Name: imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

仕事の大半は、関係職員は、NIH助成金NS060677によって、一部はNIHがMH099559と（BSKへ）MH10406​​9の補助金によってサポートされていました。作品の一部は、CHDI財団によってサポートされていました。

全ての動物プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの米国国立研究所に従ったとUCLAの施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1.1）マイクロピペットおよびAAV2 / 5ウイルスの読み込みを準備<ol><li>ウイルスの注射のために細かいホウケイ酸ガラスマイクロピペットを使用してください。垂直プラーで二段階引っ張っプログラムを使用してマイクロピペットを引き出します。ベベルピペットグラインダーを用いて40°の角度でピペット。が40μmおよび6のシャンクの長さ - - 7mmでの使用に最適ですピペット20の先端径を持つことになります。ピペットや手術器具をオートクレーブ。ドリルは、70％エタノールで拭くことによって滅菌される。 </li><li> 10μlアリコートで-80℃でウイルスAAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40（1.5×10 13 GC / ml）を、保管してください。ちょうど手術の前に、冷凍庫から一定分量を取り出し、目に充填するために使用するまで氷上で保存する電子マイクロピペット。 </li><li>ウイルスは、シリンジポンプの使用にマイクロピペットを埋める。しっかりと補強されたプランジャーを有するガラスシリンジに、フィッティング、適切なサイズのチューブ圧縮により、チューブの一片の一端を接続します。フィッティング適切なサイズの取り外し可能なニードル圧縮によりチューブの一片の他端にオートクレーブ処理マイクロピペットを取り付けます。 </li><li>ウイルスベクターをロードする前に、針を用いて1mlシリンジでスダン赤IV（約1ミリグラム/ 50ml）で着色されたミネラルオイルシステム（27 Gを充填することにより、チューブ、注射器およびマイクロピペットを含むポンプシステムから気泡を除去する）。 </li><li>ガラスマイクロピペットの下にパラフィルムのきれいな作品を置き、5分注 - パラフィルム上にウイルスベクターを10μl。 </li><li>後方を0.5μl/分でシリンジのプランジャを移動させることにより、ウイルスベクターを吸引し、ガラスピペット上のベクトルと油との間の境界をマークする。 </li></ol> 1.2）麻酔、ヘアーカット、H開頭のためのEAD固定と準備<ol><li> N 2 OとO 2および5％イソフルランで満たされたチャンバー内にマウス（P49-63、C57BL / 6）を置く。意図的な運動の喪失と鈍化呼吸数（ - 90 /分〜60）によって麻酔の深さを評価する。マウスを麻酔されたときに頭の上に髪を切った。 </li><li>その頭には麻酔および換気システムに置か鈍い耳バーおよびその鼻で固定して、定位フレームにマウスを合わせます。 2から3パーセントで連続イソフルランを維持する。マウスは麻酔下で彼らのまばたき反射を失うので、両眼に人工涙液軟膏を適用します。 </li><li>疼痛緩和のための皮下注射によりブプレノルフィン（0.1 mg / mlで）を0.05mlを投与する。 </li><li>二つの溶液間で交互にポビドンヨードを皮切りに、10％ポビドンヨードおよび70％アルコールで手術領域を清掃して三回。正面から起動し、すでにカット毛を除去するために戻って向かって拭いてください。 </li><li>トップO上の皮膚切開を作る耳の間の目と端部の間に開始され頭F。 </li></ol> 1.3）開頭およびマイクロインジェクション<ol><li>綿棒でスワイプして骨膜を削除してから歯科綿球で頭蓋骨の表面を乾燥させます。