الكتاب أشكر الدكتور لو ترينه والدكتور توبين لتوفير بسخاء-كاتينين α: خط الأسماك السترين وبيل جاكمان على إتاحة الفرصة لنا للقيام التصوير في مختبره. المؤلفون تقر مصادر التمويل المعاهد الوطنية للصحة (المنح 5P20RR016463، 8P20GM103423 وR15AI094406) ووزارة الزراعة الأميركية (مشروع # ME0-H-1-00517-13). يتم نشر هذه المخطوطة كما الزراعة الرئيسية وتجربة الغابات المنشور محطة رقم 3371.

ملاحظة: تم تنفيذ كافة بروتوكولات الرعاية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة تحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) بروتوكول A2012-11-03. 1. الزرد تربية إلى 4 أيام بعد الإخصاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع AB الزرد، أو أي خطوط المعدلة وراثيا أخرى، في أول الإخصاب آخر 3 ساعة، كما هو مبين في فيديو آخر 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض 120 في 15 سم أطباق بتري تحتوي على 150 مل من وسائل الاعلام E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgCl 2، 2 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8) مع الميثيلين الأزرق (0.3 ميكروغرام / مل النهائي تركيز) في 33 ° C حاضنة مع 12/12 ضوء / الإضاءة المظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الاعلام بعد 6 ساعات مع E3 + PTU (1-فينيل-2-ثيوريا، 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) وإزالة البيض الميت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 4 أيام في 33 ° C، وتبادل وسائل الإعلام مع E3 الطازجة + PTU بعد 2 أيام. </li></ol> 2. فيjection مايكرو إبرة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الشعرية البورسليكات (OD 1.2 مم؛ ID 0.69 مم) في إبرة الجزئي باستخدام إبرة مجتذب مع الإعدادات التالية (550 الحرارة، 0 سحب، سرعة 130، 110 مرة). ملاحظة: تختلف الإعدادات من خيوط لخيوط للحصول على شكل وبالمثل الإبر الصغيرة (انظر الشكل 1)، وسوف تحتاج إلى إعادة تعديل كلما تم تثبيت خيوط جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء إبرة الجزئي مع 3 ميكرولتر من 0.4 ميكرون تصفية المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS، 137 مم كلوريد الصوديوم؛ 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4؛ 1.8 ملي KH 2 PO 4؛ ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة معلومات سرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة صغيرة على حامل ممص مكروى على micromanipulator تعلق على نظام حقن الضغط. ضبط ضغط الحقن إلى 30 PSI ومدة النبضة في 30 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طبق بتري مع الماء المقطر، وانخفاض الإبرة الدقيقة حتى 1/5 من الإبرة هو في الماء. مقطع واي الدقيقة إبرةث ملاقط غرامة أقل بقليل من مستوى المياه. جلب الإبرة الصغيرة من الماء، ودفع دواسة عدة مرات حتى تظهر بلعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس قطر البلعة عن طريق خفض إبرة صغيرة على عدادة الكريات الطبقات مع قطرة واحدة من نوع الزيت الغمر. ضبط مدة النبضة للحصول على حجم المطلوب (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين احداهما لالبلعة أن تبقى مستقرة في الزيت (خفض ضغط إذا كان البلعة يزيد حجم وزيادة الضغط الخلفي إذا يقلل من حجم البلعة). تسجيل مدة النبضة لكل الإبرة الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS من الإبرة الدقيقة بواسطة الشفط باستخدام ماصة طرف microloader وطرد اليسار الإفراط في برنامج تلفزيوني عن طريق وضعها مرة أخرى على حاقن والتقليب التحول النبض المستمر. حجز كل إبرة صغيرة. </li></ol> 3. إعداد المبيضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المبيضات البيض تحولت مع الأمثل كودون dTomato، GFP، BFP، EOS أو الأقصىالأحمر من الأسهم المجمدة (-80 ° C الأسهم في 25٪ الجلسرين) باستخدام وتد خشبي عقيمة في الصعود إلى سكر العنب الخميرة peptine (YPD) لوحة أجار (10 ز / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب ، 20 ز / L أجار، تعقيمها وسكب 25 مل في أطباق بتري) واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مستعمرة واحدة باستخدام وتد خشبي معقمة وتلقيح إلى 5 مل من YPD السائل (10 غ / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L ببتون، 20 ز / L سكر العنب، تعقيمها وaliquotted جو معقم و مطهر في 5 مل في 16 × 150 مم الثقافة الزجاج أنابيب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في طبل الأسطوانة على 60 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 1 مل من C. ثقافة البيض ونقل إلى 1.7 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة بضع ثوان. إفراغ طاف وإضافة 1 مل من العقيمة PBS، دوامة بدقة. كرر ذلك مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد المستعمرات باستخدام عدادة الكريات عن طريق تمييع 1 مل الأسهم 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol> 4. عن طريق الحقن اسماك الزرد فيوSwimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة طبق الحقن (2٪ الاغاروز) لمدة 30 دقيقة في 33 ° C الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب، وإزالة 100 من 150 مل من E3 + PTU من 15 سم طبق بتري تحتوي على الأسماك لحقن باستخدام ماصة 25 مل من دون أي الشفط الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 4 DPF الزرد بإضافة 2 مل من 4 ملغ / مل التخزين المؤقت تريكين الميثان سلفونات الأسهم (TR) إلى 50 مل سائل الإعلام المتبقية (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) والانتظار لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، حدد السمك مع swimbladder تضخم. كما يمكن فحص الأسماك في ذلك الوقت عن النمط الظاهري متجانسة، مثل توزيع العدلات في الخطة الرئيسية للعمليات: خط GFP تستخدم لتشريح epifluorescence المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع C. الأسهم البيض من التركيز الأصلي (الخطوة 3.8) إلى 1.5 × 10 7 مستعمرة لكل مل (وت م / مل) في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 الزرد على طبق الحقن باستخدام أنابيب نقل البلاستيكTTE وإزالة وسائل الإعلام الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة الصيد سلك (لصقها فائقة 0.012 بوصة خط الصيد قطرها إلى الشعرية البورسليكات)، وجعل 3 خطوط من 10 الأسماك، من خلال عقد طبق حقن عموديا وتوجيه الأسماك عموديا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما دوامة أنبوب مع 1.5 × 10 7 وت م / مل C. البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء واحدة إبرة الصغيرة مع 3 ميكرولتر من C. البيض باستخدام microloader ماصة جديدة طرف وتعيين مدة النبضة إلى الإعداد المناسب (راجع الخطوة 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتناوب على طبق حقن لجعل بزاوية 20 درجة بين الإبرة الدقيقة ورئيس الأسماك، وتهدف نحو الجزء الخلفي من swimbladder (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الإبرة الدقيقة في swimbladder، والتأكد من تحمل الإبرة في التجويف، ثم اضغط على دواسة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر لكل الأسماك ونقل إلى طبق الاسترداد (25 مل E3 + PTU) من الفيضانات الطبق مع E3 لد تفريغها في طبق الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 سمكة أخرى إلى الطبق الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حقن بإبرة صغيرة جديدة مليئة تماما vortexed C. البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النهاية عن طريق حقن السيطرة PBS، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام طبق حقن مختلفة لتجنب التلوث ونقل إلى طبق الانتعاش منفصل (الخطوة 4.10). </li></ol> 5. فحص الأسماك للالمرغوب اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 40 مل من 0.4٪ المنخفضة للذوبان الحل الاغاروز (LMA) وذلك بإضافة 160 ملغ من انخفاض ذوبان الاغاروز إلى 40 مل من E3، عن طريق الميكروويف حتى يذوب، والتبريد إلى 37 درجة مئوية المغلي. إضافة 400 ميكرولتر من TR (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) مرة واحدة تبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة الانتعاش، وتخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU، وتركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 30 السمك (مع وسائل الإعلام أقل قدر ممكن) إلى 2 مل من LMA في قارب وزنه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الأسماك