ol><li> Mettre une souris (P49-63, C57BL / 6) dans la chambre rempli de N 2 O et O 2, et 5% d&#39;isoflurane. Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie par une perte de mouvement intentionnel et un rythme respiratoire ralenti (~ 60-90 / min). Couper les cheveux sur la tête quand la souris est anesthésiée. </li><li> Monter la souris dans le cadre stéréotaxique, avec sa tête fixé par des barres d&#39;oreille émoussées et son nez placés dans un système d&#39;anesthésie et de ventilation. Maintenir l&#39;isoflurane continu à 2 - 3%. Appliquer des larmes artificielles pommade pour les deux yeux puisque les souris perdent leur réflexe de clignement sous anesthésie. </li><li> Administrer 0,05 ml de buprénorphine (0,1 mg / ml) par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur. </li><li> Zone chirurgicale pur avec 10% de povidone iode et 70% d&#39;alcool trois fois, en alternant entre les deux solutions de départ et avec de la povidone iode. Commencez par l&#39;avant et vers l&#39;arrière essuyer pour enlever les poils déjà coupées. </li><li> Faire une incision de la peau sur le dessus of la tête qui commence entre les yeux et se termine entre les oreilles. </li></ol> 1.3) Craniotomy et microinjections <ol><li> Retirez le périoste en balayant avec un coton-tige, puis sécher la surface du crâne avec des boules de coton dentaires. Faire une marque sur le site d&#39;injection, et percer sur le pourtour de la marque à l&#39;aide d&#39;une petite fraise en acier alimenté par un forage à grande vitesse. </li><li> Retirer l&#39;os et nettoyer la surface avec une solution saline. </li><li> Placez la pipette dans la dorsale latéral gauche striatum avec les coordonnées suivantes (mm): 0,8 antéro-postérieur, médio-latérale: 2,0, dorso-ventral de la surface piales: -2,4 13. A noter que ces coordonnées signifie que la pointe de l&#39;aiguille de micro-injection se trouve juste au-dessus du striatum dorso-latéral (figure 1A, B), ce qui signifie qu&#39;il ne pénètre légèrement à l&#39;intérieur de ce noyau. Évitez d&#39;endommager les vaisseaux sanguins. Si la pipette se trouve être à droite sur un vaisseau sanguin, légèrement ajuster lales coordonnées de ~ 0,1 à 0,2 mm. </li><li> Lancer injection avec un taux d&#39;injection fixée à 0,2 pi / min, et injecter 1 à 1,5 ul de virus. </li><li> Laisser la pipette en place après l&#39;injection pendant 10 min, puis retirer la pipette lentement. </li><li> Terminez par la fermeture de la plaie chirurgicale avec suture continue nylon externe suture. </li></ol> 1.4) Recouvrement <ol><li> Mettez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pendant 24 heures. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. Ne laissez pas la souris sans surveillance tant qu&#39;il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. </li><li> Ajouter triméthoprime Sulfamethoxiazole (5 ml par 500 de l&#39;eau, contenant 40 mg de triméthoprime et 200 mg sulfamethoxiazole) dans l&#39;eau pendant une semaine. Administrer buprénorphine deux fois par jour pour un maximum de trois jours après la chirurgie. </li><li> Maintenir la souris sur un cycle lumière-obscurité de 12 h, nourris et abreuvés quotidiennement, une est pondéré une fois par jour jusqu&#39;à 3 jours après la chirurgie. Dans ces 3 jours, aucune souris avec une perte de plus de 10% du poids du corps est considérée comme compromise, et sera