המחברים מודים לד&quot;ר Le טרין וד&quot;ר טובין לנדיבות מתן α-קטנין: קו דגי סיטרין וביל ג&#39;קמן על שאפשר לנו לעשות את הצילומים במעבדה שלו. המחברים מודים מקורות מימון המכון הלאומי לבריאות (המענקים 5P20RR016463, 8P20GM103423 וR15AI094406) ומשרד חקלאות אמריקאי (פרויקט # ME0-H-1-00517-13). כתב יד זה מתפרסם כחקלאות וראשי ניסוי יערנות מספר פרסום התחנה 3371.

הערה: כל פרוטוקולי טיפול דג הזברה והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות NIH תחת מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) A2012-11-03 פרוטוקול. 1. דג הזברה גידול עד 4 ימי הפריה הודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דג הזברה AB, או כל קווים מהונדסים אחרים, תוך שלאחר ההפריה 3 שעות הראשונות, כפי שמוצג בסרטון אחר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 120 ביצים ב-15 סנטימטרים צלחות פטרי המכילות 150 מיליליטר של תקשורת E3 (5 mM NaCl; 0.17 מ&quot;מ KCl; 0.33 מ&quot;מ CaCl 2; 0.33 מ&quot;מ MgCl 2; 2 מ&quot;מ HEPES; pH 6.8) עם מתילן הכחול (מיקרוגרם 0.3 סופי / ml ריכוז) בחממה C ° 33 עם 12/12 האור / photoperiod כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת לאחר שעה 6 עם E3 + PTU (1-פניל-2-thiourea, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) ולהסיר את הביצים מתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 ימים על 33 מעלות צלזיוס, החלפת מדיה עם E3 הטרי + PTU לאחר 2 ימים. </li></ol> 2. בjection מיקרו-מחט הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי בורוסיליקט (1.2 מ&quot;מ OD, מ&quot;מ ID 0.69) למייקרו-מחט באמצעות חולץ מחט עם ההגדרות הבאות (550 חום; 0 Pull; 130 Velocity; 110 זמן). הערה: ההגדרות תשתנה מחוט הלהט לחוט להט להשיג מיקרו-מחטים בצורה דומה (ראה איור 1) ויהיה צורך בכל פעם שסדרה את נימה חדשה מותקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט עם 3 μl של 0.4 מיקרומטר מלוח מסונן-חיץ פוספט (PBS; 137 מ&quot;מ NaCl; 2.7 מ&quot;מ KCl; 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4; 1.8 מ&quot;מ KH 2 PO 4; pH 7.4) בעזרת פיפטה microloader 20 μl טיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרו-המחט על בעל micropipette על micromanipulator המחובר למערכת הזרקה בלחץ. הגדר את לחץ ההזרקה עד 30 PSI ומשך הדופק ליום 30 באלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת פטרי עם מים מזוקקים, להוריד את מיקרו-המחט עד 1/5 של המחט הוא במים. קליפ wi מיקרו-המחטth פינצטה בסדר, ממש מתחת למפלס המים. להביא מיקרו-המחט מחוץ למים וללחוץ על הדוושה מספר פעמים עד בולוס מופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הקוטר של בולוס ידי הורדת מיקרו-המחט על hemocytometer שכבתי עם ירידה של סוג אחד שמן טבילה. התאם את משך הדופק כדי לקבל את העצמה הרצויה (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את backpressure לבולוס להישאר יציב בשמן (להוריד את הלחץ אם בולוס מגביר את עוצמת השמע ולהגדיל את backpressure אם בולוס הנפח קטן). רשום את משך הדופק לכל מיקרו-מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ממייקרו-המחט על ידי aspirating אותו באמצעות קצה פיפטה microloader ולגרש את השמאל על PBS על ידי הצבת אותו בחזרה על המזרק ומדליק את הדופק הרציף. שומר כל מיקרו-מחט. </li></ol> 3. הכנת קנדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנדידה אלביקנס Streak הפך עם אופטימיזציה קודון dTomato, GFP, BFP, EOS או רחוקאדום ממניות קפוא (-80 ° C המניה ב -25% גליצרול) באמצעות מסמרת עץ סטרילי על דקסטרוז שמרי peptine (YPD) צלחת אגר (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L , אגר L / 20 g; autoclaved ושפכתי 25 מיליליטר בצלחות פטרי) ודגירת הלילה בשעה 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת באמצעות מסמרת עץ סטרילי ולחסן 5 מיליליטר של נוזל YPD (10 גר &#39;שמרי L / תמצית, 20 גר&#39; / peptone L, 20 גר &#39;/ דקסטרוז L, autoclaved וaliquotted סביבה נקי מחיידקים ב5 מיליליטר בתרבות זכוכית 16 x 150 מ&quot;מ צינורות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 30 ° C בתוף רולר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 1 מיליליטר של ג תרבות אלביקנס והעברה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.7 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 5000 במשך כמה שניות. רוקן את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של סטרילית PBS, מערבולת ביסודיות. חזור פעמיים זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת המושבות באמצעות hemocytometer על ידי דילול מניות 1 מיליליטר 1: 1,000 בPBS סטרילי. </li></ol> 4. הזרקת דג הזברה בSwimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם