Les auteurs remercient le Dr Le Trinh et le Dr Tobin pour fournir généreusement l&#39;α-caténine: ligne de poissons de citrine et Bill Jackman pour nous permettre de faire le tournage dans son laboratoire. Les auteurs reconnaissent les sources de financement Instituts nationaux de la santé (subventions 5P20RR016463, 8P20GM103423 et R15AI094406) et l&#39;USDA (Projet # ME0-H-1-00517-13). Ce manuscrit est publié en tant que principal Agriculture et foresterie Expérience publication station numéro 3371.

REMARQUE: Tous les protocoles et les expériences de soins de poisson zèbre ont été effectuées conformément aux directives du NIH sous institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC) A2012-11-03 protocole. 1. poisson zèbre élevage pour quatre jours après la fécondation <ol><li> Recueillir AB poisson zèbre, ou d&#39;autres lignées transgéniques, dans le premier poste de fertilisation 3 heures, comme montré dans un autre 34 vidéo. </li><li> Incuber 120 oeufs dans un 15 cm boîtes de Pétri contenant 150 ml de milieu E3 (mM de NaCl 5; KCl mM 0,17; 0,33 mM de CaCl2; 0,33 mM de MgCl2, 2 mM d&#39;HEPES, pH 6,8) avec du bleu de méthylène (0,3 ug / ml final concentration) dans un incubateur à 33 ° avec la lumière 12/12 / photopériode sombre. </li><li> Remplacez le support après 6 h avec E3 + PTU (1-phényl-2-thiourée, 10 pg / ml de concentration finale) et retirer les oeufs morts. </li><li> Incuber pendant 4 jours à 33 ° C, l&#39;échange avec les médias frais E3 + PTU après deux jours. </li></ol> 2. Dansprojection Micro-aiguille Préparation <ol><li> Tirez borosilicate capillaire (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) dans un micro-aiguille à l&#39;aide d&#39;un extracteur de l&#39;aiguille avec les paramètres suivants (550 chaleur; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time). REMARQUE: Les paramètres varient d&#39;filament filament pour obtenir des micro-aiguilles de forme similaire (voir la figure 1) et devra être réajusté chaque fois qu&#39;un nouveau filament est installé. </li><li> Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de 0,4 um filtré la solution saline de tampon phosphate (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4; pH 7,4) en utilisant un microloader pipette 20 ul pointe. </li><li> Mettre en place la micro-aiguille sur un support de micropipette sur un micromanipulateur relié à un système d&#39;injection sous pression. Régler la pression d&#39;injection à 30 PSI et la durée d&#39;impulsion à 30 ms. </li><li> Utilisation d&#39;une boîte de Pétri avec de l&#39;eau distillée, abaisser la micro-aiguille jusqu&#39;à 1/5 de l&#39;aiguille est dans l&#39;eau. Clip de la micro-aiguille with pinces fines juste en dessous du niveau de l&#39;eau. Apportez la micro-aiguille hors de l&#39;eau et pousser la pédale à plusieurs reprises jusqu&#39;à ce qu&#39;un bolus apparaît. </li><li> Mesurer le diamètre du bol par l&#39;abaissement de la micro-aiguille sur un hémocytomètre en couches avec une goutte de type A de l&#39;huile d&#39;immersion. Réglez la durée d&#39;impulsion pour obtenir le volume souhaité (voir tableau 1). </li><li> Régler la contre-pression pour le bolus de rester stable dans l&#39;huile (abaisser la pression si le bolus augmente le volume et augmenter la contre-pression si le volume de bolus diminue). Enregistrer la durée d&#39;impulsion pour chaque micro-aiguille. </li><li> Retirez le PBS de la micro-aiguille en aspirant à l&#39;aide d&#39;une pipette de microloader et d&#39;expulser les restes de PBS en la replaçant sur l&#39;injecteur et appuyer sur l&#39;interrupteur d&#39;impulsion continue. Réservez chaque micro-aiguille. </li></ol> 3. Préparation Candida <ol><li> Streak Candida albicans transformées avec codon optimisé dTomato, GFP, BFP, EOS ou en Extrême-Rouge à partir d&#39;un stock congelé (-80 ° C stock de 25% de glycérol) en utilisant une cheville en bois stérile sur un dextrose levure Peptine (YPD) plaque de gélose (10 g d&#39;extrait / L de levure, 20 g / L peptone, 20 g / L de dextrose , / L agar 20 g; autoclave et versé 25 ml dans des boîtes de Pétri) et incuber une nuit à 30 ° C. </li><li> Choisir une colonie en utilisant une cheville en bois stérile et inoculer à 5 ml de liquide YPD (10 g d&#39;extrait / l de levure, 20 g / L de peptone, 20 g / l de dextrose, autoclavé et aseptique aliquoté dans 5 ml de culture en verre de 16 x 150 mm tubes). </li><li> Incuber pendant une nuit à 30 ° C dans un rouleau tambour à 60 tours par