euthanasiée au lieu d&#39;être soumis à l&#39;expérimentation. </li><li> Par ailleurs, changer la cage de la souris deux fois par semaine, et de surveiller la santé générale au moins une fois par jour. En général, la souris est utilisé dans les 2 - 3 semaines après les micro-injections stéréotaxiques. </li></ol> 2. Trancher aiguë cerveau Préparation pour la Imaging confocale Ca 2.1) Préparation de coupe et Solutions d&#39;enregistrement. <ol><li> Préparer une solution comprenant (mM) de coupe: 194 saccharose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 le D-glucose, 1 de MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 et NaHCO 3 26, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2. </li><li> Préparer la solution d&#39;enregistrement comprenant (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 le D-glucose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt;, et 26 NaHCO 3; pH 7.3 à 7.4, de 290 à 295 mOsm, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2. Remplir le bécher tranche de cerveau tenue avec une solution d&#39;enregistrement, et les conserver à 34 ° C. </li></ol> 2.2) tranchage <ol><li> Deux à trois semaines après microinjections stéréotaxiques, profondément et terminale anesthésier la souris, puis décapiter. </li><li> Extraire le cerveau, et utiliser une lame pour enlever l&#39;hémisphère droit non injectée, et monter celle de gauche sur le plateau vibratome utilisant la super glue. Remplissez le bac à glace vibratome avec un tampon de coupe froid et gardez-le saturant avec 95% d&#39;O 2 et 5% de CO 2. </li><li> Couper les tranches de cerveau striatum coronale ou sagittale à 300 um d&#39;épaisseur. Habituellement, 4-5 coronaire, ou 6-7 tranches striatales sagittales peuvent être collectées. </li><li> Transférer les tranches dans le bécher de maintien de tranche réchauffé à 34 ° C, et de les y maintenir pendant 30 min avant de les stocker à température ambiante pendant recordi ultérieureng. </li><li> Incuber les tranches de cerveau dans du tampon d&#39;enregistrement oxygénée à la température ambiante pendant au moins 30 min avant de [Ca2 +] i imagerie. </li></ol> 3. L&#39;immunohistochimie (IHC) <ol><li> Deux semaines après l&#39;injection du virus, la souris perfuser transcardiaque avec du PBS suivi par 10% de formaline dans du PBS. </li><li> Retirer, post-fixer nuit, et cryoprotect le cerveau en tampon saccharose à 30% pendant au moins 2 jours. </li><li> Préparer 40 um sections à l&#39;aide d&#39;un microtome de cryostat. </li><li> Rincer les sections 3 fois avec du PBS à intervalle de 10 min. </li><li> Incuber les coupes pendant 1 h dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal et avec 0,5% de Triton X-100. </li><li> Incuber les coupes pendant une nuit à 4 ° C dans l&#39;anticorps primaire préparée dans du PBS avec 0,5% de Triton X-100. Les anticorps primaires utilisés étaient les suivants: anti-GFP poulet 1: 1000, de souris anti-S100β 1: 400, de souris anti-NeuN 1: 600, de souris anti-glutamine synthétase 1: 300. </li><li> Rincer les sections 3 fois avec du PBS à 10 mdans les intervalles. </li><li> Incuber les coupes avec des anticorps secondaires préparées dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal pendant 2 h à température ambiante. Les anticorps secondaires étaient les suivants: chèvre anti-souris Alexa546 1: 500, de chèvre anti-poulet Alexa488 1: 