We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Kütüphane Oluşturma <ol><li> Domain-spesifik hata eğilimli PCR kullanarak Hsp104 kütüphaneleri oluşturmak için, ilk önce bir hata eğilimli DNA polimeraz 20 ile ilgi alanını yükseltmek. </li><li> Jel ekstre PCR ürünü saflaştınlır. </li><li> Bir standart alana-yönlendirilmiş mutajenez protokolü kullanılarak bir megaprimer uzatma adımı gerçekleştirmek: PCR tamponu içinde 50 ng şablon plazmiti, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP, ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı birleştirmek, ve PCR dereceli su 20, 50 ul toplam hacme kadar seyreltin . Standart bir PCR programı çalıştırın. Not: amplifiye edilecek olan genin özel bir bölgesine göre değişir, kullanılan spesifik primerler. <ol><li> PCR sonra, 37 ° C&#39;de 2 saat süre ile, 1 ul Dpn I sınırlama enzimi ile ebeveyn hedef DNA sindirimi. </li></ol></li><li> Ultracompetent E. elektroporasyon veya diğer yollarla kitaplığı Transform coli Miniprep bunu arındırmak ve. NOT: Kütüphane oluşturmaesas olarak, belirli bir deney amaçlarına göre değişir. Hsp104 çok büyük bir protein olduğu, bu yüzden biz alanı özel hata eğilimli PCR kullanmak neden bütün geni, rastgele pratik değildir. Buna ek olarak, Hsp104 yapısı az 21 zorlu, yönlendirilmiş kitaplıkların tasarım, yapım anlaşılamamıştır. Kütüphane tek sınırlama, şablon plazmid omurgası dekstroz ortama 5-FOA karşı seçilmesine olanak sağlamak için, URA3 geni ihtiva etmesi olması ile, mutajenez için yönlendirilmiş veya rasgele yaklaşımlar kullanılarak yapılabilir. </li></ol> Hsp104 Kütüphanesi 2. Dönüşüm <ol><li> Standart bir lityum asetat / PEG transformasyon protokolü ile 22 W303aΔ hsp104 mayaya hastalıkla ilişkili alt-tabakanın entegre. Tek koloniler seçmek ve alt-tabakanın 23 ilgili hastalığın yüksek bir toksisite ile suşu izole toksisite için onları ekran. NOT: entegre bir gerginlik ve isola kullanınTüm hücreler eşit ekspresyonunu sağlamak için tek bir koloni te. PAG416GAL plazmid (urasil belirteç) 24 içine urasil dışında herhangi bir marker (biz histidin kullanın) ve Hsp104 kütüphane altında gen entegrasyonunu sağlayan bir plazmide hastalık tabakayı Clone. 5-FOA ters seçim olanak sağlamak için, kitaplık urasil markerinde bir plasmitten ifade olduğundan emin olun. Diğer maya suşları da kullanılabilir. Biz W303a hem WT ve Δ hsp104 kökenden BY4741 maya suşları (MEJ ve JS, yayınlanmamış gözlemler) kullanarak benzer bir toksisite bastırma fenotip kaydetti. </li><li> Aynı lityum asetat / PEG transformasyon protokolü 22 kullanarak bu tür haline Hsp104 kitaplığı dönüşümü. Kütüphanenin dizisi alanı muhafaza etmek için ve tahmin edilen kitaplık ebadını korumak için uygun dönüşümü büyütmek. </li><li> Kadar plakalar kullanılarak noninducing, seçici plakalar üzerine transformasyon karışımı (örneğin, SD-His-Ura) plakakoloniler, çok sayıda büyümesini sağlar. Gerekli plakaların sayısını en aza indirmek için büyük petri kapları (150 mm) kullanın. Plakalar kullanılarak transformantların kurtarma dönüşüm etkinliği değerlendirilir sağlar. </li><li> Paralel Hsp104 WT ve vektör negatif kontrolleri Transform. </li></ol> Proteotoxicity ve Önlenmesine 3. Eleme <ol><li> Rafınoz takviye bırakma ortamı (örn sraff-His-Ura) kullanarak plakaları kapalı koloniler yıkayın. Plakalardan koloniler gevşetmek için bir serolojik pipet ve steril ahşap aplikatörler kullanın. 