Die Autoren danken Dr. Le Trinh und Dr. Tobin für die großzügige Bereitstellung der α-Catenin: Citrin Angelschnur und Bill Jackman für die Erlaubnis, die Dreharbeiten in seinem Labor zu tun. Die Autoren erkennen die Finanzierungsquellen National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 und R15AI094406) und USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Dieses Manuskript ist als Haupt Land- und Forstwirtschaft Experiment Station Veröffentlichungsnummer 3371 veröffentlicht.

HINWEIS: Alle Zebrafisch Pflegeprotokolle und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien unter Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Protokoll A2012-11-03 geführt. 1. Zebrafisch Aufzucht bis 4 Tage nach der Befruchtung <ol><li> Sammeln AB Zebrafisch oder andere transgene Linien, innerhalb der ersten 3 Stunden nach der Befruchtung, wie in einem anderen Video 34 gezeigt. </li><li> Inkubieren 120 Eier in eine 15 cm Petrischalen mit 150 ml E3 Medien (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES; pH 6,8) mit Methylenblau (0,3 ug / ml final Konzentration) in einem 33 ° C Inkubator mit 12/12 Hell / Dunkel-Photoperiode. </li><li> Ersetzen Sie die Medien nach 6 Stunden mit E3 + PTU (1-Phenyl-2-thioharnstoff, 10 ug / ml Endkonzentration) und entfernen Sie die toten Eiern. </li><li> Inkubieren für 4 Tage bei 33 ° C, die Medien mit frischen E3 + PTU Austausch nach 2 Tagen. </li></ol> 2.Projektions Micro-Nadel Vorbereitung <ol><li> Ziehen Borosilikat Kapillare (OD 1,2 mm; 0,69 mm ID) in eine Mikronadel mit einem Nadelzieher mit den folgenden Einstellungen (550 Wärme; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time). HINWEIS: Die Einstellungen werden vom Filament variieren Filament ähnlich geformte Mikronadeln zu erhalten (siehe Abbildung 1) und muss neu eingestellt werden, wenn ein neues Filament eingebaut ist. </li><li> Füllen einer Mikronadel mit 3 &amp; mgr; l von 0,4 &amp; mgr; m-filtriert Phosphatpuffersalzlösung (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) unter Verwendung einer 20 ul-Pipette Microloader Tipp. </li><li> Richten Sie das Mikro-Nadel auf einer Mikropipette Halter auf einem Mikromanipulator mit einem Druckinjektionssystem befestigt. Stellen Sie den Einspritzdruck auf 30 PSI und der Impulsdauer bei 30 ms. </li><li> Mit einer Petrischale mit destilliertem Wasser, senken Sie die Mikronadel, bis 1/5 der Nadel in das Wasser. Clip der Mikronadel with feinen Pinzette gerade unter dem Wasserspiegel. Bringen Sie die Mikronadel aus dem Wasser, und drücken Sie das Pedal mehrmals, bis ein Bolus erscheint. </li><li> Den Durchmesser des Bolus durch Absenken der Mikronadel auf einem Hämocytometer mit einem Tropfen des Typs A Sionsöl geschichtet. Stellen Sie die Impulsdauer, um die gewünschte Lautstärke zu erhalten (siehe Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie den Gegendruck für den Bolus in Öl stabil bleiben (senken Sie den Druck, wenn der Bolus-Volumen erhöht und erhöht den Gegendruck, wenn der Bolus-Volumen nimmt ab). Notieren Sie sich die Pulsdauer für jede Mikronadel. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Mikronadel durch Absaugen es mit Hilfe eines Microloader Pipettenspitze und vertreiben die übrig gebliebenen PBS, indem Sie es wieder auf dem Injektor und spiegeln die kontinuierliche Impulsschalter. Reservieren Sie jede Mikronadel. </li></ol> 3. Candida Vorbereitung <ol><li> Streak Candida albicans mit codonoptimierten dTomato, GFP, BFP, EOS oder Far verwandeltRot aus einem gefrorenen Lager (-80 ° C lagerfähig in 25% Glycerin) mit einer sterilen Holzstab auf eine Hefe peptine Dextrose (YPD) Agar-Platte (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose , 20 g / l Agar, autoklaviert und goss 25 ml in Petrischalen) und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Wählen Sie eine Kolonie mit einer sterilen Holzdübel und impfen zu 5 ml YPD-Flüssigkeit (10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose, autoklaviert und aseptisch in 5 ml in 16 x 150 mm Glaskultur aliquotiert Röhren). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 30 ° C in einer Rollentrommel bei 60 Upm. </li><li> Sammeln Sie 1 ml C albicans-Kultur und den Transfer in ein 1,7 ml steriles Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 5.000 xg für ein paar Sekunden. Leeren Sie den Überstand und 1 ml sterilem PBS, gründlich vortexen. Wiederholen Sie dies zweimal. </li><li> Zählen Sie die Kolonien mit einer Zählkammer durch Verdünnung der 1 ml Lager 1: 1000 in sterilem PBS. </li></ol> 4. Einspritzen in Zebrafischdie Schwimmblase <ol><li> Erwärmen eines Injektionsform (2% Agarose) für 30 min in einem 33 ° C Inkubator. </li><li> Zum gewünschten Zeitpunkt, zu entfernen 100 der 150 ml E3 + PTU von der 15 cm Petrischale die Fische, die zum Einspritzen mit einer 25 ml Pipette ohne Absaugen keine Zebrafisch. </li><li> Anesthetize 4 dpf Zebrafisch durch Zugabe von 2 ml einer 4 mg / ml gepufferte Tricaine Methansulfonat Lager (TR), um die verbleibenden die 50 ml Medium (Endkonzentration 200 ug / ml), und warten Sie 15 Minuten. </li><li> Unter einem Binokular, wählen Sie Fisch mit einem aufgeblasenen Schwimmblase. Fisch kann zu diesem Zeitpunkt auch für homogene Phänotyp gescreent werden, wie beispielsweise neutrophile Verteilung in MPO: GFP-Leitung mit Epifluoreszenz Präpariermikroskop. </li><li> Verdünnen Sie die C albicans Lager aus seiner ursprünglichen Konzentration (Schritt 3.8) in 1,5 x 10 7 koloniebildenden Einheiten pro ml (cfu / ml) in PBS. </li><li> Übertragen Sie 30 Zebrafisch auf die Injektions Gericht mit einem Kunststoffüberführungsrohrtte und entfernen Sie das überschüssige Medien. </li><li> Mit einem Fischerdraht-Werkzeug (in ein Borosilikatglas Kapillaren 0,012 Zoll Durchmesser Angelschnur super geklebt), stellen Sie 3 Zeilen 10 Fische, indem Sie die Injektions Teller vertikal und orientieren die Fische vertikal. </li><li> Entfernen Sie die überzähligen Medien. </li><li> Das Röhrchen gründlich vortexen mit 1,5 × 10 7 cfu / ml C. albicans. </li><li> Füllen einer Mikronadel mit 3 ul C. albicans mit einem neuen Microloader Pipettenspitze und stellen Sie die Pulsdauer auf die entsprechende Einstellung (siehe Schritt 2.9). </li><li> Drehen Sie den Einspritz Gericht, um einen Winkel von 20 ° zwischen der Mikro-Nadel und der Kopf des Fisches zu machen, mit dem Ziel in Richtung der Rückseite des Schwimmblase (3A). </li><li> Drücken Sie den Mikro-Nadel in die Schwimmblase, um sicherzustellen, die Bohrung der Nadel in das Lumen, und drücken Sie das Pedal einmal. </li><li> Wiederholen Sie für jeden Fisch und übertragen zu einer Erholung Schale (25 ml E3 + PTU) durch Fluten der Schale mit einem E3d Entleerung in die stabile Schale. </li><li> Übertragen Sie weitere 30 Fische an der Einspritz Gericht. </li><li> Wiederholen Sie die Injektion mit einer neuen Mikro-Nadel mit gut gefüllten verwirbelt C. albicans. </li><li> Fertig durch Einspritzen der PBS-Kontrolle, wenn nötig, mit einem anderen Gericht Injektion zur Vermeidung von Verunreinigungen und Transfer zu einem separaten Recovery Gericht (Schritt 4.10). </li></ol> 5. Screening der Fisch zum Wunsch Inokulum <ol><li> Vorbereitung 40 ml 0,4% niedrigschmelz Agaroselösung (LMA) durch Zusatz von 160 mg des niedrigen Schmelz Agarose zu 40 ml E3, siedet durch Mikrowellenbehandlung bis zur Auflösung und Abkühlen auf 37 ° C. Fügen Sie 400 ul TR (Endkonzentration 200 ug / ml) nach dem Abkühlen. </li><li> Nach 30 Minuten Erholung, betäuben die Fische, wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU, Endkonzentration 200 ug / ml). </li><li> Übertragungs 30 Fisch (mit möglichst wenig Medien wie möglich), um 2 ml LMA in einem Gewichts Boot. </li><li> Saugen Sie einzelne Fische mit einer Transferpipette und Platte den Fisch