Gli autori ringraziano il Dr. Le Trinh e Dr. Tobin per generosamente fornire la α-catenina: linea pesce citrino e Bill Jackman per averci permesso di fare le riprese nel suo laboratorio. Gli autori riconoscono le fonti di finanziamento National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Questo manoscritto è pubblicato come principale dell&#39;agricoltura e delle foreste Esperimento numero di pubblicazione Stazione 3371.

NOTA: Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH sotto Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocollo A2012-11-03. 1. Zebrafish allevamento a 4 giorni dopo la fecondazione <ol><li> Raccogliere AB zebrafish, o qualsiasi altra linee transgeniche, entro il primo 3 ore dopo la fecondazione, come mostrato in un altro video 34. </li><li> Incubare 120 uova in un 15 centimetri piastre Petri contenenti 150 ml di E3 Media (5 NaCl mm 0,17 mM KCl; 0,33 mm CaCl 2; 0,33 mm MgCl 2; 2 HEPES mM; pH 6.8) con il blu di metilene (0,3 mg / ml finale concentrazione) in un incubatore a 33 ° con 12/12 luce / buio fotoperiodo. </li><li> Sostituire la media dopo 6 ore con E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, 10 mg / ml concentrazione finale) e rimuovere le uova morti. </li><li> Incubare per 4 giorni a 33 ° C, lo scambio dei mezzi con fresca E3 + PTU dopo 2 giorni. </li></ol> 2. Inproiezione Micro-ago Preparazione <ol><li> Estrarre borosilicato capillare (OD 1,2 millimetri; ID 0,69 millimetri) in un micro-ago con un estrattore ago con le seguenti impostazioni (550 Calore, 0 Pull, 130 Velocity; 110 Time). NOTA: Le impostazioni variano da filamento a filamento per ottenere micro-aghi di forma simile (vedi Figura 1) e dovrà essere riadattato ogni volta che viene installato un nuovo filamento. </li><li> Riempire un micro-ago con 3 ml di 0,4 micron filtrata salina tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mm KH 2 PO 4; pH 7.4) con un 20 microlitri microloader pipetta tip. </li><li> Impostare il micro-ago su un supporto micropipetta su un micromanipolatore collegata ad un sistema di iniezione a pressione. Impostare la pressione di iniezione a 30 PSI e la durata dell&#39;impulso a 30 msec. </li><li> Utilizzando una piastra di Petri con acqua distillata, abbassare il micro-ago fino a 1/5 dell&#39;ago è nell&#39;acqua. Agganciare il micro-ago with pinzette sottili appena sotto il livello dell&#39;acqua. Portare il micro-ago fuori dall&#39;acqua e spingere il pedale più volte fino a visualizzare un bolo. </li><li> Misurare il diametro del bolo abbassando il micro-ago su un emocitometro strati con una goccia di tipo A olio per immersione. Regolare la durata dell&#39;impulso per ottenere il volume desiderato (vedi tabella 1). </li><li> Impostare la contropressione per il bolo di rimanere stabile in olio (abbassare la pressione se il bolo aumenta il volume e aumentare la contropressione se il volume di bolo diminuisce). Registrare la durata dell&#39;impulso per ogni micro-ago. </li><li> Rimuovere la PBS dal micro-ago aspirando usando un puntale microloader ed espellere la sinistra-over PBS ponendolo nuovamente l&#39;iniettore e lanciando l&#39;interruttore di impulso continuo. Prenotare ogni micro-ago. </li></ol> 3. Candida Preparazione <ol><li> Streak Candida albicans trasformate con codone ottimizzato dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRed da uno stock congelati (-80 ° C magazzino in 25% glicerolo) utilizzando un bastoncino di legno su una sterile destrosio lievito peptine (YPD) piastra di agar (10 g estratto / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio , 20 g / L di agar, autoclave e versò 25 ml in piastre di Petri) e incubare una notte a 30 ° C. </li><li> Scegliere una colonia utilizzando un bastoncino di legno sterile e inoculare 5 ml di liquido YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio, autoclavato e asetticamente aliquotato in 5 ml di 16 x 150 mm coltura vetro tubi). </li><li> Incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo a rulli a 60 rpm. </li><li> Raccogliere 1 ml di C. cultura albicans e il trasferimento in un 1,7 ml provetta da centrifuga sterile. </li><li> Centrifugare a 5.000 g per un paio di secondi. Svuotare il surnatante e aggiungere accuratamente 1 ml di PBS sterile, vortice. Ripetere due volte. </li><li> Contare le colonie usando un emocitometro diluendo 1 ml di brodo 1: 1000 in PBS sterile. </li></ol> 4. Iniettare Zebrafish inla vescica natatoria <ol><li> Riscaldare un piatto di iniezione (2% agarosio) per 30 min in un incubatore a 33 °. </li><li> Al tempo desiderato, rimuovere il 100 dei 150 ml di E3 + PTU dalla piastra Petri 15 centimetri contenente il pesce per iniettare utilizzando una pipetta 25 ml senza aspirare alcun zebrafish. </li><li> Anestetizzare 4 dpf zebrafish aggiungendo 2 ml di un / ml tamponato tricaine metano sulfonato magazzino 4 mg (TR) per i 50 ml supporti rimanenti (concentrazione finale di 200 mg / ml) e attendere 15 min. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, selezionare il pesce con una vescica natatoria gonfiato. Pesce può anche essere proiettato in quel momento per fenotipo omogeneo, come la distribuzione dei neutrofili in mpo: linea GFP utilizzando un epifluorescenza dissezione microscopio. </li><li> Diluire il C. albicans magazzino dalla sua concentrazione iniziale (fase 3.8) a 1,5 x 10 7 unità formanti colonia per ml (ufc / ml) in PBS. </li><li> Trasferire 30 zebrafish sul piatto di iniezione con un tubo di plastica di trasferimentotte e rimuovere il supporto in eccesso. </li><li> Utilizzando uno strumento di pesca-wire (0,012 pollici di diametro filo da pesca super-incollato in un capillare borosilicato), fare 3 linee di 10 pesci, tenendo il piatto iniezione verticale e orientare il pesce in verticale. </li><li> Togliere la carta in eccesso. </li><li> Vortice accuratamente il tubo con 1,5 x 10 7 CFU / ml C. albicans. </li><li> Riempire un micro-ago con 3 ml di C. albicans utilizzando una nuova punta microloader pipetta e impostare la durata dell&#39;impulso per l&#39;impostazione appropriata (vedere il punto 2.9). </li><li> Ruotare il piatto iniezione per formare un angolo di 20 ° tra il micro-ago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria (Figura 3A). </li><li> Premere il micro-ago nella vescica natatoria, assicurandosi che il foro dell&#39;ago sia nel lume, e premere il pedale una volta. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per ogni pesce e trasferire a un piatto di recupero (25 ml E3 + PTU) inondando il piatto con un E3d svuotamento nel piatto di recupero. </li><li> Trasferire altri 30 pesce al piatto iniezione. </li><li> Ripetere l&#39;iniezione con un nuovo micro-ago riempito con fondo in agitazione C. albicans. </li><li> Fine iniettando controllo PBS, se necessario, usando un piatto diversi di iniezione per evitare la contaminazione e versare in un piatto di recupero separato (passo 4.10). </li></ol> 5. Screening il pesce per desiderata Inoculum <ol><li> Preparare 40 ml di 0,4% bassofondente soluzione di agarosio (LMA) aggiungendo 160 mg di agarosio a basso punto di fusione 40 ml di E3, in ebollizione da microonde fino a completa dissoluzione e raffreddamento a 37 ° C. Aggiungere 400 ml di TR (concentrazione finale di 200 mg / ml), una volta raffreddato. </li><li> Dopo 30 min di recupero, anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 mL E3 + PTU, concentrazione finale 200 mg / ml). </li><li> Trasferimento 30 pesci (con il minor numero possibile di mezzi) a 2 ml di LMA in una barca di peso. </li><li> Aspirare singoli pesci con una pipetta di trasferimento e piatto il pesce con 1 goccia di LMA in una piastra di imaging a 96 pozzetti, utilizzando solo i 10 x 6 pozzi centrali. </li><li> Ripetere fino a quando tutti i pesci di schermo vengono caricati alla piastra di imaging. </li><li> Ai media solidificano a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Posizionare il pesce dalla loro parte, facendo in modo che siano a contatto con il fondo di vetro. </li><li> Usando l&#39;obiettivo 20X su un epifluorescenza / microscopio confocale invertita e il filtro appropriato, registrare il numero di C. cellule di lievito albicans in vescica natatoria di ogni pesce. </li><li> Selezionare il pesce con 15-25 cellule di lievito nella vescica natatoria (o inoculo desiderato), eutanasia non selezionata pesce (800 ug / ml di TR in E3) e ritornare pesci selezionato in un piatto profondo Petri con 50 ml di E3 + PTU by aggiungendo 3 gocce di E3 alla piastra di imaging pozzetti selezionati ed aspirando il pesce con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Incubare a 33 ° C per la durata desiderata. </li></ol> 6. Imaging the Fish post-selezione <ol><li> Al momento desiderato, eliminare 25 dei 50 ml di media E3 + PTU dalla capsula di Petri profondo contenente il pesce di immagine. </li><li> Anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 ml E3 + PTU rimanente, la concentrazione finale di 200 mg / ml). </li><li> Piatto il pesce in un piatto di imaging 96-bene e la posizione in modo appropriato (passi 5,3-5,7). </li><li> Immagine di scansione microscopia confocale utilizzando i laser appropriati e filtri di emissione. Prima concentrarsi sul pesce con l&#39;obiettivo 4X in contrasto interferenziale differenziale (DIC) e di acquisire immagini della regione di interesse utilizzando l&#39;obiettivo 20X con i laser confocale in modalità di scansione con 2 velocità msec / pixel e 1024 x 600 pixel aspect ratio. Acquisire Z-stack con 1 micron dimensione del passo, applicando modalità filtro Kalman di 3 fotogrammi. </li><li> Ritorno a un piatto fondo di Petri con 50 ml E3 + PTU o in individuapozzi l (piatto 24 pozzetti cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubare a 33 ° C. </li></ol> 7. Dissecting la vescica natatoria <ol><li> Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto. </li><li> Preparare una LMA 2% (passo 5,3 con 160 mg di bassa fusione agarosio in 8 ml di E3). </li><li> Al momento desiderato, anestetizzare il pesce (fase 5.2). </li><li> Trasferire 10 pesci in una provetta 1,7 ml centrifuga con 1 ml di E3 e euthanize aggiungendo 200 ml di 4 mg / ml Tricaine (concentrazione finale 800 mg / ml) al tubo da centrifuga e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un vetrino di imaging ponendo 4 gocce di grasso per vuoto in un quadrato, distanti 1 cm su un MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2). </li><li> Mettere 2 gocce di 2% LMA nel centro della piazza. </li><li> Posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore ha smesso di battere, rimuovere l&#39;acqua in eccesso. </li><li&gt; con una pinzetta belle sezionare il vescica natatoria mantenendo la testa in una posizione fissa con le pinze sinistra e tirando giù l&#39;intestino anteriore con le pinzette destra (Figura 4A). </li><li> Sollevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico con le pinzette sinistra, separandolo dal tratto digerente, e posizionarlo al centro della LMA 2% prima che solidifica. </li><li> Inserire una copertura antiscivolo (18 x 18 mm) sulla parte superiore del vetrino imaging e spingerla fino a toccare il grasso per vuoto, nonche la LMA (Figura 2). </li><li> Immagine entro 10 minuti di dissezione, come descritto al punto 6.4. Ripetere il passaggio 7,7-7,11 con gli altri pesci. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Anticipi e limitazioni della microiniezione modello di malattia vescica natatoria Il modello qui presentato è un&#39;estensione del modello di immersione mucosa candidosi descritto in Gratacap et al (2013).; aggiunge i vantaggi di un tempo un&#39;infezione controllata, una dose un&#39;infezione altamente riproducibile, e quindi una maggiore efficienza. Dimostriamo qui nuovi metodi che permettono non invasivo documentazione temporale delle dinamiche di infezione in modo molto dettaglia...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:259px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deep Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wooden Dowels</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10805-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Melt Agarose</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillary</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPPI-3 Injection system</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back Pressure Unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foot Switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x microscope objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSApo 20x/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roller drum</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>TC-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>60825-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4534-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4532-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH0246-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4520-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Children clay (Play-Doh)</td>
			<td>Hasbro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>VW6276-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer (Hausser scientific)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type A immersion oil</td>
			<td>Blue Marble Products</td>
			<td>51935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>14216-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (Lonza)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fishing wire</td>
			<td>Stren</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well imaging plate (Sensoplate)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease (Dow Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>59344-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microslide (25 x 75 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48300-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48366-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol (EMD chemicals)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well culture dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weight boats (8.9 cm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89106-766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

Difesa precoce contro i patogeni delle mucose consiste sia una barriera epiteliale e cellule immunitarie innate. La immunocompetency di entrambi, e la loro intercomunicazione, sono di primaria importanza per la protezione contro le infezioni. Le interazioni di cellule immunitarie innate epiteliali e con un agente patogeno è meglio studiati in vivo, in cui il comportamento complesso si sviluppa nel tempo e nello spazio. Tuttavia, i modelli esistenti non consentono un facile spazio-temporale delle immagini della battaglia con i patogeni a livello della mucosa. Il modello sviluppato qui crea un&#39;infezione della mucosa con iniezione diretta del patogeno fungino, Candida albicans, nella vescica natatoria di zebrafish giovanile. L&#39;infezione risultante permette imaging ad alta risoluzione di comportamenti epiteliale e innata cellule immunitarie durante lo sviluppo della malattia della mucosa. La versatilità di questo metodo permette di interrogatorio di accoglienza per sondare la sequenza riportata di eventi immunitari che portano a phreclutamento agocyte e di esaminare il ruolo di particolari tipi di cellule e percorsi molecolari nella protezione. Inoltre, il comportamento del patogeno come funzione di attacco immunitario può essere ripreso simultaneamente utilizzando proteine ​​esprimono fluorescente C. albicans. Risoluzione spaziale Aumento della interazione ospite-patogeno è possibile anche utilizzando la tecnica rapida vescica natatoria dissezione descritta. Il modello di infezione della mucosa descritto qui è semplice e altamente riproducibile, che lo rende uno strumento prezioso per lo studio della mucosa candidosi. Questo sistema può anche essere sostanzialmente traducibile ad altri patogeni mucosali come microbi micobatteri, batteriche o virali che normalmente infettano attraverso superfici epiteliali.

Microiniezione nella vescica natatoria posteriori Il metodo sperimentale qui presentato descrive l&#39;iniezione di una dose costante di C. cellule di lievito albicans nella vescica natatoria di 4 dpf zebrafish. Lavoro precedente con il modello di immersione suggerisce che la risposta immunitaria vescica natatoria a C. albicans è simile a mammiferi mucosa candidosi 32. Qui mostriamo un metodo di infezione modificato che è più semplice, riproducibile e ra...

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Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.