צלחת הזרקה (agarose 2%) למשך 30 דקות בחממה C ° 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 100 של 150 מיליליטר של E3 + PTU מ -15 סנטימטרים צלחת פטרי המכילה דגים להזריק בעזרת פיפטה 25 מיליליטר ללא aspirating כל דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 4 DPF דג הזברה על ידי הוספת 2 מיליליטר של 4 מ&quot;ג / מיליליטר שנאגרו tricaine מניות מתאן sulfonate (TR) לנותרה 50 מיליליטר התקשורת (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) ולהמתין במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, בחר דגים עם swimbladder מנופח. דגים גם יכולים להיות מוקרנים באותו הזמן לפנוטיפ הומוגנית, כגון הפצת נויטרופילים בMPO: קו GFP באמצעות epifluorescence לנתח מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ג מניית אלביקנס מריכוזו המקורי (שלב 3.8) 1.5 x 10 7 מושבה להרכיב יחידות למ&quot;ל (CFU / ml) בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דג הזברה על צלחת ההזרקה באמצעות צינור העברת פלסטיקטטי ולהסיר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי דיג-חוט (חוט דיג קוטר 0.012 אינץ &#39;סופר-דבוק לנימי ורוסיליקט), לעשות 3 שורות של 10 דגים, על ידי הלחיצה על צלחת ההזרקה אנכית ולהתמצא הדגים אנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה העודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות מערבולת הצינור עם 1.5 x 10 7 CFU / ml ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיקרו-מחט אחת עם 3 μl של ג אלביקנס באמצעות קצה פיפטה microloader חדש ולהגדיר את משך הדופק להגדרה המתאימה (ראה שלב 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת ההזרקה לעשות זווית של 20 מעלות בין מיקרו-המחט והראש של הדג, מכוון לכיוון חלק האחורי של swimbladder (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מיקרו-המחט לתוך swimbladder, כדי לוודא שנשאת של המחט הוא בלומן, ולחץ על הדוושה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל דגים ולהעביר לצלחת התאוששות (25 מיליליטר E3 + PTU) על ידי הצפת המנה עם E3ד לרוקן אותה לתוך צלחת ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 30 דגים אחר לצלחת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה חוזרת עם מיקרו-מחט חדשה מלאה ביסודיות vortexed ג אלביקנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיום על ידי הזרקת שליטת PBS, במידת צורך, באמצעות צלחת הזרקה שונה, כדי למנוע זיהום ולהעביר לצלחת נפרדת התאוששות (שלב 4.10). </li></ol> 5. הקרנת הדגים לבידוד רצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של 0.4% נמוכים להמיס פתרון agarose (אה&quot;ע) על ידי הוספת 160 מ&quot;ג של נמוך להמיס agarose 40 מיליליטר של E3, רותח על ידי במיקרוגל עד שהיא נמסה, וקירור עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 400 μl של TR (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) מקורר פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות התאוששות, לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מ&quot;ל E3 + PTU, 200 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 30 דגים (עם תקשורת קטנה ככל האפשר) עד 2 מיליליטר של LMA בסירה במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים לשאוב בודדים עם טפטפת העברה וצלחת הדגים עם טיפות 1 של LMA לתוך צלחת הדמיה 96-היטב, רק באמצעות 10 x 6 הבארות מרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד שכל הדגים למסך נטענים לצלחת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התקשורת לגבש בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגים בצד שלהם, כדי לוודא שהם נמצאים בקשר עם תחתית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 20X על epifluorescence / מיקרוסקופ confocal הפוך והמסנן המתאים, לרשום את המספר של ג תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של כל דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הדג עם 15-25 תאי שמרים בswimbladder (או הבידוד רצוי), להרדים לא נבחרו-דגים (800 / מיליליטר מיקרוגרם של TR בE3) ולחזור דגים נבחרו לצלחת פטרי עמוקה 50 מיליליטר של E3 + PTU עם על ידי הוספת 3 טיפות של E3 לבארות שנבחרו צלחת ההדמיה וaspirating הדגים עם טפטפת העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 33 מעלות צלזיוס למשך הרצוי. </li></ol> 6. הדמיה הדגים Post-ההקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, להסיר 25 של 50 מיליליטר של תקשורת E3 + PTU מהצלחת העמוקה פטרי המכילה דגים לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מיליליטר E3 + PTU שנותר, מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הדגים לצלחת 96-היטב הדמיה ומיקום הולם (שלבים 5.3-5.