الكتاب أشكر الدكتور لو ترينه والدكتور توبين لتوفير بسخاء-كاتينين α: خط الأسماك السترين وبيل جاكمان على إتاحة الفرصة لنا للقيام التصوير في مختبره. المؤلفون تقر مصادر التمويل المعاهد الوطنية للصحة (المنح 5P20RR016463، 8P20GM103423 وR15AI094406) ووزارة الزراعة الأميركية (مشروع # ME0-H-1-00517-13). يتم نشر هذه المخطوطة كما الزراعة الرئيسية وتجربة الغابات المنشور محطة رقم 3371.

ملاحظة: تم تنفيذ كافة بروتوكولات الرعاية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة تحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) بروتوكول A2012-11-03. 1. الزرد تربية إلى 4 أيام بعد الإخصاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع AB الزرد، أو أي خطوط المعدلة وراثيا أخرى، في أول الإخصاب آخر 3 ساعة، كما هو مبين في فيديو آخر 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض 120 في 15 سم أطباق بتري تحتوي على 150 مل من وسائل الاعلام E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgCl 2، 2 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8) مع الميثيلين الأزرق (0.3 ميكروغرام / مل النهائي تركيز) في 33 ° C حاضنة مع 12/12 ضوء / الإضاءة المظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الاعلام بعد 6 ساعات مع E3 + PTU (1-فينيل-2-ثيوريا، 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) وإزالة البيض الميت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 4 أيام في 33 ° C، وتبادل وسائل الإعلام مع E3 الطازجة + PTU بعد 2 أيام. </li></ol> 2. فيjection مايكرو إبرة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الشعرية البورسليكات (OD 1.2 مم؛ ID 0.69 مم) في إبرة الجزئي باستخدام إبرة مجتذب مع الإعدادات التالية (550 الحرارة، 0 سحب، سرعة 130، 110 مرة). ملاحظة: تختلف الإعدادات من خيوط لخيوط للحصول على شكل وبالمثل الإبر الصغيرة (انظر الشكل 1)، وسوف تحتاج إلى إعادة تعديل كلما تم تثبيت خيوط جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء إبرة الجزئي مع 3 ميكرولتر من 0.4 ميكرون تصفية المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم؛ 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4؛ 1.8 ملي KH 2 PO 4؛ ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة معلومات سرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة صغيرة على حامل ممص مكروى على micromanipulator تعلق على نظام حقن الضغط. ضبط ضغط الحقن إلى 30 PSI ومدة النبضة في 30 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طبق بتري مع الماء المقطر، وانخفاض الإبرة الدقيقة حتى 1/5 من الإبرة هو في الماء. مقطع واي الدقيقة إبرةث ملاقط غرامة أقل بقليل من مستوى المياه. جلب الإبرة الصغيرة من الماء، ودفع دواسة عدة مرات حتى تظهر بلعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس قطر البلعة عن طريق خفض إبرة صغيرة على عدادة الكريات الطبقات مع قطرة واحدة من نوع الزيت الغمر. ضبط مدة النبضة للحصول على حجم المطلوب (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين احداهما لالبلعة أن تبقى مستقرة في الزيت (خفض ضغط إذا كان البلعة يزيد حجم وزيادة الضغط الخلفي إذا يقلل من حجم البلعة). تسجيل مدة النبضة لكل الإبرة الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS من الإبرة الدقيقة بواسطة الشفط باستخدام ماصة طرف microloader وطرد اليسار الإفراط في برنامج تلفزيوني عن طريق وضعها مرة أخرى على حاقن والتقليب التحول النبض المستمر. حجز كل إبرة صغيرة. </li></ol> 3. إعداد المبيضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المبيضات البيض تحولت مع الأمثل كودون dTomato، GFP، BFP، EOS أو الأقصىالأحمر من الأسهم المجمدة (-80 ° C الأسهم في 25٪ الجلسرين) باستخدام وتد خشبي عقيمة في الصعود إلى سكر العنب الخميرة peptine (YPD) لوحة أجار (10 ز / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب ، 20 ز / L أجار، تعقيمها وسكب 25 مل في أطباق بتري) واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مستعمرة واحدة باستخدام وتد خشبي معقمة وتلقيح إلى 5 مل