We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

The authors have nothing to disclose.

FT-IR هي طريقة الناشئة عن خالية من التسمية التصوير الكيمياء الحيوية من أقسام الأنسجة، مع احتمال أن يكون لها دور مهم في تحسين مستوى الحالي للتشخيص في علم الأمراض. المعيار الذهبي الحالي للأمراض الأنسجة يتطلب أن تحتاج فحص، ثابتة في الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع عدة مرات، وملطخة البقع متعددة. وقال الطبيب الشرعي المدربين تدريبا عاليا ديه لتقييم ذاتي بصريا بنية الأنسجة والتشكل الخلوي لتحديد التشخيص. نحن هنا تظهر كيفية جمع الصور IR عالية الدقة من نفس النوع من أقسام ومناقشة بعض النهج الحسابية لدراسة الاختلافات الكيميائية بين أنواع الخلايا والحالات المرضية. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي للتأكد من أن الأنسجة التي تركز بعناية فائقة وأن النظام معايرة بشكل جيد لضمان البيانات الطيفية ذات جودة عالية جدا. الرعاية عند إعداد هذا النظام هو criti ولا سيما<html> كال عند العمل مع أهداف التكبير عالية. للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، القائمة التالية تغطي بعض الصعوبات المحتملة التي تمت مواجهتها؛ مشكلة: انخفاض كثافة الأشعة تحت الحمراء عند التصوير في التفكير. الحل: تحقق IR التوجه الشريحة مثل طلاء عاكسة قد تكون على الجانب الخطأ من الشريحة. مشكلة: انخفاض إشارة / علامة تحذير الأحمر في مراقبة لانسر. الحل: كشف كول مع LN2. مطلوب النيتروجين السائل للكشف عن FPA على العمل ويتطلب دوريا يجري تصدرت تصل. المشكلة: سرعة الأخطاء الخطأ / الحركة. الحل: إعادة تعيين مطياف وتقليل الاهتزازات. سوف تسبب الاهتزازات المرآة تتحرك في تداخل أن بالانزعاج. المشكلة: ارتفاع بخار الماء في البيانات. الحل: زيادة تطهير على النظام وحماية عينة من الهواء. المشكلة: centerburst غير صالح. الحل: البحث centerburst مرة أخرى. e_content &quot;&gt; المشكلة: الفرق انخفاض تدفق في نقل، على الرغم من تركز الحل: ضبط المكثف أسفل هذا سوف يحدث كما هو لا يجري التركيز ضوء الأشعة تحت الحمراء إلى نقطة على العينة. في هذه الورقة، فقد ركزنا على كيفية الحصول على صور عالية الوضوح IR من الأنسجة في أي انتقال أو وضع transflectance. طبيعة التصوير FT-IR، هو أن هناك تعديلات المتعددة التي يمكن إدخالها على الحصول على البيانات، مثل، نوع من الركيزة، تقنية التثبيت، سمك العينة، القرار الطيفي، وتداخل سرعة مرآة الخ تأثير هذه المعلمات لديها نوقشت بالتفصيل واسعة في الآونة الأخيرة 4،5،17،51. وهناك عدد من التعديلات التي يمكن إدخالها على نظام التصوير بما في ذلك التصوير في وضع ATR 10،24،26 وباستخدام نهج الحرارية النانوية 52،53 للسماح لارتفاع القرار التصوير IR. القيد الرئيسي مع ارتفاع القرار التصوير IR هو أن منظمة الشفافية الدوليةssues يجب أن يكون مستعدا بعناية ورقيقة بما يكفي لIR لتمرير من خلال (عادة 4 سمك ميكرون). وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نقل والانعكاس FT-IR التصوير العينات إلى أن تكون جافة بسبب امتصاص الأشعة تحت الحمراء عن طريق المياه. ومع ذلك، FT-IR التصوير ديه مزايا هامة على تقنيات أخرى، في أن ما في وسعها صورة بسرعة جدا مساحات واسعة من الأنسجة في حين اشتقاق المعلومات الكيميائية الحيوية الغنية وتفصيلا. وتشمل التقنيات الأخرى المماثلة التي تستمد