الفردية مع ماصة نقل وصفيحة السمك مع 1 قطرات من LMA في لوحة التصوير 96-جيدا، فقط باستخدام الآبار المركزية 10 × 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى يتم تحميل جميع الأسماك إلى الشاشة على لوحة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دع وسائل الإعلام يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك في صفهم، والتأكد من أنها على اتصال مع الجزء السفلي من الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 20X على epifluorescence مقلوب / المجهر متحد البؤر والمرشح المناسب، تسجيل عدد من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder كل السمكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد السمك مع 15-25 خلايا الخميرة في swimbladder (أو اللقاح المطلوب)، الموت ببطء الأسماك غير المحدد (800 ميكروغرام / مل من TR في E3) والعودة الأسماك المحدد إلى طبق بتري العميق مع 50 مل من E3 + PTU من قبل مضيفا 3 قطرات من E3 إلى لوحة التصوير آبار مختارة والشفط السمك مع ماصة نقل البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 33 ° C لمدة المرجوة. </li></ol> 6. التصوير الأسماك بعد الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المطلوب، وإزالة 25 من 50 مل من وسائل الاعلام E3 + PTU من طبق بتري العميق التي تحتوي على الأسماك إلى الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأسماك كما هو موضح (الخطوة 4.3 باستخدام 1 فقط مل من TR إلى 25 مل E3 + PTU المتبقية، نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة السمك في لوحة التصوير 96-جيدا والموقف بشكل مناسب (الخطوات 5،3-5،7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة عن طريق المجهر متحد البؤر باستخدام أشعة الليزر المناسبة والمرشحات الانبعاثات. التركيز الأول على الأسماك باستخدام الهدف 4X تحت تدخل الفرق النقيض (DIC) والحصول على صور من المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف 20X مع الليزر مبائر في وضع المسح الضوئي مع 2 سرعة μsec / بكسل و 1024 × 600 بكسل نسبة الجانب. اكتساب Z-مداخن مع 1 ميكرومتر خطوة حجم، وتطبيق وضع مرشح كالمان من 3 الإطارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى طبق بتري العميق مع 50 مل E3 + PTU أو إلى individuaآبار ل (طبق 24-جيدا الثقافة، 3 مل E3 + PTU)، واحتضان عند 33 ° C. </li></ol> 7. تشريح Swimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد LMA 2٪ (الخطوة 5.3 مع 160 ملغ من انصهار منخفضة الاغاروز في 8 مل من E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت المطلوب، تخدير الأسماك (الخطوة 5.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 سمكة إلى أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي مع 1 مل من E3 والموت ببطء من خلال إضافة 200 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين (نهائي تركيز 800 ميكروغرام / مل) إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة زجاجية التصوير عن طريق وضع 4 قطرات من الشحوم فراغ في الساحة، 1 سم بعيدا على شريحة مجهرية (75 × 25 مم، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت 2 قطرات من 2٪ LMA في وسط الساحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك واحد على شريحة زجاجية منفصلة تحت مجهر تشريح والتحقق من أن القلب قد توقف الضرب، وإزالة المياه الزائدة. </li><lط&gt; استخدام ملاقط غرامة تشريح swimbladder من خلال الحفاظ على الرأس في وضع ثابت مع ملاقط اليسار وسحب أسفل القناة الهضمية الأمامي مع ملاقط الصحيحة (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط swimbladder من قبل القناة الهوائية مع ملاقط اليسار، فصله من الجهاز الهضمي، ووضعه في وسط LMA 2٪ قبل أن يتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع غطاء الانزلاق (18 × 18 ملم) على أعلى من شريحة زجاجية التصوير ودفعها حتى يلمس الشحوم فراغ فضلا عن LMA (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة في غضون 10 دقيقة من تشريح كما هو موضح في الخطوة 6.4. كرر الخطوة 7،7-7،11 مع الأسماك الأخرى. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