50 ml konik bir tüp ve vorteks sıvı yıkama transfer iyice hücrelerin herhangi bir yığınının ayrı. Biraz bulutlu kültür, OD 600 ~ 0.025 sulandırmak. Not: Burada rafinoz ve böylece galaktoz aracılı indüksiyon hücreleri priming, indüksiyon glukoz aracılı baskı hücrelerini azaltmak için hizmet eder. </li><li> 3 çalkalanarak rafınoz bırakma medyada bir gecede seyreltilmiş kültür büyütün0 ºC. Paralel Hsp104 WT ve vektör kontrol büyür. </li><li> Sonraki sabah, tek tek galaktoz üzerine konsantrasyonları bir dizi plaka (örneğin SGAL-His-Ura) plakaları (400 ul toplam hacim içinde kültür konsantre edildi 2 ml için 1 ul). Konsantrasyonlarının geniş bir kaplama bir plaka tek koloniler sahip sağlayacaktır. Gerekli gerçek konsantrasyon yararlı hastalık substratın toksisite bağlıdır. </li><li> Kütüphanenin OD 600 vektör ve Hsp104 WT kültürleri normalize ve kontrol kütüphane nisbetle büyümesini karşılaştırma eşit hacimlerde plaka. </li><li> Seçim sertliğini değerlendirmek için, medya (bastırma) glukoz kütüphane plaka. Koloniler (Şekil 2) görünene kadar, 30 ° C&#39;de 2-3 gün inkübe. Çıkan koloniler değerlendirmek ve kontrollerle karşılaştırmak. NOT: Genellikle büyük ve küçük koloniler elde edilir, ancak koloni boyutu ve hareket arasında bir korelasyonivity görülmektedir. Sekanslamadan taşınan yanlış pozitif en aza indirmek için bir 5-FOA sayacı seçimi tekniği (Adım 4) kullanılarak bu potansiyel hit Ekran. </li></ol> 4. 5-FOA ters seçim ve lekelenme Hatalı Tesbiti ortadan kaldırmak için <ol><li> Çift ve tek terk medya üzerine suret tek koloniler (örn SD-His-Ura ve SD-His plakaları) ve 30 ºC&#39;de gece boyunca büyümeye dışarı Streak. Vektör ve Hsp104 WT kontrolleri ile tekrarlayın. Üzerine kaplama SD-His önce 5-FOA bir 5-FOA üzerine konuldukları zaman hücreler, Hsp104 plazmid kaybetmiş ihtimalini artırarak 5-FOA aşamasının verimini artırır. </li><li> 5-FOA ekran yaparken kurumasını plakaları önlemek için, 4 ºC&#39;de SD-His-Ura parafılm plakaların ve mağaza sarın. Bu plakalar, sonuçta, sıralamadan için kullanılacaktır. </li><li> Streak gelen koloniler SD-His 5-FOA plakaları üzerinde tek koloniler plakaları (YPD medya + 1 g / L 5-FOA) ve 30 1-2 gün inkübe186. C tek koloniler görünür kadar. Burada, 5-FOA, URA3 genini ihtiva eden hücrelerden bir toksik ürün (5-florodeoksiüridin) dönüştürülür. Böylece, hala Hsp104 plazmid herhangi hücreleri ölür. </li><li> Şerit, SD-Ura ve SD-His plakaları üzerine iki kez 5-FOA plakalardan tek koloniler. Her Testi 3 koloni Her hit için en az bir koloni Hsp104 plazmid yitirmiş olacağı olasılığını artırmak çarptı. 30 ° C&#39;de 1-2 gün süreyle inkübe edilir. SD-His plakaları değil SD-Ura plakalar üzerinde büyüyecek Hsp104 plazmid kaybettik Kolonileri. </li><li> Deneyleri tespit için Hsp104 plazmidler kaybetmiş suşları büyür. Çalkalama ile 30 ºC &#39;de gecede 96 derin kuyu, 2 ml plakaları (örneğin sraff-His) rafınoz bırakma medyada doyurma suşları büyür. 5-FOA ile tedavi edilen kontrol suşları dahil emin olun. </li><li> Tahlil tespit için tabak hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, kısım 200 ul rafınoz bırakma medya (örneğin sraff-His) başına96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu, ayırma sütunları saf kültürlerin 1 ve 7. Kısım 250 kolon 1 içinde 16 doymuş kültürlerin her ul ve plakanın 7. </li><li> Seri olarak çok kanallı bir pipet ile iyice karıştırılması, plakanın her sütuna Kültürler 5 kat seyreltilir. Her çukurdaki nihai hacmi sağlamak üzere sütun 6 ve 12 ile seyreltilmiş kültür 50 ul çıkarın 200 ul&#39;dir. Bu bile lekelenme sağlamak esastır. </li><li> 96-cıvata çoğaltıcı aracı (frogger) kullanılarak, SD-His ve SGAL-His plakalar üzerine nüsha halinde kültürleri nokta. 