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על ידי סריקה מיקרוסקופית confocal באמצעות הלייזרים המתאימים ומסנני פליטה. מוקד ראשון על הדגים באמצעות מטרת 4X תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ולרכוש תמונות של האזור של עניין באמצעות מטרת 20X עם לייזרי confocal במצב סריקה עם 2 מהירות μsec / פיקסל ו1024 x 600 פיקסל יחס ממדים. לרכוש Z- ערימות עם גודל צעד מיקרומטר 1, החלת מצב מסנן קלמן של 3 מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל צלחת פטרי עמוקה עם 50 מיליליטר E3 + PTU או לindividuaבארות l (צלחת 24 גם תרבות, 3 מיליליטר E3 + PTU) ולדגור על 33 מעלות צלזיוס. </li></ol> 7. ביתור Swimbladder <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LMA 2% (שלב 5.3 עם 160 מ&quot;ג של התכה נמוכה agarose ב 8 מיליליטר של E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הרצוי, לטשטש את הדגים (שלב 5.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 10 דגים לצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות עם 1 מיליליטר של E3 ולהרדים על ידי הוספת 200 μl של 4 מ&quot;ג / מיליליטר Tricaine (מיקרוגרם / מיליליטר סופי ריכוז 800) לצינור צנטריפוגות ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות זכוכית הדמיה על ידי הצבת 4 טיפות של שומן ואקום בכיכר, מלבד 1 סנטימטר על microslide (75 x 25 מ&quot;מ, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 טיפות של 2% LMA באמצע הכיכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דג אחד בשקופית זכוכית נפרדת תחת מיקרוסקופ לנתח ולוודא שהלב הפסיק מכות, להסיר את עודפי המים. </li><li&gt; שימוש בפינצטה בסדר לנתח swimbladder על ידי שמירה על הראש בתנוחה קבועה עם פינצטה השמאל ומושך את הבטן הקדמית עם פינצטה תקין (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את swimbladder על ידי צינור פנאומטי עם פינצטה השמאל, מפריד אותה ממערכת העיכול, ולמקם אותו במרכזה של LMA 2% לפני שהוא מבצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כיסוי להחליק (18 x 18 מ&quot;מ) על גבי שקופית זכוכית הדמיה ולדחוף אותו עד שהוא נוגע גריז הוואקום, כמו גם את אה&quot;ע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בתוך 10 דקות של נתיחה כמתואר בשלב 6.4. חזור על שלב 7.7-7.11 עם הדגים האחרים. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התקדמות ומגבלות מודל המחלה microinjection swimbladder המודל שהוצג כאן הוא הרחבה של מודל טבילת פטרת הרירי המתואר בGratacap et al (2013).; זה מוסיף את היתרונות של זמן זיהום בשליטה, במינון מאוד לשחזור זיהום, ושיפור יעילות ולכן. אנו מדגימים כאן שיטות חד...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:259px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deep Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wooden Dowels</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10805-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Melt Agarose</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillary</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPPI-3 Injection system</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back Pressure Unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foot Switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x microscope objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSApo 20x/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roller drum</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>TC-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>60825-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4534-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4532-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH0246-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4520-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Children clay (Play-Doh)</td>
			<td>Hasbro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>VW6276-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer (Hausser scientific)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type A immersion oil</td>
			<td>Blue Marble Products</td>
			<td>51935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>14216-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (Lonza)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fishing wire</td>