500. </li><li> Monter les coupes sur des lames de verre, sécher et appliquer quelques gouttes de antifade milieu de montage, puis couvrir lentement les sections avec une lamelle de verre. Conserver les lames à 4 ° C. </li><li> Prendre des images sur un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l&#39;huile 40X avec une ouverture numérique de 1,3. </li></ol> 4. confocale [Ca 2+] i Imaging REMARQUE: [Ca2 +] i a été effectuée en utilisant l&#39;imagerie de microscope confocal avec un objectif 40X à immersion d&#39;eau avec une ouverture numérique de 0,8. <ol><li> Entre 1 et 5 h après la coupe, tranche lieu dans la chambre d&#39;enregistrement et superfuse avec le tampon d&#39;enregistrement oxygéné à température ambiante avec un débit de 1 - 2 ml parmin. Ensuite, placez une harpe de platine avec des cordes en nylon sur le dessus de la tranche pour minimiser le mouvement pendant l&#39;expérience. </li><li> Visualiser et localiser le striatum dorsal avec le champ lumineux luminescence sous un objectif à immersion d&#39;eau 10X. </li><li> Passez à l&#39;immersion dans l&#39;eau 40X objectif, et tourner sur la ligne 488 nm du laser Argon. En changeant le plan focal, trouver des cellules situées à environ 20 um sous la surface de la tranche, affichant fluorescence basale à Soma, branches et rameaux. Fait à noter, les cellules compromis affichent généralement le niveau de fluorescence dessus de la moyenne, qui devrait être évité. </li><li> Utilisez le mode «balayage d&#39;image» pour lancer la numérisation. En général, l&#39;intensité du laser ajusté à 0,5 à 5% de la puissance maximale est suffisante pour l&#39;image [Ca 2+] i par cyto-GCaMP3. Pour la surveillance de [Ca2 +] i dynamique dans l&#39;ensemble du territoire des astrocytes, le &#39;balayage d&#39;image »avec une vitesse de balayage de 1 s par châssis ou plus rapide est recommeDEMVSO, mais cela doit être décidé en fonction de l&#39;expérience en question. </li><li> Si nécessaire, à l&#39;image de [Ca 2+] i dans les processus, utiliser un grossissement numérique de 2 - 3 fois pour surveiller 1 - 2 astrocytes dans l&#39;ensemble du champ de vue. </li><li> Pour éviter pixels saturés pendant l&#39;enregistrement, utilisez le mode de recherche &#39;HiLo&#39; de pseudo-cellules. Toujours commencer par un &quot;enregistrement de pilote&quot; pendant environ 5 min, à tester si la couleur rouge apparaît comme indication de saturation. Si oui, plus la puissance de sortie de laser, ou abaisser le PMT / Gain / valeurs de décalage et d&#39;effectuer un autre enregistrement de pilote pour tester les valeurs de pixels sont dans la gamme non saturé. En règle générale, les paramètres combinés utilisés pour l&#39;imagerie des astrocytes [Ca 2+] i dans le striatum sont les suivantes: laser de puissance de sortie de 0,5 à 5% (de 10 mW), PMT 550 à 650 Volts, Gain 2.0 - 3.5x, et l&#39;offset 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici nous ont permis d&#39;exprimer cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum in vivo pour la suite [Ca 2+] i imagerie in situ. Cette méthode a des avantages sur l&#39;aide transgénique ou souris knock-in, y compris l&#39;expression robuste de la protéine ciblée, la rapidité et la souplesse de mise en œuvre expérimentale et la spécificité anatomique. L&#39;expression de GCaMP3 utilisant VAA2 / 5 a été trouvé pour être plus précis et robuste. ...