2-3 gün boyunca 30 ºC de inkübe. </li><li> Kontrollere benzer SGAL-His tabakalarına toksisite sergileyen suşları dizilenmesi için seçin. Kontroller gibi toksik değil gibi yanlış pozitif suşları atın. 5-FOA ayrıca kendi sık sık toksik, yani tek başına hastalık alt tabaka daha SD-His plakalar üzerinde bir büyüme kusur veya bu sergi önemli ölçüde daha yüksek toksisite gösterirler suşları (atın <stronG&gt; Şekil 3). </li></ol> 5. koloni PCR ile Hsp104 değişkenleri sequencing <ol><li> Pençe ~ 10 ul PCR şeridi tüplerinde 3 ul 20 mM NaOH içinde SD-His-Ura plakalardan maya ve dondurulup eritilerek hücreler lize edildi. Daha sonra 10 dakika boyunca bir PCR 99 ° C&#39;de inkübe edilir, 10 dakika süre ile ya da sıvı azot içinde bir -80 ° C dondurucu içinde şerit tüpler yerleştirin. PCR sınıf su ile 100 ul suşları sulandırmak. </li><li> PCR reaksiyonları hazırlayın: 5 ul PCR şablonu, 0.5 ul 100 uM her bir primer, 0.5 ul 10 mM dNTP, PCR tamponu içinde 0.25 ul DNA polimeraz, ve PCR dereceli su ile bir 25 ul toplam hacme tamamlanır. Tasarım primerler rastlantısal bölgeyi artı iki uçta da yaklaşık olarak 100 bp amplifiye etmek. Başarılı amplifikasyon olasılığını artırmak için güçlendirilmiş bölge boyutunu en aza indirmek. Standart bir PCR programı çalıştırın. </li><li> Uygun sIz bir PCR ürünü amplifikasyon teyit etmek için agaroz jel elektroforezi ile analiz numuneleriör. Hiçbir ürün varsa PCR tekrarlayın. Not: PCR, yetmezliği genellikle aşama 5.1&#39;de kullanılan çok fazla maya kaynaklanmaktadır. </li><li> DNA sekanslaması için numune hazırlayın. Böyle Ekzonükleaz I ve Karides Alkalin Fosfataz enzim olarak PCR saflaştırma veya bir PCR ürünü temizleme ajanı kullanılarak ya PCR primerleri Kaldır (ExoSAP-IT) tek iplikli DNA&#39;yı için. Bu reaktif enzimatik daha yüksek verim sağlayan, tüzel kişiliği olmayan astar ve dNTPs düşürür. </li><li> PCR ürünleri dizisi. Iyice mutasyonları için sıralama kromotogramlarını analiz emin olun. Genellikle birden plazmidleri barındıran maya gibi mutasyonlar, belirli bir site (Şekil 4), iki nükleotid bir karışımı olarak gözlemlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada maya proteinopathy modellerini kullanarak hastalıkla ilişkili alt tabakaların toksisitesi bastırmak potansiyelize Hsp104 varyantları izole bizim yaklaşım sunmak. Bu yaklaşımı kullanarak, varyantlarının büyük kütüphanelerin, tek sınırlandırma, 5-FOA İkinci ekrana geçmek varyantları sayı olmak üzere, yüksek bir verimlilik de taranabilir. 96 kuyu formatında bu adımları gerçekleştirerek, rutin 1-2 hafta boyunca 5-FOA aşamasında bir anda 200 hit kadar ekran. Ilk tarama aşaması esnası...

Maya proteinopathy modeller amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) 1-3 içeren protein-yanlış katlanması bozuklukları için geliştirilmiştir. ALS hastalarında misfold protein TDP-43 ve FUS sentezlenmesi, maya 1,2 sitoplazmik agregatlar oluşturması için zehirli ve mislocalize bulunmaktadır. Benzer şekilde, PD karıştığı α-sinüklein (α-sin), ekspresyonu, toksik ve mislocalizes maya 3 sitoplazmik eden agregalar meydana getirir. Bu özellikler bu bozuklukların 4,5 olan hastalarda fenotipleri özetlemek. Bu nedenle, maya modelleri önlemek ya da bu fenotipleri 2,6-13 ters proteinler ya da küçük moleküllerin taranmasına yönelik yararlı bir platform sağlar. Biz nedeniyle TDP-43, FUS ve α-syn için toplanmasını ve toksisite geri yeteneğine sahip proteinlerin geliştirilmesinde ilgilendi. Biz Hsp104, hem fr proteinleri ayırmak olma eşsiz yeteneği olan mayadan AAA + protein odaklanmakmayada om amorf agrega ve amiloid, henüz hiçbir insan homolojunu 14,15 sahiptir. Hsp104 ince endojen maya prionları parçalamak için ayarlanmış ve normalde 16,17 karşılaştığında asla insan nörodejeneratif hastalıklarda rol yüzeylerde, parçalamak için sadece sınırlı bir yeteneği vardır. Böylece, biz birebir bu insan substratları ayrıştırmak mümkün Hsp104 gelişmiş versiyonlarını mühendisi hedefliyoruz. Hsp104 hata eğilimli PCR kullanarak varyantları Bunu yapmak için, biz büyük kütüphaneler inşa; bu kütüphaneler maya proteinopathy modelleri 17 kullanılarak taranabilir. Hsp104 17 çok büyük olduğu gibi biz, kütüphaneler oluşturmak ve tarama için bir etki alanı hedefli bir yaklaşım benimsemiştir. Benzer yaklaşımlar diğer etki taranması için kullanılabilecek olsa biz