注射部位の周りにマークを作成し、高速ドリルを搭載し、小さなスチールバリを使用して、マークのエッジの周りにドリル。 </li><li>骨を削除し、生理食塩水で表面を洗浄する。 </li><li>前後0.8、内側-外側：2.0、背腹軟膜表面から：-2.4 13以下の座標（mm）の左背側線条体に横方向のピペットを置きます。これらの座標は、マイクロインジェクション針の先端は、それが少しだけ、この核内で浸透していることを意味し、ちょうど背外側線条体（ 図1A、B）の上に座っていることを意味していることに注意してください。損傷血管を避けてください。ピペットが血管の上で右であることを起こる場合は、若干の調整0.2mmの - 〜0.1によって調整します。 </li><li> 0.2μL/分に設定注入速度で注入を開始し、一般的に、ウイルスの1〜1.5μlのを注入する。 </li><li> 10分間注入後に所定の位置にピペットを残し、その後、ゆっくりとピペットを撤回。 </li><li>連続縫合外部ナイロン縫合糸で手術創を閉じて終了します。 </li></ol> 1.4）回復<ol><li> 24時間加熱パッド上に清潔なケージにマウスを置く。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けたマウスを返さないでください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでマウス無人のまま放置しないでください。 </li><li>週間水（40mgのトリメトプリムと200mgのsulfamethoxiazoleを含む水500mlあたり5ミリリットル、）トリメトプリムSulfamethoxiazoleを追加します。手術後最大3日間ブプレノルフィンを1日2回投与する。 </li><li>供給され、毎日の水やり、12時間の明暗サイクルの上でマウスを維持、AND手術後3日目まで一日一回重み付けされる。これらの3日間で、10％以上の体重損失を持つマウスが侵害とみなされ、そして安楽死させる代わりに、実験に供される。 </li><li>これとは別に、1週間に2回、マウスのケージを変更し、1日あたり少なくとも1回、一般的な健康状態を監視する。定位微量注入後3週間 - 典型的には、マウスを2内で使用されている。 </li></ol>共焦点のCa 2+イメージング用2.急性脳スライスの準備 2.1）切削や録音溶液の調製を。 <ol><li> （ミリモル）を含む溶液を切断する準備：194ショ糖、30のNaCl、4.5のKCl、10 D-グルコース、1のMgCl 2、1.2のNaH 2 PO 4、および95％O 2および5％CO 2で飽和し26のNaHCO 3、。 </li><li> （mm）を含む記録液を調製：124のNaCl、4.5のKCl、1のMgCl 2、10 D-グルコース、2のCaCl 2、1.2のNaH 2 PO 4 </サブ&gt;、および26のNaHCO 3; pHは7.3から7.4、290 - 95％O 2および5％CO 2で飽和さ295ミリオスモル。記録液の入ったビーカーを保持する脳スライスを記入し、34℃で保管してください。 </li></ol> 2.2）スライス<ol><li>深く末端定位微量注入後2〜3週間、マウスを麻酔し、それを首を切る。 </li><li>脳を抽出して、非注射右半球を削除するには、ブレードを使用し、スーパー接着剤を使用してビブラトームトレイ左折1をマウントします。氷冷間切断緩衝液でビブラトームトレイを充填し、95％O 2および5％CO 2でそれを飽和保つ。 </li><li> 300μmの厚さで冠状または矢状線条体の脳切片をカット。通常、4から5の冠状、または6から7矢状の線条体切片を収集することができる。 </li><li>その後のrecordi室温でそれらを格納する前に34℃で温めスライス保持ビーカーにスライスを移し、30分間そこにそれらを保つNG。 </li><li>の[Ca 2+] i の画像化の前に少なくとも30分間室温で酸素記録バッファ内の脳切片をインキュベートする。 </li></ol> 3.免疫組織化学（IHC） <ol><li>二週間、ウイルス注射後、PBSをPBS中の10％ホルマリンで経続いマウスを灌流する。 </li><li> 、取り外し一晩後固定し、そして少なくとも2日間、バッファリングされた30％スクロース中の脳をcryoprotect。 </li><li>クリオミクロトームを用いて40μmのセクションを準備します。 </li><li> 10分間隔でセクションをPBSで3回すすいでください。 </li><li> 10％正常ヤギ血清を含むPBS中で1時間インキュベートし、0.5％トリトンX-100で切片をインキュベートする。 </li><li> 0.5％トリトンX-100を含むPBS中で調製した一次抗体で4℃で一晩切片をインキュベートする。以下のように用いた一次抗体であった：ニワトリ抗GFP 1：1000マウス抗S100β1：400、マウス抗NeuNの1：600、マウス抗グルタミンシンテ1：300。 </li><li> 10メートルでセクションをPBSで3回すすぎ間隔で。 </li><li>室温で2時間、10％正常ヤギ血清を含むPBS中で調製した二次抗体とともに切片をインキュベートする。次のように二次抗体は以下の通りであった：ヤギ抗マウスAlexa546、1：500、ヤギ抗ニワトリAlexa488で1：500。 </li><li> 、スライドガラス上のセクションをマウントし、乾燥し、退色防止封入剤を数滴を適用し、その後ゆっくりとガラスカバースリップでセクションをカバーしています。 4℃でスライドを保存してください。 </li><li> 1.3の開口数を40倍油浸レンズを共焦点顕微鏡で画像を撮影する。 </li></ol> 4.共焦点の[Ca 2+] iのイメージング NOTE：[Ca 2+] iの 0.8の開口数40X水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて行った撮像する。 <ol><li>スライス後の1および5時間の間、所定の位置のスライス1の流速で室温で酸素記録バッファと記録チャンバーとsuperfuse中 - あたり2mlの分。その後、実験中に動きを最小限に抑えるために、スライスの上にナイロン弦の白金ハープを置く。 </li><li> 10X水浸対物レンズの下に明視野発光と背側線条体を視覚化し、検索します。 </li><li> 40X水浸対物レンズに切り替え、アルゴンレーザーの488nmのラインをオンにします。焦点面を変化させることで、細胞体、枝や小枝で基底蛍光を表示し、約20μmのスライス面の下に位置するセルを見つける。注目すべきは、損なわれた細胞は、通常は避けるべきで平均以上の蛍光レベルを表示する。 </li><li>スキャンを開始するには、 &#39;フレームスキャン」モードを使用してください。通常、0.5に調整し、レーザ強度-最大出力の5％の[Ca 2+] iの CYTO-GCaMP3の画像のに十分である。アストロサイトの全領土での[Ca 2+] iの動態を監視するために、フレームあたり1秒のスキャン速度を持つ「フレームスキャン」または高速でrecommeですndedが、これは、問題の実験に応じて決定する必要がある。 </li><li>視野全体で2アストロサイト- 1を監視するために3倍に-必要に応じて、画像には[Ca 2+]のプロセスでは、私は 、2のデジタル倍率を使用しています。 </li><li>録音中に飽和画素を回避するために、細胞を疑似カラーには、 &#39;ヒロ「ルックアップ·モードを使用します。常に赤い色は彩度の指標として表示されているかどうかをテストするために、約5分間、「パイロット録画」で始まります。その場合、レーザ出力パワーを下げるか、または下げるPMT /ゲイン/オフセット値を画素値をテストするために、別のパイロット記録を行う非飽和の範囲である。次のように一般的には、の[Ca 2+] iの線条体における撮像アストロサイトのために使用される組み合わせパラメータは次のとおりです。レーザ出力パワー0.5 - （10ミリワットの）5％、PMT 550から650ボルト、ゲイン2.0 - 3.5X、およびオフセット0 - 5％。 </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