Les astrocytes sont des cellules gliales omniprésents et abondantes du cerveau. Il est bien établi que les astrocytes servent soutien vital et rôles homéostatiques y compris tampon de concentration de K + dans l&#39;espace extracellulaire, recaptage des neurotransmetteurs, ainsi que fournir des éléments nutritifs. Cependant, des études récentes montrent qu&#39;ils affichent aussi [Ca2 +] i signaux, qui se produisent spontanément et sont augmentés de l&#39;activité neuronale 1. L&#39;existence d&#39;astrocytes [Ca 2+] i la signalisation a été de plus en plus pensé à déclencher leur communication avec les neurones, et en tant que tel a été interprétée comme une forme de &quot;Ca 2+ excitabilité&quot; dans les astrocytes. Les données disponibles au cours des deux dernières décennies suggèrent deux contextes dans lesquels les astrocytes et les neurones peuvent communiquer, peut-être d&#39;une manière bidirectionnelle. Tout d&#39;abord, les astrocytes réagissent souvent avec une augmentation de la [Ca 2+] i lorsqu&#39;il est activé par les neurotransmetteurs etneuromodulateurs libérés par les neurones 2. Deuxièmement, [Ca 2+] i augmente dans les astrocytes provoquer la libération de molécules de signalisation des astrocytes qui peuvent à leur tour affecter les neurones et les vaisseaux sanguins. Les preuves suggèrent que les molécules libérées par les astrocytes conduisent à des changements dans les fonctions de synapses, les circuits et en fin de compte le comportement de signalisation par l&#39;intermédiaire de 3 à 5 astrocyte-à-neurone. Cependant, cela reste un domaine de recherche en plein développement, et il a été avancé que d&#39;une meilleure compréhension et détaillée des astrocytes [Ca 2+] i est nécessaire pour résoudre certaines des incertitudes actuelles 6. Dans le travail passé, il a été démontré que le chargement en vrac de Ca 2+ organiques colorants indicateurs dans les astrocytes ne parvient pas à détecter de manière fiable [Ca 2+] i signaux dans les astrocytes entiers de la culture et in situ 7-10. Ces résultats ont été discutés par nous et d&#39;autres 6,11,12. Le Emerging image est que [Ca 2+] i signaux au sein des processus d&#39;astrocytes (par exemple, les branches et rameaux), qui sont les premiers sites d&#39;interactions avec les neurones et les vaisseaux sanguins, ont rarement été étudiée en détail. Récemment, l&#39;utilisation d&#39;indicateurs de calcium génétiquement codées (GeCIS) comme GCaMP3 cytosolique, GCaMP5G et GCaMP6 et membrane plasmique versions captif (par exemple, Lck-GCaMP3) a permis l&#39;étude de [Ca 2+] i signaux dans de petits compartiments de astrocytes ces processus minces, près de la membrane plasmique et dans des territoires entiers 7,8. Cependant, GeCIS ont un inconvénient plus organiques Ca 2+ colorants indicateurs et qui est l&#39;exigence des méthodes génétiques pour livrer les gènes codant sélective pour les astrocytes in vivo pour des périodes de plusieurs semaines pour la GeCIS être appropriée exprimé. Expression in vivo est généralement réalisé en utilisant des souris transgéniques, souris knock-in ou par le virus basé livraison appcafards. Dans l&#39;article présent JoVE nous présentons les méthodes et procédures utilisées pour fournir GeCIS à astrocytes striataux utilisant des virus adéno-associés. Nous nous concentrons sur cyto-GCaMP3 comme un exemple, mais la même procédure de base fonctionne pour tout autre GECI ou fluorescent reporter à base de protéines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette grinder</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >EG-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>44331</td>
			<td >a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >I mL syringe</td>
			<td >BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV2/5 virus</td>
			<td >UPenn vector core</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan red IV</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >67386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >CVS Pharmacy</td>
			<td>152355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryostat</td>
			<td >Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td >900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td >FOREDOM</td>
			<td >K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Santa cruz biotechnology</td>
			<td >sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super Glue</td>
			<td>Krazy&#174;Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microslicer</td>
			<td >Ted Pella</td>
			<td >DTK-Zero 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscopes</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >FV300 and FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal goat serum</td>
			<td >Vector</td>
			<td >S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken anti-GFP</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-s100&#946;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-NeuN</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-glutamine synthetase</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-mouse-Alexa546</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken-Alexa488</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-548-5J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting Medium</td>
			<td >Vector</td>
			<td >H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Pour les astrocytes expression spécifique de cyto-GCaMP3 dans le striatum, nous avons utilisé un virus adéno-associé (AAV) du 5 serotype, et la GFAP GfaABC 1 promoteur de D (figure 1A), qui a été précédemment montré pour conduire GCaMP3 robuste et gène rapporteur expression dans l&#39;hippocampe et les astrocytes corticaux 8,14. Deux semaines après le virus de la micro-injection dans le striatum de souris, la souris (~ 10 semaines) a été perfusée et IHC a été réali...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K vues.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 