من YPD السائل (10 غ / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب، تعقيمها وaliquotted جو معقم و مطهر في 5 مل في 16 × 150 مم الثقافة الزجاج أنابيب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في طبل الأسطوانة على 60 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 1 مل من C. ثقافة البيض ونقل إلى 1.7 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة بضع ثوان. إفراغ طاف وإضافة 1 مل من العقيمة PBS، دوامة بدقة. كرر ذلك مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد المستعمرات باستخدام عدادة الكريات عن طريق تمييع 1 مل الأسهم 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol> 4. عن طريق الحقن اسماك الزرد فيوSwimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة طبق الحقن (2٪ الاغاروز) لمدة 30 دقيقة في 33 ° C الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب، وإزالة 100 من 150 مل من E3 + PTU من 15 سم طبق بتري تحتوي على الأسماك لحقن باستخدام ماصة 25 مل من دون أي الشفط الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 4 DPF الزرد بإضافة 2 مل من 4 ملغ / مل التخزين المؤقت تريكين الميثان سلفونات الأسهم (TR) إلى 50 مل سائل الإعلام المتبقية (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) والانتظار لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، حدد السمك مع swimbladder تضخم. كما يمكن فحص الأسماك في ذلك الوقت عن النمط الظاهري متجانسة، مثل توزيع العدلات في الخطة الرئيسية للعمليات: خط GFP تستخدم لتشريح epifluorescence المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع C. الأسهم البيض من التركيز الأصلي (الخطوة 3.8) إلى 1.5 × 10 7 مستعمرة لكل مل (وت م / مل) في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 الزرد على طبق الحقن باستخدام أنابيب نقل البلاستيكTTE وإزالة وسائل الإعلام الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة الصيد سلك (لصقها فائقة 0.012 بوصة خط الصيد قطرها إلى الشعرية البورسليكات)، وجعل 3 خطوط من 10 الأسماك، من خلال عقد طبق حقن عموديا وتوجيه الأسماك عموديا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما دوامة أنبوب مع 1.5 × 10 7 وت م / مل C. البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء واحدة إبرة الصغيرة مع 3 ميكرولتر من C. البيض باستخدام microloader ماصة جديدة طرف وتعيين مدة النبضة إلى الإعداد المناسب (راجع الخطوة 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتناوب على طبق حقن لجعل بزاوية 20 درجة بين الإبرة الدقيقة ورئيس الأسماك، وتهدف نحو الجزء الخلفي من swimbladder (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الإبرة الدقيقة في swimbladder، والتأكد من تحمل الإبرة في التجويف، ثم اضغط على دواسة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر لكل الأسماك ونقل إلى طبق الاسترداد (25 مل E3 + PTU) من الفيضانات الطبق مع E3 لد تفريغها في طبق الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 سمكة أخرى إلى الطبق الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حقن بإبرة صغيرة جديدة مليئة تماما vortexed C. البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النهاية عن طريق حقن السيطرة PBS، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام طبق حقن مختلفة لتجنب التلوث ونقل إلى طبق الانتعاش منفصل (الخطوة 4.10). </li></ol> 5. فحص الأسماك للالمرغوب اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 40 مل من 0.4٪ المنخفضة للذوبان الحل الاغاروز (LMA) وذلك بإضافة 160 ملغ من انخفاض ذوبان الاغاروز إلى 40 مل من E3، عن طريق الميكروويف حتى يذوب، والتبريد إلى 37 درجة مئوية المغلي. إضافة 400 ميكرولتر من TR (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) مرة واحدة تبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة الانتعاش، وتخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU، وتركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 السمك (مع وسائل الإعلام أقل قدر ممكن) إلى 2 