			<td>Stren</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well imaging plate (Sensoplate)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease (Dow Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>59344-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microslide (25 x 75 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48300-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48366-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol (EMD chemicals)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well culture dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weight boats (8.9 cm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89106-766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

הגנה מוקדמת מפני פתוגנים רירית מורכבת משני מחסום האפיתל ותאי חיסון מולדים. Immunocompetency של שניהם, ואינטרקום, הם בעל חשיבות עליונה להגנה מפני זיהומים. האינטראקציות של תאי מערכת חיסון המולדים אפיתל ועם הפתוגן נחקרות הטובות ביותר in vivo, שבו התנהגות מורכבת נפרש על פני זמן ובמרחב. עם זאת, מודלים קיימים אינם מאפשרים הדמיה מרחב ובזמן קלה של הקרב עם פתוגנים ברמה הרירית. המודל שפותח כאן יוצר זיהום ברירית על ידי הזרקה ישירה של הפתוגן פטרייתי, קנדידה אלביקנס, לswimbladder של דג הזברה לנוער. הזיהום כתוצאה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אפיתל והמולד התנהגות תא חיסונית לאורך התפתחות מחלת רירית. הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת לחקירה של המארח כדי לחקור את הרצף המפורט של אירועים חיסוניים המובילים לphגיוס agocyte ולבחון את תפקידם של סוגי תאים מסוימים ומסלולים מולקולריים בהגנה. בנוסף, ההתנהגות של הפתוגן כפונקציה של התקפה חיסונית ניתן הדמיה בו זמנית על ידי שימוש בג-להביע חלבון פלואורסצנטי אלביקנס. רזולוציה מרחבית מוגברת של האינטראקציה מארח הפתוגן ניתן גם להשתמש בטכניקה לנתיחה swimbladder המהירה תיארה. מודל הזיהום ברירית שתואר כאן הוא פשוט ושחזור מאוד, מה שהופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פטרת ברירית. מערכת זו יכולה להיות גם באופן רחב הניתנות לתרגום לפתוגנים ריריים אחרים כגון חיידקים mycobacterial, חיידקים או ויראלי, כי בדרך כלל להדביק באמצעות משטחי אפיתל.

Microinjection בswimbladder האחורי השיטה הניסיונית שהוצגה כאן מתארת ​​את ההזרקה של מינון של ג עקבי תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של 4 DPF דג הזברה. עבודה קודמת עם מודל הטבילה עולה כי התגובה החיסונית swimbladder לג אלביקנס דומה לפטרת ברירית ?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Video: Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells to inflammatory disease due to their functionally conserved innate immune system. They are also widely used to examine how innate immune cells help guide developmental processes. By taking advantage of the optical transparency and genetic tractability of larval zebrafish, these studies often focus on live imaging approaches to functionally characterize fluorescently marked macrophages and neutrophils within intact animals. Due to their diverse functional heterogeneity and ever-expanding roles in disease pathogenesis, macrophages have received significant attention. In addition to genetic manipulations, chemical interventions are now routinely used to manipulate and examine macrophage behavior in larval zebrafish. Delivery of these drugs is typically limited to passive targeting of free drug through direct immersion or microinjection. These approaches rely on the assumption that any changes to macrophage behavior are the result of a direct effect of the drug on the macrophages themselves, and not a downstream consequence of a direct effect on another cell type. Here, we present our protocols for targeting drugs specifically to larval zebrafish macrophages by microinjecting drug-loaded fluorescent liposomes. We reveal that poloxamer 188-modified drug-loaded blue fluorescent liposomes are readily taken up by macrophages, and not by neutrophils. We also provide evidence that drugs delivered in this way can impact macrophage activity in a manner consistent with the mechanism of action of the drug. This technique will be of value to researchers wanting to ensure targeting of drugs to macrophages and when drugs are too toxic to be delivered by traditional methods like immersion.

Here, we describe the synthesis of drug-loaded liposomes and their microinjection into larval zebrafish for the purpose of targeting drug delivery to macrophage-lineage cells.

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...