mit 1 Tropfen LMA in einen 96-Loch-Bildplatte, nur mit den 10 x 6 zentralen Brunnen. </li><li> Wiederholen, bis alle Fische zu Bildschirm werden der Bildplatte geladen. </li><li> Lassen Sie das Medium erstarren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Positionieren Sie den Fisch auf ihrer Seite, dafür, dass sie in Kontakt mit dem Glasboden gibt. </li><li> Mit dem 20x-Objektiv auf einem umgekehrten Epifluoreszenz / Konfokalmikroskop und der entsprechenden Filter, notieren Sie die Anzahl der C albicans Hefe-Zellen in jeder Fischschwimmblase. </li><li> Wählen Sie den Fisch mit 15-25 Hefezellen in der Schwimmblase (oder gewünschte Inokulum) euthanize nicht ausgewählte Fisch (800 ug / ml TR in E3) und zurück gewählt Fische einer tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU durch Zugabe von 3 Tropfen E3 auf die Bildplatte ausgewählt Brunnen und Absaugen der Fisch mit einer Plastiktransferpipette. </li><li> Inkubiere bei 33 ° C für die gewünschte Dauer. </li></ol> 6. Visualisierung der Fisch-Post-Screening <ol><li> Zu der gewünschten Zeit, entfernen Sie 25 der 50 ml E3 + PTU Medien aus dem tiefen Petrischale die Fische Bild enthält. </li><li> Betäuben des Fisches wie beschrieben (Schritt 4.3 mit nur 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU verbleibenden, Endkonzentration 200 ug / ml). </li><li> Platte der Fische in eine 96-Loch-Speicherfolie und Position entsprechend (Schritte von 5,3 bis 5,7). </li><li> Bild durch Scannen der konfokalen Mikroskopie mit den entsprechenden Laser und Emissionsfilter. Zuerst auf den Fisch im 4x Ziel unter differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und Bilder der interessierenden Region unter Verwendung der 20X-Objektiv mit der konfokalen Laser im Scanning-Modus mit 2 &amp; mgr; s / Pixel Geschwindigkeit und 1024 x 600 Pixel-Seitenverhältnis zu erwerben. Erwerben Sie Z-Stapel mit 1 &amp; mgr; m-Schrittweite, die Anwendung Kalman-Filter-Modus von 3 Bildern. </li><li> Die Rückkehr zu einem tiefen Petrischale mit 50 ml E3 + PTU oder in individual Vertiefungen (24-well-Kulturschale, 3 ml E3 + PTU) und Inkubation bei 33 ° C. </li></ol> 7. Grundlagen zur Schwimmblase <ol><li> Füllen Sie einen 10-ml-Spritze mit Hochvakuumfett. </li><li> Vorbereiten einer 2% LMA (Schritt 5.3 mit 160 mg des niedrig schmelzender Agarose in 8 ml E3). </li><li> Zu der gewünschten Zeit, betäuben die Fische (Schritt 5.2). </li><li> Übertragungs 10 Fische einer 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml E3 und euthanize durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l 4 mg / ml Tricaine (Endkonzentration 800 ug / ml) in das Zentrifugenröhrchen und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie eine Imaging-Objektträger, indem Sie 4 Tropfen Vakuumfett in einem Quadrat, 1 cm voneinander entfernt auf einem Mikroobjekt (75 x 25 mm, Abbildung 2). </li><li> Platzieren Sie 2 Tropfen 2% LMA in der Mitte des Platzes. </li><li> Setzen Sie einen Fisch auf einem separaten Glasobjektträger unter einem Binokular und überprüfen, ob das Herz hat aufgehört zu schlagen, entfernen Sie das überschüssige Wasser. </li><li&gt; Mit einer feinen Pinzette sezieren die Schwimmblase durch die Aufrechterhaltung der Kopf in einer festen Position mit dem linken Pinzette und Herunterziehen des vorderen Darm mit den richtigen Pinzette (4A). </li><li> Nehmen Sie den Schwimmblase durch den pneumatischen Kanal mit den linken Pinzette und trennt sie vom Verdauungstrakt, und legen Sie sie in der Mitte der 2% LMA, bevor es erstarrt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas (18 x 18 mm) an der Oberseite des bildgebenden Glasplatte und schieben Sie es, bis es die Vakuumfett sowie die LMA (Abbildung 2) berührt. </li><li> Bild innerhalb von 10 Minuten der Dissektion, wie in Schritt 6.4 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 7,7-7,11 mit den anderen Fischen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Fortschritte und Grenzen der Schwimmblase Mikroinjektion Krankheitsmodell Das hier vorgestellte Modell ist eine Erweiterung des in Gratacap et al Schleimhaut Candidiasis Tauch Modell (2013). es fügt die Vorteile eines kontrollierten Infektion Zeit eine hoch reproduzierbare Infektionsdosis und damit eine verbesserte Effizienz. Wir zeigen hier neue Methoden, die nicht-invasive zeitliche Dokumentation der Infektionsdynamik im Detail als auch eine höhere Auflösung Ex-vivo-B...

Mucosal infections can lead to life threatening bloodstream infections due to the damage of the epithelial barrier, which allows pathogens access to the systemic environment1,2. In addition, mucosal infections can also cause significant immunopathology even when contained externally3-5. The commensal unicellular fungus Candida albicans is present in the majority of the population in the oral cavity and other mucosal sites6-9. Although normally contained by innate and adaptive immune responses, innate immune defects and medical interventions can lead to severe mucosal candidiasis. The assault on the epithelial barrier results in an increased risk of life threatening disseminated disease as well as immunopathology, as in the case of vulvo-vaginal candidiasis, additionally C. albicans colonization has been linked with lung immune homeostasis10,11. Disseminated candidiasis is now the fourth most common bloodstream infection in intensive care units12 and mortality as high as 40% makes it a major concern. Due to the increase in immunomodulatory treatments for patients with autoimmune diseases, cancer or organ transplants, it is imperative to understand the interaction between this pathogen and the mucosal immune compartment.
The majority of cell biological advances regarding C. albicans-cell interactions at the mucosal level come from in vitro13-15 and murine models16-18. Both these approaches have distinct advantages, but the ability to image live cells at high resolution in an intact host has limited the temporal and spatial characterization of the infection. For these studies, there is the need for an in vivo model where the interaction of pathogen, innate immune and epithelial cells can be visualized in an intact vertebrate host.
The zebrafish has emerged as an invaluable tool for the understanding of human disease, mainly due to its transparency and amenability to genetic manipulation. Cell and organ development have been imaged in exquisite detail, which has led to the description of novel immune cell behaviors, such as T cell behavior in the developing thymus19 or the battle between intracellular mycobacteria and phagocytes20-22. Recent work has described intestinal microbe-host interactions in zebrafish and shown that microbial colonization of the intestinal tract affects host intestinal physiology and resistance to other infections23,24. Furthermore, infection through the gut epithelium has been described for several pathogens.
In contrast to the intestinal tract, the swimbladder represents a more isolated and complementary mucosal model. This organ is an extension of the developing gut tube and forms anteriorly to the liver and pancreas25,26. It produces surfactant, mucus and antimicrobial peptides27,28 and anatomically, as well as ontogenetically, this organ is considered a homologue of the mammalian lung29,30. Since the pneumatic duct remains connected to the gut in the zebrafish, this allows for immersion infection to occur naturally. Remarkably, the only known naturally occurring infections of fish with Candida species are C. albicans infections in the swimbladder31. We recently described an experimental immersion infection model where C. albicans infects the swimbladder, and found that this infection recapitulates some of the hallmarks of C. albicans-epithelial interaction in vitro32,33. 
In the method presented here, the original immersion infection model is improved by directly injecting C. albicans into the swimbladder of 4 days post fertilization (dpf) zebrafish. This allows for precise temporal control of infection as well as a highly reproducible inoculum. It permits detailed intravital imaging, coupled with the versatility of the zebrafish model. As an example of what can be done with this method, we present the spatio-temporal dynamics of C. albicans growth along with neutrophil recruitment to the site of infection. Because zebrafish swimbladder tissue is challenging to image intravitally, we also present a rapid swimbladder dissection technique that improves fluorescence signal and microscopic resolution. These methods expand the toolbox for fungal, immunological, and aquaculture research as well as describing a novel infection route that may be translated to model other fungal, bacterial or viral infections of mucosal surfaces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:259px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deep Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>90000-760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wooden Dowels</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10805-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Melt Agarose</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillary</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPPI-3 Injection system</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Back Pressure Unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foot Switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>MS-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x microscope objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSApo 20x/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roller drum</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>TC-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>60825-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4534-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4532-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH0246-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BDH4520-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Children clay (Play-Doh)</td>
			<td>Hasbro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>VW6276-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer (Hausser scientific)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type A immersion oil</td>
			<td>Blue Marble Products</td>
			<td>51935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>14216-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (Lonza)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>12001-870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fishing wire</td>
			<td>Stren</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well imaging plate (Sensoplate)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High vacuum grease (Dow Corning)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>59344-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microslide (25 x 75 mm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48300-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48366-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol (EMD chemicals)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EMGX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well culture dish (Olympus plastics)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weight boats (8.9 cm)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89106-766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection

Frühe Verteidigung gegen Krankheitserreger Schleimhaut besteht sowohl eine Epithelbarriere und angeborenen Immunzellen. Die immunocompetency von beiden, und ihre Zwischenverbindung, an erster Stelle stehen für den Schutz vor Infektionen. Die Wechselwirkungen von Epithelzellen und Zellen des angeborenen Immunsystems mit einem Pathogen besten in vivo, wo komplexe Verhalten entfaltet über Zeit und Raum untersucht. Allerdings sind bestehende Modelle nicht für den einfachen Raum-Zeit-Bildgebung der Kampf mit Krankheitserregern an der Schleimhautniveau ermöglichen. Die hier entwickelten Modell erstellt eine Schleimhaut-Infektion durch direkte Injektion des Pilzpathogen, Candida albicans, in die Schwimmblase der jugendlichen Zebrafisch. Die daraus resultierende Infektion ermöglicht hochauflösende Bildgebung von epithelialen und angeborenen Immunzellverhaltens in der gesamten Entwicklung der Mucosal Disease. Die Vielseitigkeit dieser Methode ermöglicht die Abfrage des Host, um die detaillierte Abfolge der Ereignisse, die zu Immun pH-Sondeagocyte Rekrutierung und die Rollen von bestimmten Zelltypen und molekulare Signalwege in Schutz zu untersuchen. Darüber hinaus kann das Verhalten des Erregers als Funktion der Immunangriff gleichzeitig unter Verwendung fluoreszierende Protein exprimierenden C. abzubildenden albicans. Erhöhte räumliche Auflösung der Wirt-Pathogen-Interaktion ist auch möglich, mit dem beschriebenen schnellen Schwimmblase Dissektionstechnik. Die hier beschriebene Schleimhaut-Infektionsmodell ist einfach und sehr gut reproduzierbar, so dass es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Schleimhautinfektionen. Dieses System kann auch allgemein übersetzbar andere Schleimhautpathogene, wie beispielsweise mykobakteriellen, bakterielle oder virale Keime, die normalerweise durch epitheliale Oberflächen infizieren.

Mikroinjektion in der hinteren Schwimmblase Die hier präsentierten experimentellen Methode beschreibt die Injektion von einem konsistenten Dosis C. albicans Hefezellen in der Schwimmblase von 4 dpf Zebrafisch. Frühere Arbeiten mit der Immersions Modell schlägt vor, dass der Schwimmblase Immunantwort auf C. albicans ähnelt Säugerschleimhaut Candidiasis 32. Hier zeigen wir eine modifizierte Infektionsmethode, die einfacher, reproduzierbare und schnelle ist; mehre...

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Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Aufrufe.  University of Maine. In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.