başlangıçta, orta etki Hsp104 17 (MD) odaklanmıştır. Bu tür geri kalanı yüzey gösterimi gibi alternatif teknikler karşıt olarak bu modeller, doğrudan Disaggregase aktivitesi için elenmesini sağlamak18 bağlama izlenmesi için kullanılacak ricted. Bizim protokol iki tarama aşaması (Şekil 1) dayanmaktadır. İlk olarak, mayada hastalık substratın toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantları seçilir. Bunu yapmak için, Hsp104 varyantları ve hastalıkla ilişkili alt-tabaka Δ hsp104 maya içine ortak transforme edilir. Biz, vahşi tip yokluğunda (WT) Hsp104 17 Hsp104 dizisi alan araştırmak Δ hsp104 maya kullanılmaktadır. Önemlisi, Hsp104 silinmesi mayada α-sin, FUs, ya da TDP-43 toksisite etkilemez, ve Hsp104 WT ifadesi minimum kurtarma 1,13,17 sağlar. Maya her iki proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için ortam uyarılması üzerine yerleştirilir. Koloninin hastalıkla ilişkili substrat bahşedebilir büyüme toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantlarını barındıran maya. Koloniler toksisite kalıbı bastıramaz varyantlarını korurken, bu varyantlar, daha fazla analiz için seçilmiştir. Bununla birlikte,yanlış pozitif Bu ekranda önemli bir sorun vardır. TDP-43, FUS ve α-syn sentezlenmesi ifade edilir Hsp104 varyant olmayan toksisite kendiliğinden genetik bastırma ortaya çıkması için güçlü bir seçici basınç oluşturur, oldukça zehirlidir. Bu nedenle, biz ayrıca spesifik olmayan toksisite bastırıcılar 17 ortadan kaldırmak için, nispeten yüksek miktarda olan ikincil bir ekran kullanmaktadır. Bu ikincil bir tarama, seçilen maya Hsp104 plazmidin 19 seçme karşı 5-Fluorootic asit (5-FOA) ile muamele edilir. Soy daha sonra alt-tabakanın toksisite Hsp104 plazmidin kaybından sonra geri sağlamak için tahlil lekelenme ile (TDP-43, FUS ya da α-sin) toksisite alt-tabaka açısından değerlendirilir. Bu nedenle, toksisitesi bu ikinci ekranda geri edildiği maya muhtemelen başlangıçta bağlı Hsp104 varyantın varlığını toksisite bastırma gösterilir. Bu maya &quot;sonuç&quot; olarak adlandırılan ve Hsp104 plazmid daha sonra olmalıdırgeri kazanılmış ve Hsp104 gen 17 (Şekil 1) &#39;de başkalaşımların teşhis edilmesi için dizilenmiştir. Herhangi bir hitleri daha sonra toksisite bastırılması için yeniden test daha sonra bağımsız bir şekilde mutasyona inşa yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak ve teyit edilmelidir. Bu protokol için potansiyel uygulamalar geniştir. Bu yöntemler kullanılarak, protein herhangi bir tür kütüphaneleri maya içinde toksik olan herhangi bir alt tabaka proteininin toksisitesi bastırmak varyantlar için taranabilir olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Table of Specific Materials/Equipment</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Fluorootic Acid</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>f10501-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-DeepWell 2mL Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 502.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 bold replicator tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>vp-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ExoSAP-IT</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Biz orta etki randomize Hsp104 varyantlarının bir kütüphanesi inşa TDP-43 toksisite bastırılması için gösterildi. Kütüphane dönüştürülmüş ve ekranın darlığı değerlendirmek için glukoz, galaktoz levhaları (Şekil 2) üzerine kaplanmıştır. Tek tek koloniler seçilir ve suşlar karşı Hsp104 plazmid ortadan kaldırmak için 5-FOA kullanılarak seçilmiştir. Bu suşlar o toksisite onaylamak için değerlendirildi Hsp104 varyantları olmadan, TDP-43 tek başına nedeniyle oldu....

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Görüntüleme.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.