minute. </li><li> Prélever 1 ml de C. culture albicans et le transfert dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 ml. </li><li> Centrifuger à 5000 g pendant quelques secondes. Vider le surnageant et ajouter 1 ml de PBS stérile, vortex soigneusement. Répéter deux fois. </li><li> Compter les colonies en utilisant un hémocytomètre en diluant le 1 ml stock 1: 1000 dans du PBS stérile. </li></ol> 4. Injection de poisson zèbre dansla vessie natatoire <ol><li> Réchauffer un plat d&#39;injection (2% d&#39;agarose) pendant 30 min dans un incubateur à 33 °. </li><li> Au moment désiré, retirer 100 des 150 ml de l&#39;E3 + PTU du plat 15 cm de Pétri contenant le poisson d&#39;injecter en utilisant une pipette de 25 ml, sans aspirer toute poisson zèbre. </li><li> Anesthésier 4 dpf poisson zèbre en ajoutant 2 ml d&#39;un 4 mg / ml tamponnée tricaïne méthane sulfonate stock (TR) pour les 50 ml restants médias (concentration finale de 200 pg / ml) et attendre 15 min. </li><li> Sous un microscope de dissection, choisir des poissons avec une vessie natatoire gonflée. Le poisson peut également être projeté à ce moment pour phénotype homogène, comme la distribution des neutrophiles dans mpo: ligne GFP en utilisant un microscope à dissection épifluorescence. </li><li> Diluer le C. albicans stock à partir de sa concentration d&#39;origine (étape 3.8) à 1,5 x 10 7 unités formatrices de colonies par ml (cfu / ml) dans du PBS formage. </li><li> Transférer 30 poisson zèbre sur le plat d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;un tuyau de transfert en plastiqueTTE et retirez l&#39;excès médias. </li><li> En utilisant un outil de pêche fil (0,012 pouce la ligne de pêche de diamètre super-collés dans un capillaire de borosilicate), faire 3 lignes de 10 poissons, en tenant le plat d&#39;injection verticale et orienter le poisson verticalement. </li><li> Retirer l&#39;excès médias. </li><li> Bien agiter au vortex le tube avec 1,5 x 10 7 ufc / ml C. albicans. </li><li> Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de C. albicans en utilisant une nouvelle pointe de pipette microloader et définir la durée d&#39;impulsion sur le réglage approprié (voir l&#39;étape 2.9). </li><li> Tourner le plat d&#39;injection pour faire un angle de 20 ° entre la micro-aiguille et la tête du poisson, visant vers l&#39;arrière de la vessie natatoire (figure 3A). </li><li> Poussez la micro-aiguille dans la vessie natatoire, assurant que le trou de l&#39;aiguille est dans la lumière, et appuyez sur la pédale fois. </li><li> Répétez l&#39;opération pour chaque poisson et de les transférer à un bac de récupération (25 ml E3 + PTU) en inondant le plat avec un E3d vider dans le bac de récupération. </li><li> Transbordement, un autre 30 poissons à l&#39;antenne d&#39;injection. </li><li> Répéter l&#39;injection avec une nouvelle micro-aiguille remplie de fond au vortex C. albicans. </li><li> Finition en injectant le contrôle PBS, si nécessaire, en utilisant une boîte d&#39;injection différent pour éviter la contamination et les transférer à un plat de récupération séparée (étape 4.10). </li></ol> 5. Dépistage du poisson pour inoculum désiré <ol><li> Préparer 40 ml de 0,4% bas point de fusion solution d&#39;agarose (LMA) en ajoutant 160 mg d&#39;agarose à bas point de fusion 40 ml de E3, l&#39;ébullition par micro-ondes jusqu&#39;à dissolution et refroidissement à 37 ° C. Ajouter 400 ul de TR (concentration finale 200 ug / ml) une fois refroidi. </li><li> Après 30 min de récupération, anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU, concentration finale de 200 pg / ml). </li><li> Transfert 30 poissons (avec aussi peu que possible les médias) à 2 ml de LMA dans un bateau de poids. </li><li> Aspirer chaque poisson avec une pipette de transfert et plaque le poisson avec une gouttes de LMA dans une plaque d&#39;imagerie 96 puits, en utilisant seulement les 10 x 6 puits central. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que tous les poissons à l&#39;écran sont chargés à la plaque d&#39;imagerie. </li><li> Que les médias se solidifient à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Placez le poisson de leur côté, en se assurant qu&#39;ils sont en contact avec le fond de verre. </li><li> En utilisant l&#39;objectif 20X sur une épifluorescence / microscope confocal inversé et le filtre approprié, enregistrer le nombre de C. des cellules de levure dans la vessie natatoire albicans de chaque poisson. </li><li> Sélectionnez le poisson avec de 15 à 25 cellules de levure dans la vessie natatoire (ou inoculum désiré), euthanasier non sélectionnée poissons (800 ug / ml de TR en E3) et revenir poissons sélectionné pour une boîte de Petri profonde avec 50 ml de l&#39;E3 + PTU par ajoutant 3 gouttes de E3 à la plaque de formation d&#39;image sélectionnés puits et en aspirant le poisson avec une pipette de transfert en plastique. </li><li> Incuber à 33 ° C pendant la durée souhaitée. </li></ol> 6. Imagerie du poisson post-dépistage <ol><li> Au moment désiré, retirer 25 des 50 ml de milieu E3 + PTU du plat profond Petri contenant le poisson à l&#39;image. </li><li> Anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU reste, concentration finale de 200 pg / ml). </li><li> Plate le poisson dans une plaque d&#39;imagerie de 96 puits et la position appropriée (étapes 5.3 à 5.7). </li><li> Image par microscopie confocale en utilisant les lasers appropriés et les filtres d&#39;émission. Première accent sur le poisson en utilisant l&#39;objectif 4X vertu contraste interférentiel différentiel (DIC) et acquérir des images de la région d&#39;intérêt en utilisant l&#39;objectif 20X avec les lasers confocale en mode de balayage avec 2 vitesses ps / pixel et 1024 x 600 ratio d&#39;aspect de pixel. Acquérir Z-piles avec une taille de pas um, en appliquant le mode de filtre de Kalman de 3 images. </li><li> Retour à une boîte de Petri profonde avec 50 ml E3 + PTU ou en individual puits (plat de 24 puits de culture, 3 ml E3 + PTU) et incuber à 33 ° C. </li></ol> 7. Dissection de la vessie natatoire <ol><li> Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé. </li><li> Préparer un LMA 2% (étape 5.3 avec 160 mg de bas point de fusion agarose dans 8 ml de l&#39;E3). </li><li> À l&#39;heure souhaitée, anesthésier le poisson (étape 5.2). </li><li> 10 Transfert des poissons dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml avec 1 ml de E3 et euthanasie par addition de 200 ul de 4 mg / ml de tricaïne (concentration finale de 800 ug / ml) dans le tube de centrifugation et en incubant pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Préparer une lame de verre de formation d&#39;image en plaçant quatre gouttes de graisse à vide dans un carré, 1 cm de distance sur une microlame (75 x 25 mm, figure 2). </li><li> Placez deux gouttes de 2% LMA dans le milieu de la place. </li><li> Placez un poisson sur une lame de verre séparée sous un microscope de dissection et vérifiez que le cœur a cessé de battre, retirez l&#39;excès d&#39;eau. </li><li&gt; en utilisant des pincettes fines disséquer la vessie natatoire en maintenant la tête dans une position fixe avec les pinces gauche et tirant vers le bas l&#39;intestin antérieur avec les bonnes pincettes (figure 4A). </li><li> Ramassez la vessie natatoire par le conduit pneumatique avec les pincettes gauche, le séparant du tube digestif, et le placer au centre de la LMA 2% avant qu&#39;il se solidifie. </li><li> Placez une lamelle (18 x 18 mm) sur le dessus de la lame de verre d&#39;imagerie et poussez-le jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la graisse à vide ainsi que le LMA (Figure 2). </li><li> Image à l&#39;intérieur 10 min de la dissection comme décrit dans l&#39;étape 6.4. Répétez l&#39;étape 7.7 à 7.11 avec les autres poissons. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les progrès et les limites du modèle de la maladie de la micro-injection de vessie natatoire Le modèle présenté ici est une extension du modèle d&#39;immersion de la candidose des muqueuses décrit dans Gratacap et al (2013).; il ajoute les avantages d&#39;un temps d&#39;infection contrôlée, une dose d&#39;infection hautement reproductibles, et donc une meilleure efficacité. Nous démontrons ici de nouvelles méthodes qui permettent la documentation temporelle non-invasive de ...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:259px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deep Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wooden Dowels</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10805-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Melt Agarose</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillary</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPPI-3 Injection system</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back Pressure Unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foot Switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x microscope objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSApo 20x/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roller drum</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>TC-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>60825-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4534-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4532-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH0246-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4520-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Children clay (Play-Doh)</td>
