רוב העבודה וכוח האדם המעורב נתמכו על ידי NIH מענק NS060677 ובחלקו על ידי מענקי NIH MH099559 וMH104069 (לBSK). חלק מהעבודה נתמכת גם על ידי קרן CHDI.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים היו בהתאם למכוני בריאות הלאומי של ארה&quot;ב מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש ב- UCLA. 1.1) הכן טוען Micropipette וAAV2 / 5 וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes זכוכית בורוסיליקט קנס על הזריקה של הנגיף. משוך את micropipette באמצעות תכנית מושכת בשני שלבים עם חולץ אנכי. פוע פיפטה בזווית של 40 מעלות על ידי שימוש במטחנת פיפטה. פיפטה כי הוא אידיאלי לשימוש תהיה בקוטר טיפ של 20 - 40 מיקרומטר ואורך שוק של 6 - 7 מ&quot;מ. החיטוי פיפטה ומכשירי ניתוח. התרגיל מעוקר על ידי מנגב עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הווירוס AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 13 GC / ml), ב -80 מעלות צלזיוס ב 10 aliquots μl. רק לפני הניתוח, להוציא את aliquots מהמקפיא ולאחסן על קרח עד משמש למילוי הmicropipette דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette עם וירוס באמצעות משאבת מזרק. בחוזקה חבר קצה אחד של פיסת הצינור, דרך דחיסת צינורות בגודל מתאימה הולמת, למזרק זכוכית עם בוכנה מחוזקת. צרף micropipette autoclaved לקצה השני של פיסת הצינור דרך דחיסת מחט נשלף בגודל מתאים מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת וקטור ויראלי, להסיר בועות אוויר ממערכת השאיבה כולל צינורות, מזרק וmicropipette על ידי מילוי המערכת עם שמן מינרלים צבעוניים עם IV סודאן האדום (~ 1 מ&quot;ג / 50 מיליליטר) במזרק 1 מיליליטר עם מחט (27 G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה נקייה של parafilm תחת זכוכית micropipette, ולוותר על 5 - 10 μl של וקטור ויראלי על parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצוץ וקטור ויראלי על ידי הזזת הבוכנה של המזרק לאחור על 0.5 μl / דקה, ולסמן את הגבול בין הווקטור והשמן על פיפטה הזכוכית. </li></ol> 1.2) הרדמה, חיתוך שיער, HEAD קיבוע והכנה לCraniotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עכבר (P49-63, C57BL / 6) לתוך התא מלא בN 2 O ו- O 2, וisoflurane 5%. להעריך את עומק ההרדמה על ידי אובדן של תנועה תכליתית ושיעור האטת נשימה (~ 60-90 / min). לגזור את שיער על הראש כאשר העכבר הוא הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את העכבר במסגרת stereotaxic, עם הראש שלה מובטח בארים בוטים אוזן ואפה להציב לתוך מערכת הרדמה והנשמה. לשמור isoflurane הרציף של 2 - 3%. החל משחה דמעות מלאכותיות לשתי העיניים מאז עכברים לאבד רפלקס המצמוץ שלהם תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 0.05 מיליליטר של עצירות (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי הזרקה תת עורית להקלה על כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור נקי כירורגית עם 10% יוד povidone ושלוש פעמים אלכוהול 70%, לסירוגין בין שני הפתרונות ומתחיל עם יוד povidone. התחל מהחזית ולנגב לכיוון האחורי כדי להסיר את כל שערות כבר חתכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור על o העליונהf הראש שמתחיל בין העיניים ומסתיים בין האוזניים. </li></ol> 1.3) Craniotomy וmicroinjections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום העצם על ידי והעביר עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לייבש את פני השטח של הגולגולת עם כדורי צמר גפן שיניים. להטביע את חותמו סביב אתר ההזרקה, ולקדוח מסביב לקצה של הסימן באמצעות Burr פלדה קטן מופעל על ידי תרגיל במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העצם ולנקות את השטח עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פיפטה לתוך הגב עזב לרוחב סטריאטום עם