تعتمد أهمية البروتوكول على الغشاء إلى إشارات النواة ولا تؤثر بشكل مباشر على الجينوم ، كما هو الحال مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. الطبيعة غير المسخية للخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم هي الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، مما يجعلها مناسبة للتطبيق السريري الآمن في مختلف مجالات الطب التجديدي. إثبات الإجراء هو الدكتور آن كاثرين شوت، رئيس المشروع، وأكسانا غريناكر، مساعد مختبر في مختبري.
لعزل PBMNCs، أضف 25 ملليلتر من الدم الواحد إلى واحد المخفف مع PBS إلى 10 ملليلتر من وسائط التدرج الكثافة والطرد المركزي الخليط في 300 مرة G لمدة 30 دقيقة. عزل طبقة الواجهة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة بخمس ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق.
بعد تكرار الإجراء مرتين، عد عدد الخلايا باستخدام غرفة العد. إضافة 6 في 10 إلى الخلايا أحادية نووية 6 إلى أنبوب 15 ملليلتر، ثم أداء الأجسام المضادة عبر ربط عن طريق إضافة الأجسام المضادة البشرية المرتبطة GPI البروتين البروتين محددة إلى الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الربط المتبادل، استبدل وسيط الحضانة بمتوسط دولبيكو المعدل من إيسكوف المكمل بنسبة 10٪ FBS.
تنمو الخلايا في 15 أنابيب البوليسترين ملليلتر عن طريق وضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 8 إلى 10 أيام دون اهتزاز. في اليوم الخامس، أضف ملليلتر إضافي إلى ملليلترين من متوسط إيسكوف مع 10٪ FBS لكل أنبوب 15 ملليلتر. عد الخلايا المستزرعة مع غرفة العد.
ثم الطرد المركزي تعليق الخلية من حوالي 5 في 10 إلى الخلايا 6 في 300 مرة G لمدة 10 دقائق ونسخ الناسخ الناتج مع ماصة باستور معقمة. Resuspend بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تبريدها من pH 7.2 مع 0.5٪ BSA واثنين من EDTA ملليمولار. ثم أضف 80 ميكرولتر CD-45 حبات مغناطيسية إيجابية بحجم نانو إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
لغسل الخلايا، أضف ملليلترين من حاجز PBS وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا ووضعه في المجال المغناطيسي.
ضع تعليق الخلية على العمود واغسله مرتين مع 500 ميكرولتر من مخزن PBS المؤقت. جمع الخلايا في المتوسطة إيسكوف تكملها مع 1٪ BSA وعد الخلايا في غرفة العد. وضع الأغطية الزجاجية في لوحات من أربعة آبار ومعطف لهم مع واحد إلى خمسة مخففة بولي-L-ornithine والمياه المقطرة مزدوجة.
بعد احتضان الأغطية في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، وغسلها بالماء المقطر مزدوجة. تذوب ببطء 0.5 إلى اثنين ملليغرام لكل ملليلتر من صفح وإضافته إلى الجزء العلوي من coverlips. احتضانها في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم إزالة صفح الزائدة عن طريق الأنابيب وإضافة N2 المتوسطة العصبية إلى أطباق الثقافة.
الثقافة BD المستمدة CD-45 الخلايا السلبية في N2 المتوسطة على الأغطية الزجاجية المغلفة بالنعناع أورنيثين لمدة يومين في حاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لبدء التمايز العصبي للخلايا التي ولدت BD حديثا. بعد ذلك ، تضع خلايا الثقافة في وسط التمايز العصبي ووضع اللوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 يوما. إعداد مثبت مع 75 ملليلتر من الماء العقيم وأربعة غرامات من البارافورمالديهايد.
أضف 10 هيدروكسيد الصوديوم الطبيعي حسب الحاجة مع التحريك حتى ينجلي الحل. إضافة خليط السكروز إلى الحل وitrate إلى درجة الحموضة 7.4 مع ستة حمض الهيدروكلوريك العادي. رفع مستوى الصوت إلى 100 ملليلتر مع الماء العقيم.
بعد إزالة الوسائط من ثقافة الخلية ، احتضنها مثبتا قبل الحرب لمدة 15 دقيقة ، ثم تجاهل المثبت وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. إضافة على الفور الطازجة 0.3٪ Triton-X الحل و permeabilize الخلايا لمدة خمس دقائق. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل حجب برنامج تلفزيوني و 5٪ BSA.
منع الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة الروك لمدة ساعة واحدة. إعداد تخفيف مناسب للأجسام المضادة في 1٪ BSA PBS واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة على لوحة الروك لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل.
احتضان الخلايا مع DAPI وجبل coverlips مع وسائل الإعلام المتصاعدة للتصور في المجهر. تمت دراسة الجانب المورفولوجي للخلايا المتمايزة BD في الأيام الأولى والخامسة وال 10 ، مما يدل على اتجاه الاختفاء التدريجي للخلايا غير النشطة وتزايد عدد الخلايا الجديدة باطراد في الثقافة المنشطة. كانت الخلايا المتمايزة BD صغيرة وأظهرت خصائص الخلايا الأغرانية غير الناضجة ذات العضيات الأقل والنوى الكبيرة مع الكروماتين المكثف على غرار ESCs.
تمت دراسة الخلايا لإعادة التمايز العصبي بعد زراعة الأطباق الثقافية المغلفة بالنعناع لمدة 30 يوما. في وقت مبكر من أربعة أيام، يمكن الكشف عن أول خلايا تشبه الخلايا العصبية مع هياكل متفرعة طويلة. تطورت معظم الخلايا الكروية الصغيرة إلى خلايا متفرعة ذات أشكال ممدودة أكبر ، مما يعني عملية نشطة نحو التمايز إلى أنساب الخلايا العصبية.
أظهر جسم الخلية وعمليات الخلايا تعقيدا أعلى من الخلايا غير المتمايزة ، مما يمثل كثافة عالية من الشبكية الإنتوبلازمية الخام وحزم من خيوط أكتين. الخلايا المتنامية في وسائل الإعلام التمايز كثيرا ما أنشأت الاتصالات من خلية إلى خلية التي تنطوي على الجسم الخلوي، في حين أن البعض الآخر ينطوي على العمليات الخلوية بطريقة تشبه neurite. أكد تحليل الكيمياء المناعية الذي تم إجراؤه باستخدام أجسام مضادة محددة أن الخلايا المتمايزة BD قادرة على إعادة التمايز نحو أنساب الخلايا العصبية المختلفة ، بما في ذلك الخلايا الفلكية GFAP.
هذه التقنية تجعل من الممكن إنشاء خلايا ذاتية غير مسخة قادرة على إعادة التمايز إلى خلايا الطبقة الجرثومية الثلاث ، مما يفتح فرصة جديدة في أبحاث الطب التجديدي.