			<td>Hasbro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>VW6276-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer (Hausser scientific)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type A immersion oil</td>
			<td>Blue Marble Products</td>
			<td>51935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>14216-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (Lonza)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fishing wire</td>
			<td>Stren</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well imaging plate (Sensoplate)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease (Dow Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>59344-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microslide (25 x 75 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48300-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48366-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol (EMD chemicals)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well culture dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weight boats (8.9 cm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89106-766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

La défense précoce contre les agents pathogènes des muqueuses consiste à la fois une barrière épithéliale et les cellules immunitaires innées. Le immunocompétence des deux, et de leur intercommunication, sont primordiaux pour la protection contre les infections. Les interactions de cellules immunitaires innées et épithéliales avec un agent pathogène sont les mieux étudiés in vivo, où le comportement complexe se déroule dans le temps et l&#39;espace. Cependant, les modèles existants ne permettent pas facile imagerie spatio-temporelle de la bataille avec des agents pathogènes au niveau de la muqueuse. Le modèle développé ici crée une infection de la muqueuse par injection directe de l&#39;agent pathogène fongique, Candida albicans, dans la vessie natatoire du poisson zèbre juvénile. L&#39;infection résultant permet imagerie à haute résolution du comportement des cellules épithéliales et immunitaire innée à travers le développement de la maladie des muqueuses. La polyvalence de cette méthode permet pour interrogatoire de l&#39;hôte à sonder la séquence détaillée des événements immunitaire conduisant à phagocyte recrutement et d&#39;examiner les rôles de types cellulaires particuliers et voies moléculaires dans la protection. De plus, le comportement de l&#39;agent pathogène en fonction de l&#39;attaque immunitaire peut imager simultanément en utilisant la protéine fluorescente exprimant C. albicans. Résolution spatiale accrue de l&#39;interaction hôte-pathogène est également possible en utilisant la technique de dissection vessie natatoire rapide décrite. Le modèle d&#39;infection de la muqueuse décrite ici est simple et hautement reproductible, ce qui en fait un outil précieux pour l&#39;étude de la candidose buccale. Ce système peut également être largement traduisible à d&#39;autres pathogènes des muqueuses comme les microbes mycobactériennes, bactériennes ou virales qui infectent normalement à travers des surfaces épithéliales.

La micro-injection dans la vessie natatoire postérieure La méthode expérimentale présentée ici décrit l&#39;injection d&#39;une dose constante de C. des cellules de levure albicans dans la vessie natatoire des 4 dpf poisson zèbre. Des travaux antérieurs avec le modèle d&#39;immersion suggère que la réponse immunitaire de la vessie natatoire à C. albicans est similaire à mammifère candidose des muqueuses 32. Ici, nous démontrons une méthode d...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection at JoVE.com

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modélisation des muqueuses candidose larves de poisson zèbre par injection vessie natatoire

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K vues.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.