הקואורדינטות הבאות (מ&quot;מ): 0.8 קדמי, אחורי, המדיאלי-צדדיות: 2.0, גב-הגחון מהשטח pial: -2.4 13. שים לב שהקואורדינטות אלה אומרת שקצה מחט microinjection יושב בדיוק מעל סטריאטום דורסולטרלי (איור 1 א, ב &#39;), מה שאומר שרק מעט חודר בתוך גרעין זה. הימנע מכלי דם מזיקים. אם פיפטה קורה להיות ממש על כלי דם, מעט להתאיםקואורדינטות על ידי ~ 0.1-0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרקה עם שיעור הזרקה נקבע על 0.2 μl / דקה, ובדרך כלל להזריק 1 עד 1.5 μl של וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פיפטה במקום לאחר ההזרקה במשך 10 דקות, ולאחר מכן למשוך את פיפטה לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיים על ידי סגירת פצע הניתוח עם תפר ניילון חיצוני תפר מתמשך. </li></ol> 1.4 שחזור) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום למשך 24 שעות. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאיר ללא השגחה העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 מ&quot;ל לכל 500 מיליליטר מים, המכיל 40 trimethoprim מ&quot;ג ו -200 sulfamethoxiazole מ&quot;ג) במים במשך שבוע. לנהל עצירות שתי פעמים ביום לתקופה של עד 3 ימים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר על מחזור אור-חושך 12 שעות, האכיל והשקה יומי,nd משוקלל פעם אחת ביום עד לעד 3 ימים לאחר ניתוח. ב 3 הימים האלה, כל עכבר להפסד של יותר מ -10% במשקל גוף נחשב כסכנה, ויהיה מורדמים במקום להיות נתון לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, לשנות את כלוב העכבר פעמיים בשבוע, ולפקח על בריאות כללית לפחות פעם ביום. בדרך כלל, העכבר משמש בתוך 2 - 3 שבועות לאחר microinjections stereotaxic. </li></ol> 2. חריף מוח Slice הכנת הדמיה 2 + Confocal Ca 2.1) עריכת חיתוך ופתרונות הקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיתוך פתרון כולל (מ&quot;מ): 194 סוכרוז, 30 NaCl, KCl 4.5, 10 D-גלוקוז, 1 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, ו -26 NaHCO 3, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הקלטה הכולל (מ&quot;מ): 124 NaCl, KCl 4.5, 1 MgCl 2, 10 D-גלוקוז, 2 CaCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4 </תת&gt;, ו -26 NaHCO 3; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. כשמלא את כוס פרוסת המוח מחזיקה ביחד עם פתרון הקלטה, ולשמור אותו על 34 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2.2) חיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועות עד שלושה שבועות לאחר microinjections stereotaxic, עמוק וסופנים להרדים את העכבר, ולאחר מכן לערוף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח, ולהשתמש בלהב כדי להסיר את האונה הימנית uninjected, והר נותר אחד על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. מלא את מגש vibratome עם חיץ חיתוך קר כקרח, ולשמור להרוות אותו עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות מוח striatal העטרה או sagittal ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל, 4 - העטרה 5, או 6 - 7 פרוסות striatal sagittal ניתן לאסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות לכוס מחזיקה פרוסה חיממה על 34 מעלות צלזיוס, ולשמור אותם שם למשך 30 דקות לפני אחסונם בטמפרטורת חדר למשך recordi הבאng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את פרוסות המוח במאגר הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה i [Ca 2 +]. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לאחר הזרקת וירוס, תנקב את העכבר transcardially עם PBS ואחריו פורמלין 10% ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר, לאחר לתקן לילה, וcryoprotect המוח בסוכרוז 30% שנאגרו במשך לפחות 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיקרומטר חלקים באמצעות microtome cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS ב -10 מרווח דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עבור שעה 1 ב- PBS עם סרום עיזים 10% נורמלים ועם 0.5% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפי הלילה ב 4 ° C בנוגדן ראשוני שהוכן ב- PBS עם 0.5% Triton X-100. הנוגדנים העיקריים בשימוש היו כדלקמן: עוף אנטי GFP 1: 1,000, העכבר אנטי S100β 1: 400, עכבר אנטי NeuN 1: 600, synthetase אנטי-גלוטמין עכבר 1: 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם PBS על 10 מ &#39;במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עם הנוגדנים משני שהוכנו ב- PBS עם 10% עזים בסרום נורמלי עבור שעה 2 בטמפרטורת חדר. הנוגדנים שני היו כדלקמן: עז אנטי עכבר Alexa546 1: 500, עז נגד עוף Alexa488 1: 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את הסעיפים על שקופיות זכוכית, יבשות ולהחיל כמה טיפות של antifade הרכבה בינוני, ואז לכסות באיטיות את החלקים עם coverslip זכוכית. אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות במיקרוסקופ confocal עם עדשת טבילת שמן 40X עם צמצם מספרי של 1.3. </li></ol> 4. Confocal הדמיה i [Ca 2 +] הערה: [Ca 2 +] i הדמיה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשה אובייקטיבית 40X טבילה במים עם צמצם מספרי של 0.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 1 ל 5 שעות לאחר חיתוך, פרוסה מקום בחדר ההקלטה וSuperfuse עם חיץ הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר עם קצב זרימה של 1 - 2 מ&quot;ל לדקות. ואז למקם את נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו ולאתר את סטריאטום הגב עם הארה שדה בהירה תחת מטרת טבילה במי 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לעדשה האובייקטיבית 40X טבילה במים, ולהפעיל את קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. על ידי שינוי מישור המוקד, למצוא תאים הממוקמים כ -20 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסה, בו מוצגות הקרינה בסיסית בסומה, סניפים וbranchlets. שימו לב, תאים שנפגעו בדרך כלל להציג רמת הקרינה מעל הממוצע, אשר יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב &#39;סריקת מסגרת &quot;כדי להתחיל בסריקה. בדרך כלל, את עוצמת הלייזר המותאמת ל0.5-5% מהתפוקה המקסימלית די תמונה [Ca 2 +] i עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. לניטור אני דינמיקה [Ca 2 +] בשטח של האסטרוציטים כל, &#39;סריקת המסגרת&#39; עם קצב סריקה של 1 שניות לכל מסגרת או מהיר יותר היא recommended, אבל זה צריך להיות החליט בהתאם לניסוי בשאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לתמונה [Ca 2 +] אני בתהליכים, להשתמש בהגדלה דיגיטלית של 2 - 3 פי לפקח 1 - 2 האסטרוציטים בכל שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפיקסלים רוויים במהלך הקלטה, להשתמש במצב בדיקת &#39;חילו&#39; לPseudocolor התאים. תמיד להתחיל עם &quot;הקלטת פיילוט&quot; למשך כ -5 דקות, כדי לבדוק אם צבע אדום מופיע כאינדיקציה לרוויה. אם כך, להפחית את תפוקת לייזר הכח, או להקטין את PMT / רווח / קיזוז ערכים ולבצע הקלטת טייס אחרת על מנת לבחון את ערכי פיקסל הם בטווח בלתי רווי. בדרך כלל, בשילוב הפרמטרים המשמשים לastrocyte הדמיה [Ca 2 +] i בסטריאטום היא כדלקמן: פלט כוח לייזר 0.5-5% (10 mW), PMT 550-650 וולט, רווח 2.0 - 3.5x, ולקזז 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטות שתוארו במסמך זה אפשרו לנו להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בהאסטרוציטים striatal in vivo להדמיה הבאה [Ca 2 +] i באתר. לשיטה זו יתרונות על פני שימוש במהונדס או עכברים לדפוק ב, כוללים ביטוי חזק של החלבון, המהירות ממוקדת וגמישות של יישום ניסיוני וספציפיות אנ?...