السلف والقيود المفروضة على swimbladder حقن مكروي نموذج المرض والنموذج المقدم هنا هو امتداد للنموذج الغمر المخاطية المبيضات وصفها في Gratacap وآخرون (2013)؛ وتضيف مزايا وقت الإصابة التي تسيطر عليها، وجرعة العدوى استنساخه للغاية، وبالتا?...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml tubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Deep Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Wooden dowels</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 injection system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td><td></td></tr><tr><td>20X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Roller drum</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Children clay (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A immersion oil</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fishing wire</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well imaging plate (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Microslide (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (EMD chemicals)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-well culture dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Weight boats (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

يتكون دفاع مبكر ضد مسببات الأمراض المخاطية لكل من حاجز الظهارية والخلايا المناعية الفطرية. وimmunocompetency على حد سواء، والاتصال الداخلي، ولها أهمية قصوى لحماية ضد الالتهابات. من الأفضل أن التحقيق تفاعلات الخلايا المناعية الفطرية الظهارية ومع الممرض في الجسم الحي، حيث تتكشف سلوك معقد عبر الزمان والمكان. ومع ذلك، النماذج الحالية لا تسمح لسهولة التصوير المكانية والزمانية للمعركة مع مسببات الأمراض على مستوى الغشاء المخاطي. النموذج المطور هنا يخلق إصابة الغشاء المخاطي عن طريق الحقن المباشر للممرض فطري، المبيضات البيض، في swimbladder من الزرد الأحداث. العدوى الناجمة تمكن عالية الدقة التصوير السلوك الخلايا المناعية الظهارية والفطري في جميع أنحاء تطور مرض الغشاء المخاطي. براعة هذا الأسلوب يسمح للاستجواب من المضيف للتحقيق في تسلسل مفصل للأحداث المناعة مما يؤدي إلى فتاهالتوظيف agocyte وللنظر في أدوار معينة أنواع الخلايا والمسارات الجزيئية في مجال الحماية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير سلوك الممرض بوصفها وظيفة من الهجوم المناعي في وقت واحد باستخدام الفلورسنت، معربا عن بروتين C. البيض. زيادة القرار المكانية للتفاعل المضيف الممرض هو ممكن أيضا باستخدام تقنية swimbladder تشريح السريعة وصفها. نموذج إصابة الغشاء المخاطي الموصوفة هنا واضح وصريح وتكرار للغاية، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة داء المبيضات المخاطية. هذا النظام قد يكون أيضا للترجمة على نطاق واسع لمسببات الأمراض المخاطية الأخرى مثل الميكروبات المتفطرات، البكتيرية أو الفيروسية التي تصيب عادة من خلال الأسطح الظهارية.

حقن مكروي في swimbladder الخلفي المنهج التجريبي المعروضة هنا يصف حقن جرعة ثابتة من C. خلايا الخميرة البيض في swimbladder من 4 DPF الزرد. العمل السابق مع نموذج الغمر تشير إلى أن الاستجابة المناعية للswimbladder C. البيض هو مماثل لالثدييا?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Video: Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Developmental Biology

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

فك رموز والتصوير إمراض وحبال من<em&gt; المتفطرة خراج</em&gt; في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

تطوير نموذج عدوى حمار وحشي لـ Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells to inflammatory disease due to their functionally conserved innate immune system. They are also widely used to examine how innate immune cells help guide developmental processes. By taking advantage of the optical transparency and genetic tractability of larval zebrafish, these studies often focus on live imaging approaches to functionally characterize fluorescently marked macrophages and neutrophils within intact animals. Due to their diverse functional heterogeneity and ever-expanding roles in disease pathogenesis, macrophages have received significant attention. In addition to genetic manipulations, chemical interventions are now routinely used to manipulate and examine macrophage behavior in larval zebrafish. Delivery of these drugs is typically limited to passive targeting of free drug through direct immersion or microinjection. These approaches rely on the assumption that any changes to macrophage behavior are the result of a direct effect of the drug on the macrophages themselves, and not a downstream consequence of a direct effect on another cell type. Here, we present our protocols for targeting drugs specifically to larval zebrafish macrophages by microinjecting drug-loaded fluorescent liposomes. We reveal that poloxamer 188-modified drug-loaded blue fluorescent liposomes are readily taken up by macrophages, and not by neutrophils. We also provide evidence that drugs delivered in this way can impact macrophage activity in a manner consistent with the mechanism of action of the drug. This technique will be of value to researchers wanting to ensure targeting of drugs to macrophages and when drugs are too toxic to be delivered by traditional methods like immersion.

Here, we describe the synthesis of drug-loaded liposomes and their microinjection into larval zebrafish for the purpose of targeting drug delivery to macrophage-lineage cells.

استهداف المخدرات إلى اليرقات حمار وحشي الضامة عن طريق حقن Liposomes المحملة بالمخدرات

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

عدوى يرقات حمار وحشي مع جراثيم أسبيرغيلوس لتحليل التفاعلات المضيفة الممرضة

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

الحقن المجهري للبطين الدماغي لعديد السكاريد الشحمي في يرقات الزرد لتقييم الالتهاب العصبي والسمية العصبية

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Summary

Explore More Videos