مل من LMA في قارب وزنه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الأسماك الفردية مع ماصة نقل وصفيحة السمك مع 1 قطرات من LMA في لوحة التصوير 96-جيدا، فقط باستخدام الآبار المركزية 10 × 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى يتم تحميل جميع الأسماك إلى الشاشة على لوحة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دع وسائل الإعلام يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك في صفهم، والتأكد من أنها على اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 20X على epifluorescence مقلوب / المجهر متحد البؤر والمرشح المناسب، تسجيل عدد من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder كل السمكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد السمك مع 15-25 خلايا الخميرة في swimbladder (أو اللقاح المطلوب)، الموت ببطء الأسماك غير المحدد (800 ميكروغرام / مل من TR في E3) والعودة الأسماك المحدد إلى طبق بتري العميق مع 50 مل من E3 + PTU من قبل مضيفا 3 قطرات من E3 إلى لوحة التصوير آبار مختارة والشفط السمك مع ماصة نقل البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 33 ° C لمدة المرجوة. </li></ol> 6. التصوير الأسماك بعد الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب، وإزالة 25 من 50 مل من وسائل الاعلام E3 + PTU من طبق بتري العميق التي تحتوي على الأسماك إلى الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU المتبقية، نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة السمك في لوحة التصوير 96-جيدا والموقف بشكل مناسب (الخطوات 5،3-5،7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة عن طريق المجهر متحد البؤر باستخدام أشعة الليزر المناسبة والمرشحات الانبعاثات. التركيز الأول على الأسماك باستخدام الهدف 4X تحت تدخل الفرق النقيض (DIC) والحصول على صور من المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف 20X مع الليزر مبائر في وضع المسح الضوئي مع 2 سرعة μsec / بكسل و 1024 × 600 بكسل نسبة الجانب. اكتساب Z-مداخن مع 1 ميكرومتر خطوة حجم، وتطبيق وضع مرشح كالمان من 3 الإطارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى طبق بتري العميق مع 50 مل E3 + PTU أو إلى individuaآبار ل (طبق 24-جيدا الثقافة، 3 مل E3 + PTU)، واحتضان عند 33 ° C. </li></ol> 7. تشريح Swimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد LMA 2٪ (الخطوة 5.3 مع 160 ملغ من انصهار منخفضة الاغاروز في 8 مل من E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت المطلوب، تخدير الأسماك (الخطوة 5.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 سمكة إلى أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي مع 1 مل من E3 والموت ببطء من خلال إضافة 200 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين (نهائي تركيز 800 ميكروغرام / مل) إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة زجاجية التصوير عن طريق وضع 4 قطرات من الشحوم فراغ في الساحة، 1 سم بعيدا على شريحة مجهرية (75 × 25 مم، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت 2 قطرات من 2٪ LMA في وسط الساحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك واحد على شريحة زجاجية منفصلة تحت مجهر تشريح والتحقق من أن القلب قد توقف الضرب، وإزالة المياه الزائدة. </li><lط&gt; استخدام ملاقط غرامة تشريح swimbladder من خلال الحفاظ على الرأس في وضع ثابت مع ملاقط اليسار وسحب أسفل القناة الهضمية الأمامي مع ملاقط الصحيحة (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط swimbladder من قبل القناة الهوائية مع ملاقط اليسار، فصله من الجهاز الهضمي، ووضعه في وسط LMA 2٪ قبل أن يتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع غطاء الانزلاق (18 × 18 ملم) على أعلى من شريحة زجاجية التصوير ودفعها حتى يلمس الشحوم فراغ فضلا عن LMA (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة في غضون 10 دقيقة من تشريح كما هو موضح في الخطوة 6.4. كرر الخطوة 7،7-7،11 مع الأسماك الأخرى. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