المعلومات الحيوية بطريقة خالية من التسمية رامان الطيفي، ولكن وقت الحصول على البيانات أبطأ بكثير للحصول على الصور. النهج الجديد التصوير رامان آخذة في الظهور بما في ذلك محفز رامان نثر (SRS) ومتماسك Antistokes رامان نثر (CARS)؛ ومع ذلك، لديهم مجموعة وصول الطيفية محدود أو التصوير تيرة واحدة. قد يكون تقدما في سرعة الحصول على البيانات، التحليل المكاني، وتوافر النهج الحسابية من قيمة كبيرة في جعل FT-IR ايماج<html> جي نهجا أكثر جدوى للترجمة كأداة التصوير الجديدة في علم الأمراض. وكانت التطورات الأخيرة في القرار المكانية أهمية خاصة بالنسبة للأمراض الأنسجة نتيجة لأنواع الخلايا الأساسية لا يجري للحل باستخدام نظم التصوير FT-IR التقليدية. الورقة الأخيرة التي ريدي وآخرون. أظهرت كيفية تصميم نموذج نظام مثالي للحصول على قرار المكاني الأمثل لنظام التصوير FT-IR 5. على سبيل المثال أنسجة الكلى المقدمة في هذه الورقة يوضح أهمية القرارات المكانية أعلى من أجل استخراج المعلومات الحيوية من الهياكل الكبيبي (الشكل 3) والشكل (5). في المستقبل، التطورات الجديدة في الكم تتالي الليزر كما مشرقة جدا مصادر الضوء الأشعة تحت الحمراء 54-57، 3D الطيفي التصوير 58، وتحقيق اختراقات في مجال تقنيات النانو IR 52،53،59،60 عقد آفاقا جديدة مثيرة من البحوث التي قد يكون لها آثار ضخمة في مستقبل التصوير الأنسجة. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; لقد قدمنا ​​أمثلة من التطبيقات في الكبد وأمراض الكلى حيث أن هناك حاجة للحصول على معلومات إضافية الكيميائية الحيوية التي يمكن أن تكون ذات قيمة تشخيصية. ويركز مختبر علم الأمراض الطيفي في قسم علم الأمراض في جامعة إلينوي في شيكاغو على ترجمة تقنيات التصوير IR نحو تحسين تشخيص الأمراض وتحسين التنبؤ بنتائج المرضى. قد التصوير FT-IR التغلب على بعض القيود الحالية في ممارسة علم الأمراض التي تتطلب معلومات كمية وموضوعية. على وجه الخصوص، ويتركز العمل في المستقبل على تحديد المناطق في ممارسة علم الأمراض الحالية حيث تفشل التقنيات الحالية لتوفير الحساسية التشخيصية المناسبة أو تقديم معلومات محدودة. وثمة حاجة واضحة في تحسين الممارسة الحالية للعلم الأمراض ونحو إعطاء المزيد من المعلومات إلى الطبيب الشرعي حول حالة مرض المريض، والتي قد تكون قابلة للتحقيق باستخدام عالية الوضوح التصوير FT-IR.

وكانت أطياف الأشعة تحت الحمراء أداة تحليلية المتوفرة في بعض شكل منذ 1930s. ومع ذلك، كان فقط خلال العقد الماضي أن مجال التصوير الأنسجة مع FT-IR قد انفجرت. وقد كان الدافع وراء التقدم في FT-IR لتصوير الأنسجة في جزء كبير من قبل ثلاثة تطورات رئيسية: 1) زيادة سرعة الحصول على البيانات نظرا لتوافر كبير صفيف المستوى البؤري (FPA) للكشف عن الذي عادة ما يكون الآلاف من الأشعة تحت الحمراء للكشف عن حساسية 1 ، 2، 2) تطوير خوارزميات المعالجة المتقدمة والقوة الحسابية لمعالجة البيانات الفائقة الطيفية كبيرة تحدد 3، و 3) نمذجة نظم التصوير FT-IR لتعظيم القرار المكانية 4،5. كانت هناك العديد من جودة عالية والمواد واسعة جدا إعادة النظر في مجال FT-IR الطيفي مؤخرا 6-16، بالإضافة إلى ورقة الطبيعة البروتوكولات التي تفاصيل الخطوات للحصول على الأطياف نقطة أو الخرائط من الأنسجة (17). في هذه الورقة، سوف نركز على البروتوكول الاضافيocol للحصول على صور من الأنسجة باستخدام 128 × 128 كاشف FPA في تعديل