האסטרוציטים הם תאי גליה נמצאים בכל מקום ובשפע של המוח. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים לשמש תמיכה חיונית ותפקידים ההומיאוסטטית כוללים חציצה של K + ריכוז במרחב החוץ תאי, ספיגה של מוליכים עצביים כמו גם חומרים מזינים מתן. עם זאת, המחקרים אחרונים מראים שהם גם להציג אני אותות [Ca 2 +], אשר מתרחשים באופן ספונטני ועלו בפעילות עצבית 1. קיומו של astrocyte [Ca 2 +] איתות אני כבר חשב יותר ויותר כדי לעורר את התקשורת שלהם עם תאי עצב, ולפיכך, היה להתפרש כסוג של &quot;רגישות Ca 2 +&quot; בתוך האסטרוציטים. הנתונים הזמינים בשני העשורים האחרונים מצביעים על שתי הגדרות שבי האסטרוציטים ונוירונים רשאיות להתקשר, אולי באופן דו-כיווני. ראשית, האסטרוציטים מגיבים לעתים קרובות בעלייה ב[ Ca 2 +] i כאשר מופעלת על ידי נוירוטרנסמיטורים וneuromodulators שוחררה מתא העצב 2. שנית, [Ca 2 +] אני עולה בתוך האסטרוציטים לגרום לשחרור של מולקולות איתות מהאסטרוציטים שבתורו יכול להשפיע נוירונים וכלי דם. ראיות עולה כי מולקולות שוחררו מהאסטרוציטים להביא לשינויים בפונקציות של סינפסות, מעגלים וסופו של דבר התנהגות 3-5 באמצעות איתות astrocyte לנוירון. עם זאת, זה עדיין תחום מחקר המתפתח במהירות, וזה כבר טען שיש צורך בהבנה טובה יותר ומפורטת של astrocyte [Ca 2 +] i כדי לפתור חלק מאי הוודאות הנוכחי 6. בעבודה האחרונה, זה היה הראה כי טעינה בתפזורת של צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + לתוך האסטרוציטים לא מצליחה לזהות באופן אמין [Ca 2 +] i אותות בתוך האסטרוציטים כל בתרבות ובאתרו 7-10. ממצאים אלה נדונו על ידינו ואחרים 6,11,12. Emerginתמונת g היא ש[ Ca 2 +] i אותות בתוך תהליכי astrocyte (למשל, ענפים וbranchlets), המהווים את האתרים העיקריים לאינטראקציות עם תאי עצב וכלי דם, כמעט שלא נחקר בפירוט. לאחרונה, השימוש באינדיקטורים מקודד גנטי סידן (GECIs) כגון GCaMP3 cytosolic, GCaMP5G וGCaMP6 וקרום פלזמה גרסאות קשורות (למשל, LCK-GCaMP3) התיר למחקר שלי אותות [Ca 2 +] בתאים קטנים של האסטרוציטים כזה רזים כמו תהליכים, ליד קרום הפלזמה ובתוך טריטוריות שלמות 7,8. עם זאת, יש לי GECIs חסרון אחד על פני צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + וזה הדרישה לשיטות גנטיות כדי לספק את הגנים מקודדות באופן סלקטיבי לתאים כוכביים in vivo לתקופות של שבועות לGECIs להיות כראוי הביע. ביטוי in vivo מושגת בדרך כלל באמצעות עכברים מהונדסים, לדפוק בעכברים או באפליקצית משלוח מבוסס וירוסמקקים. במאמר יופיטר הנוכחי אנו מדווחים שיטות ונהלים מועסקים כדי לספק GECIs להאסטרוציטים striatal באמצעות adeno הקשורים וירוסים. אנו מתמקדים בציטומגלווירוס-GCaMP3 כדוגמא, אבל באותו ההליך בסיסי עובד עבור כל Geci אחר או כתב חלבון פלואורסצנטי מבוסס.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

לביטוי ספציפי astrocyte של ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום, היינו וירוס adeno הקשורים (AAV) של סרוטיפ 5, ואמרגן D 1 GFAP GfaABC (איור 1 א), שהוכח בעבר לנהוג GCaMP3 חזק וגן הכתב ביטוי בהיפוקמפוס והאסטרוציטים בקליפת המוח 8,14. שבועיים לאחר microinjection הווירוס לסטריאטום העכבר, הע...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Views.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biology

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

הדמיה בזמן אמת לפעילות נוירונים בתאי פיתול משוננים של עכברים 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

מחבר זרקור: חקירת הפעילות העצבית של תאי גרגיר פיתול משוננים עם מיקרוסקופ מיניאטורי

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

ההדמיה תאית Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video