السلف والقيود المفروضة على swimbladder حقن مكروي نموذج المرض والنموذج المقدم هنا هو امتداد للنموذج الغمر المخاطية المبيضات وصفها في Gratacap وآخرون (2013)؛ وتضيف مزايا وقت الإصابة التي تسيطر عليها، وجرعة العدوى استنساخه للغاية، وبالتا?...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:259px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deep Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wooden Dowels</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10805-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Melt Agarose</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillary</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPPI-3 Injection system</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back Pressure Unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foot Switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x microscope objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSApo 20x/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roller drum</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>TC-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>60825-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4534-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4532-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH0246-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4520-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Children clay (Play-Doh)</td>
			<td>Hasbro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>VW6276-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer (Hausser scientific)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type A immersion oil</td>
			<td>Blue Marble Products</td>
			<td>51935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>14216-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (Lonza)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fishing wire</td>
			<td>Stren</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well imaging plate (Sensoplate)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease (Dow Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>59344-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microslide (25 x 75 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48300-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48366-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol (EMD chemicals)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well culture dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weight boats (8.9 cm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89106-766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

يتكون دفاع مبكر ضد مسببات الأمراض المخاطية لكل من حاجز الظهارية والخلايا المناعية الفطرية. وimmunocompetency على حد سواء، والاتصال الداخلي، ولها أهمية قصوى لحماية ضد الالتهابات. من الأفضل أن التحقيق تفاعلات الخلايا المناعية الفطرية الظهارية ومع الممرض في الجسم الحي، حيث تتكشف سلوك معقد عبر الزمان والمكان. ومع ذلك، النماذج الحالية لا تسمح لسهولة التصوير المكانية والزمانية للمعركة مع مسببات الأمراض على مستوى الغشاء المخاطي. النموذج المطور هنا يخلق إصابة الغشاء المخاطي عن طريق الحقن المباشر للممرض فطري، المبيضات البيض، في swimbladder من الزرد الأحداث. العدوى الناجمة تمكن عالية الدقة التصوير السلوك الخلايا المناعية الظهارية والفطري في جميع أنحاء تطور مرض الغشاء المخاطي. براعة هذا الأسلوب يسمح للاستجواب من المضيف للتحقيق في تسلسل مفصل للأحداث المناعة مما يؤدي إلى فتاهالتوظيف agocyte وللنظر في أدوار معينة أنواع الخلايا والمسارات الجزيئية في مجال الحماية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير سلوك الممرض بوصفها وظيفة من الهجوم المناعي في وقت واحد باستخدام الفلورسنت، معربا عن بروتين C. البيض. زيادة القرار المكانية للتفاعل المضيف الممرض هو ممكن أيضا باستخدام تقنية swimbladder تشريح السريعة وصفها. نموذج إصابة الغشاء المخاطي الموصوفة هنا واضح وصريح وتكرار للغاية، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة داء المبيضات المخاطية. هذا النظام قد يكون أيضا للترجمة على نطاق واسع لمسببات الأمراض المخاطية الأخرى مثل الميكروبات المتفطرات، البكتيرية أو الفيروسية التي تصيب عادة من خلال الأسطح الظهارية.

حقن مكروي في swimbladder الخلفي المنهج التجريبي المعروضة هنا يصف حقن جرعة ثابتة من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder من 4 DPF الزرد. العمل السابق مع نموذج الغمر تشير إلى أن الاستجابة المناعية للswimbladder C. البيض هو مماثل لالثدييا?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Video: Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات لتحديد وتقدير حجم

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

نموذج العدوى واكسوورم Galleria mellonella "نشر داء المبيضات"

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

تحريض إصابة الرئة الماوس عن طريق حقن الرغامى من بليموسين

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells to inflammatory disease due to their functionally conserved innate immune system. They are also widely used to examine how innate immune cells help guide developmental processes. By taking advantage of the optical transparency and genetic tractability of larval zebrafish, these studies often focus on live imaging approaches to functionally characterize fluorescently marked macrophages and neutrophils within intact animals. Due to their diverse functional heterogeneity and ever-expanding roles in disease pathogenesis, macrophages have received significant attention. In addition to genetic manipulations, chemical interventions are now routinely used to manipulate and examine macrophage behavior in larval zebrafish. Delivery of these drugs is typically limited to passive targeting of free drug through direct immersion or microinjection. These approaches rely on the assumption that any changes to macrophage behavior are the result of a direct effect of the drug on the macrophages themselves, and not a downstream consequence of a direct effect on another cell type. Here, we present our protocols for targeting drugs specifically to larval zebrafish macrophages by microinjecting drug-loaded fluorescent liposomes. We reveal that poloxamer 188-modified drug-loaded blue fluorescent liposomes are readily taken up by macrophages, and not by neutrophils. We also provide evidence that drugs delivered in this way can impact macrophage activity in a manner consistent with the mechanism of action of the drug. This technique will be of value to researchers wanting to ensure targeting of drugs to macrophages and when drugs are too toxic to be delivered by traditional methods like immersion.

Here, we describe the synthesis of drug-loaded liposomes and their microinjection into larval zebrafish for the purpose of targeting drug delivery to macrophage-lineage cells.

استهداف المخدرات إلى اليرقات حمار وحشي الضامة عن طريق حقن Liposomes المحملة بالمخدرات

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...