本明細書に記載の方法は、私たちは、その場で 、後続の[Ca 2+] iのイメージングのためのin vivoでの線条体アストロサイトにおけるCYTO-GCaMP3を表現することができました。この方法は、遺伝子組換えを使用して、またはノックイン実験的な実装および解剖学的特異性の標的タンパク質、迅速性と柔軟性の強固な発現を含むマウスに比べて利点を有する。 AAV2 / 5を使?...

アストロサイトは、脳のユビキタスと豊富なグリア細胞である。これは、十分にアストロサイトが重要なサポートおよび細胞外空間におけるK +濃度のバッファリング、神経伝達物質の取り込みだけでなく、栄養素を提供することを含む恒常的な役割を果たしていることが確立されている。しかし、最近の研究では、それらはまた、自然に発生し、ニューロンの活動を1だけ増加された[Ca 2+] iの信号を表示することを示している。アストロサイトの存在は、の[Ca 2+] i のシグナリングはますますニューロンとのコミュニケーションを誘発すると考えられてきた、そのようなものとして、アストロサイト内の「Ca 2+の興奮性」の形式として解釈されてきた。最後の20年間の利用可能なデータは、アストロサイトとニューロンは、おそらく、双方向の方法で、通信することが可能な2つの設定が示唆された。まず、アストロサイトは、多くの場合は[Ca 2+] iは神経伝達物質によって活性化されたときの増加に対応し、ニューロン2から放出された神経修飾物質。第二に、アストロサイト内の[Ca 2+] i の増加は、順番に、ニューロンおよび血管に影響を与える可能性アストロサイトからのシグナル伝達分子の放出を引き起こす。証拠は、神経膠星状細胞から放出された分子は、アストロサイトへの神経シグナリングを介してシナプス回路、最終的に行動3-5の機能に変化をもたらすことを示唆している。しかし、これは急速に発展して研究領域のままであり、それがより良いとアストロサイトの詳細な理解がの[Ca 2+] iは 、現在の不確定要素6のいくつかを解決するために必要であると主張されています。 過去の研究では、アストロサイトへの有機物のCa 2+指示色素のバルク·ロードを確実に、培養中および in situ 7-10 全体の星状細胞内の[Ca 2+] i の信号の検出に失敗したことが示された。これらの知見は、米国および他の6,11,12によって議論されてきた。 emergingの画像は、ニューロンおよび血管との相互作用のための主要な部位であるアストロサイトのプロセス内の[Ca 2+] iの信号（ 例えば、枝や小枝）、ということで、めったに詳細に検討されていない。近年、細胞質ゾルGCaMP3などの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（GECIs）の使用は、GCaMP5GとGCaMP6とプラズマ膜テザーのバージョン（ 例えば 、Lckは-GCaMP3）は、そのようなアストロサイトの小区画内の[Ca 2+] iの信号の研究が可能になった薄いプロセスなどの、原形質膜に近いと7,8全体の領土内である。しかし、GECIs有機のCa 2+指示色素上の1つの欠点があり、GECIsが適切であることに発現する遺伝的方法は、数週間の期間にわたって、インビボでの星状細胞に選択的にコード化遺伝子を送達することが要件である。 in vivoでの発現は、典型的にノックインマウスまたはウイルスベースの送達アプリで、トランスジェニックマウスを使用して達成されるゴキブリ。現在のJoveの記事では、アデノ随伴ウイルスを使用して、線条体アスト​​ロサイトにGECIsを配信するために用いられる方法と手順を報告します。ここでは、例として、CYTO-GCaMP3に焦点を当てるが、同じ基本的な手順は、他のGECIまたは蛍光タンパク質ベースのレポーターのために働く。

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

線条体におけるCYTO-GCaMP3の星状細胞特異的発現のために、我々は以前に、堅牢GCaMP3およびレポーター遺伝子を駆動することが示されているアデノ随伴ウイルス（AAV）5血清型、およびGFAP GfaABC 1 Dプロモーター（ 図1A）が 、使用海馬と皮質アストロサイト8,14で表現。二週間のマウスの線条体へのウイルスのマイクロインジェクション後、マウス（約10週齢）を灌流し...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

イメージング細胞内Ca<sup&gt; 2+</sup遺伝的にエンコードされたカルシウム指標を用いて成体マウスからの線条体アスト​​ロサイト&gt;シグナル

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.8K ビュー.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

ビデオ: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

生物学

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

神経科学

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

マウスの歯状回細胞におけるニューロン活動のリアルタイムイメージング 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

著者スポットライト:小型顕微鏡による歯状回顆粒細胞の神経活性の調査

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

イメージング細胞内Ca

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロサイトのように

Ex Vivoセル固有カルシウムマウスダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

遺伝子組み換え^Ca2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリア^Ca2+ 取り込み

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

インビボ無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

イメージング細胞内Ca

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロサイトのように

Ex Vivoセル固有カルシウムマウスダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

遺伝子組み換え^Ca2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリア^Ca2+ 取り込み

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

インビボ無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング