Der Großteil der Arbeit und die beteiligten Mitarbeiter wurden von NIH Zuschusses NS060677 und teilweise durch NIH gewährt MH099559 und MH104069 (BSK) unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde auch von der CHDI Foundation unterstützt.

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt. 1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading <ol><li> Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem Winkel von 40 ° unter Verwendung einer Pipette Mühle. Die Pipette, die ideal für den Einsatz ist wird einen Spitzendurchmesser von 20 bis 40 um und eine Schaftlänge von 6 - 7 mm. Autoklavieren der Pipette und chirurgische Instrumente. Der Bohrer wird durch Abwischen mit 70% Ethanol sterilisiert. </li><li> Speichern des Virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), bei -80 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots. Kurz vor der Operation, nehmen Sie die Aliquots aus dem Gefrierfach und Lagerung auf Eis, bis zum Füllen th verwendete-Mikropipette. </li><li> Füllen Sie die Mikropipette mit Virus mit einer Spritzenpumpe. Dicht verbinden Sie ein Ende eines Rohrstück, durch einen entsprechend dimensionierten Rohr Klemmverschraubung, auf eine Glasspritze mit einem verstärkten Kolben. Befestigen Sie die autoklaviert Mikropipette mit dem anderen Ende des Rohrstück durch einen entsprechend dimensionierten abnehmbare Nadelklemmfitting. </li><li> Vor dem Beladen des viralen Vektor, entfernen Luftblasen aus dem Pumpsystem einschließlich Schlauch, Spritze und Mikropipette durch Befüllen des Systems mit Mineralöl mit Sudanrot IV (~ 1 mg / 50 ml) in einer 1-ml-Spritze mit einer Nadel gefärbt (27 G ). </li><li> Ein sauberes Stück Parafilm unter der Glas-Mikropipette, und Abgeben von 5 bis 10 &amp; mgr; l der Virusvektors auf die Parafilm. </li><li> Saugen den viralen Vektor, der durch Bewegen des Kolbens der Spritze nach hinten in 0.5 &amp; mgr; l / min, und markieren die Grenze zwischen dem Vektor und dem Öl auf der Glaspipette. </li></ol> 1.2) Anästhesie, Haarschneide, Head Fixierung und Vorbereitung zur Kraniotomie <ol><li> Eine Maus (P49-63, C57BL / 6) in die Kammer mit N 2 O und O 2 und 5% Isofluran gefüllt. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der zielBewegung und einer verlangsamte Atemfrequenz (~ 60-90 / min). Schneiden Sie Haare auf dem Kopf, wenn die Maus betäubt. </li><li> Setzen Sie die Maus in die stereotaktischen Rahmen, mit seinem Kopf durch stumpfe Ohr Bars und seine Nase in eine Anästhesie- und Beatmungssystem platziert gesichert. Pflegen kontinuierliche Isofluran bei 2 - 3%. Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen, da Mäuse verlieren ihre Lidschlussreflexes unter Narkose. </li><li> Verwalten 0,05 ml Buprenorphin (0,1 mg / ml) durch subkutane Injektion zur Schmerzlinderung. </li><li> Sauberen Operationsbereich mit 10% Povidon-Jod und 70% Alkohol dreimal abwechselnd zwischen den beiden Lösungen besteht und mit Povidon-Iod. Starten Sie von vorne und wischen nach hinten, um alle bereits geschnittenen Haare zu entfernen. </li><li> Machen Sie eine Hautschnitt an der Spitze of der Kopf, der zwischen den Augen beginnt und endet zwischen den Ohren. </li></ol> 1.3) Kraniotomie und Mikroinjektionen <ol><li> Entfernen Sie die Knochenhaut durch Streichen mit einem Wattestäbchen und dann trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Zahnwattebällchen. Machen Sie eine Markierung an der Injektionsstelle, und bohren um den Rand der Marke mit einem kleinen Stahl Grat angetrieben von einem High-Speed-Bohrer. </li><li> Entfernen Sie die Knochen und reinigen Sie die Oberfläche mit Kochsalzlösung. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in die linke Rücken seitlich mit den folgenden Koordinaten (mm) Striatum: anterior-posterioren 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventrale vom Pia-Oberfläche: -2,4 13. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bedeutet, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel sitzt direkt über dem dorsolateralen Striatum (1A, B), was bedeutet, dass er nur geringfügig innerhalb dieses Kerns eindringt. Vermeiden schädlicher Blutgefäße. Wenn die Pipette passiert zu sein Recht auf ein Blutgefäß, leicht einzustellen dasKoordinaten von ~ 0.1 - 0.2 mm. </li><li> Starten Einspritzung mit Einspritzrate bei 0,2 ml / min eingestellt, und in der Regel zu injizieren 1 bis 1,5 &amp; mgr; l-Virus. </li><li> Verlassen Sie die Pipette anstelle nach der Injektion für 10 Minuten, und dann langsam zurückziehen der Pipette. </li><li> Beenden Sie durch Schließen der Operationswunde mit fortlaufenden Naht externen Nylonnaht. </li></ol> 1.4) Wiederherstellung <ol><li> Setzen Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen für 24 Stunden. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> In Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pro 500 ml Wasser, das 40 mg Trimethoprim und 200 mg sulfamethoxiazole) im Wasser für eine Woche. Verwaltung Buprenorphin zweimal pro Tag für bis zu 3 Tage nach der Operation. </li><li> Pflegen Sie die Maus auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, gefüttert und täglich bewässert, einnd wird einmal pro Tag bis zu 3 Tage nach der Operation gewichtet. In diesen 3 Tagen wird jede Maus mit einem Verlust von mehr als 10% Körpergewicht gelten als gefährdet und werden anstatt an Versuchen unterworfen eingeschläfert werden. </li><li> Getrennt, ändern Sie die Maus Käfig zweimal pro Woche, und mindestens einmal pro Tag zu überwachen für die allgemeine Gesundheit. 3 Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen - Typischerweise wird die Maus innerhalb von 2 verwendet. </li></ol> 2. akuten Hirnschnittpräparat für die konfokale Ca 2+ Imaging 2.1) Herstellung von Schnitt- und Recording Solutions. <ol><li> Vorbereitung Schneid Lösung aus (mM): 194 Sucrose, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-Glucose, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 und 26 NaHCO 3, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. </li><li> Vorbereitung Aufzeichnungslösung, umfassend (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-Glucose, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; und 26 NaHCO 3; pH 7,3 bis 7,4, 290 bis 295 mOsm, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. Füllen Sie den Hirnschnitt hält Becher mit Aufzeichnungslösung, und halten Sie sie bei 34 ° C. </li></ol> 2.2) Slicing <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen, tief und unheilbar betäuben die Maus und dann enthaupten es. </li><li> Extrahieren Sie das Gehirn, und verwenden Sie ein Messer, um die injizierten rechten Hemisphäre zu entfernen, und montieren Sie die linke auf die Vibratom Tablett mit Superkleber. Füllen Sie den Vibratom Tablett mit eiskaltem Schneid Puffer und halten sättigt sie mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schneiden koronaler oder sagittaler striatalen Hirnschnitten bei 300 &amp; mgr; m Dicke. Normalerweise 4-5 koronalen oder 6 - 7 können sagittale striatalen Scheiben gesammelt werden. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Holdingbecher erwärmt bei 34 ° C, und es halten sie für 30 Minuten vor dem Ablegen bei Raumtemperatur für nachfolgende recording. </li><li> Inkubieren der Hirnschnitten in oxygenierten Aufzeichnungspuffer bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vor der [Ca 2+] i-Bildgebung. </li></ol> 3. Immunhistochemie (IHC) <ol><li> Zwei Wochen nach Virusinjektion, perfuse die Maus transkardial mit PBS, gefolgt von 10% Formalin in PBS. </li><li> Entfernen, post-fix über Nacht, und cryoprotect das Gehirn in gepufferten 30% Saccharose für mindestens 2 Tage. </li><li> Bereiten Sie 40 um Abschnitte mit einem Kryostat-Mikrotom. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS bei 10 min-Intervall. </li><li> Abschnitte Inkubation für 1 h in PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100. </li><li> Abschnitte über Nacht Inkubation bei 4 ° C in primären Antikörpers in PBS mit 0,5% Triton X-100 hergestellt. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt: Huhn anti-GFP 1: 1.000, Maus anti-S100β 1: 400, Maus-anti-NeuN 1: 600, Maus-Anti-Glutamin-Synthetase 1: 300. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS auf 10 min Intervallen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit den sekundären Antikörpern in PBS mit 10% normalem Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Der zweite Antikörper waren wie folgt: Ziege anti-Maus Alexa546 1: 500, Ziege-Anti-Huhn Alexa488 1: 500. </li><li> Montieren Sie die Teile auf Glasobjektträger, trocken und mehrere Tropfen Antifade Eindeckmediums, dann langsam decken die Schnitte mit einem Deckglas. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Bilder auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3. </li></ol> 4. Die konfokale [Ca 2+] i Imaging HINWEIS: [Ca 2 +] i-Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,8. <ol><li> Zwischen 1 und 5 Stunden nach dem Schneiden, Ort Scheibe im Aufnahmeraum und superfuse mit sauerstoffAufzeichnungsPuffer bei Raumtemperatur mit Durchflussrate von 1-2 ml proMinute Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylonsaiten auf der Oberseite der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. </li><li> Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10X Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Wechseln Sie auf die 40X Wasserimmersionsobjektiv Objektiv, und schalten Sie den 488-nm-Linie des Argon-Laser. Durch die Veränderung der Brennebene, finden Zellen etwa 20 &amp; mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche befindet, zeigt basale Fluoreszenz in Soma, Niederlassungen und Zweigstellen. Zu beachten ist, kompromittiert Zellen zeigen meist Fluoreszenzniveau über dem Durchschnitt, die vermieden werden sollten. </li><li> Verwenden Sie Modus &#39;Bildabtastintervalle&#39;, um das Scannen zu starten. Üblicherweise wird die Laserintensität auf 0,5 eingestellt - 5% des maximalen Ausgangs ausreicht, um Bild [Ca 2+] i mit Zyto-GCaMP3. Zur Überwachung [Ca 2+] i Dynamik im gesamten Gebiet der Astrozyten ist die &quot;Rahmenscan &#39;mit einer Abtastrate von 1 Sekunde pro Frame oder schneller EMPFEHLUNDED, aber das muss je nach Experiment in Frage entschieden werden. </li><li> Wenn nötig, um die Bild [Ca 2+] i in Prozessen verwenden digitale Vergrößerung von 2 - 3 fach zu überwachen 1-2 Astrozyten im gesamten Sichtfeld. </li><li> Zu gesättigten Pixel bei einer Aufnahme zu vermeiden, verwenden Lookup-Modus &quot;Hilo&quot;, um die Zellen Pseudocolor. Immer mit einem &quot;Pilot Aufnahme&quot; für ca. 5 min zu starten, um zu testen, ob rote Farbe erscheint als Hinweis auf Sättigung. Wenn dem so ist, senken Sie die Laserausgangsleistung, oder senken Sie die PMT / Gain / Offset-Werte und führen Sie eine weitere Pilotaufzeichnung zu testen die Pixelwerte im nicht gesättigten Bereich. Typischerweise für die Bildgebung Astrozyten verwendet die kombinierten Parameter [Ca 2+] i im Striatum sind wie folgt: Laserausgangsleistung von 0,5 bis 5% (von 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gewinn 2,0 - 3.5X und Offset 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca 2+] i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination...

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K + -Konzentration in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca 2+] i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität 1 erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca 2+] i-Signalisierung wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von &quot;Ca 2+ Erregbarkeit&quot; in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca 2+] i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen 2 veröffentlicht. Zweitens [Ca 2+] i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich 3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca 2+] i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten 6 lösen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca 2+] i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ 7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen 6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca 2+] i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 +] i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu 7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette grinder</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >EG-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>44331</td>
			<td >a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >I mL syringe</td>
			<td >BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV2/5 virus</td>
			<td >UPenn vector core</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan red IV</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >67386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >CVS Pharmacy</td>
			<td>152355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryostat</td>
			<td >Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td >900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td >FOREDOM</td>
			<td >K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Santa cruz biotechnology</td>
			<td >sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super Glue</td>
			<td>Krazy&#174;Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microslicer</td>
			<td >Ted Pella</td>
			<td >DTK-Zero 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscopes</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >FV300 and FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal goat serum</td>
			<td >Vector</td>
			<td >S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken anti-GFP</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-s100&#946;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-NeuN</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-glutamine synthetase</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-mouse-Alexa546</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken-Alexa488</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-548-5J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting Medium</td>
			<td >Vector</td>
			<td >H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum ...

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Aufrufe.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 