نظام FT-IR مع قدرات عالية الوضوح. منذ فترة طويلة واقترح FT-IR التصوير ليكون أداة يحتمل أن تكون مرغوبة للخلية والتصوير الأنسجة بسبب القدرة على الحصول على الصور في كل بكسل التي لديها ثروة من المعلومات الحيوية. ويستند FT-IR التصوير على مبدأ أن الجزيئات الحيوية المختلفة في عينة سوف تمتص الكمية مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء. وهذا يسمح للاشتقاق من &#39;البصمة الكيميائية الحيوية &quot;. قد تظهر هذه البصمات في العديد من الدراسات لتغيير بين أنواع مختلفة من الخلايا والحالات المرضية. خلافا لما حدث في ممارسة علم الأمراض التقليدية التي تحتاج فيها بقع وعلامات المناعى لاستخدامها لتصور وتحديد أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تستخدم لتوجيه خيارات التشخيص والعلاج، ويتم تشكيل الصور من FT-IR على أساس الكيمياء الحيوية المتأصل في الأنسجة. وTECHNIQ الحاليرق من الأنسجة تلطيخ للتشخيص هو مضيعة للوقت، مدمرة، شاقة، ويتطلب الخبرة الشخصية للالطبيب الشرعي، في حين FT-IR توفر إمكانية لجعل هذه العملية سريعة وغير مدمرة، الآلي للغاية، وأكثر من ذلك الهدف. وبالإضافة إلى ذلك، توفر FT-IR طريقا جديدا لحصول على معلومات إضافية البيوكيميائية التي قد لا تكون في متناول الجميع باستخدام تقنيات تلطيخ التقليدية. كان واحدا من أكثر التطورات إثارة في السنوات الأخيرة توافر نهج عالية التصوير القرار الذي يمكن أن تسمح الآن لتصور وتوصيف أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تعتبر بالغة الأهمية لتشخيص شامل المرض. واحدة من هذه التقنيات هو الموهن إجمالي الانعكاس (ATR) FT-IR الذي يشتمل على عدسة الغمر الصلبة (SIL) من معامل الانكسار عالية والذي يسمح لارتفاع القرار التصوير 18، مع العديد من الدراسات المثيرة جدا تظهر تطبيقاتها 19-25. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه ثكما ثبت مؤخرا أن زيادة القرار المكانية المرتبطة ATR التصوير يمكن أن تسمح لتصور وتصنيف البطانية وخلايا عضلية ظهارية في أنسجة الثدي والتي تشكل عنصرا رئيسيا في تشخيص سرطان الثدي 26. في حين ATR التصوير مفيد جدا، وهذا الأسلوب يتطلب SIL لاجراء اتصالات مع الأنسجة لتشكيل الصور FT-IR. وبالتالي، واستخدامه يقتصر إلى حد ما لأمراض الأنسجة حيث مناطق واسعة من الأنسجة يجب تصويره بسرعة. وقد تجلى نهج الثاني اقتران هدف تضخم عالية إلى النظام القائم FT-IR يستخدم السنكروترون كمصدر مشرق من الأشعة تحت الحمراء، فمن الممكن لإلقاء الضوء بالكامل على FPA وصورة مع حجم بكسل فعال من 0.54 X 0.54 ميكرون. هذا يسمح لنا لتصور الهياكل الرئيسية في الثدي والبروستاتا الأنسجة التي لم تكن للحل باستخدام أنظمة FT-IR التقليدية 4. في حين أن هذه الزيادات الكبيرة في صورة IR resolutio المكانيةن كانت مثيرة، وبقي استخدامها محدود بسبب تتطلب السنكروترون. وفي وقت لاحق، وقد تم تصميم نظام الأمثل والتي قد تسمح أيضا للقدرات التصوير عالية الوضوح مع حجم بكسل 1.1 X 1.1 ميكرون دون اشتراط وجود مصدر السنكروترون بل باستخدام مصدر IR globar التقليدية 5. في هذه المقالة، وتبين لنا كيفية تعديل نظام التصوير الموجودة التجاري FT-IR للسماح للحيود الأشعة تحت الحمراء محدودة التصوير من الأنسجة مع إشارة مقبولة إلى نسبة الضوضاء باستخدام الأشعة تحت الحمراء أهداف متعددة (15X، 36X، 74X و). حجم بكسل فعال مع الأهداف الثلاثة هي 5.5 × 5.5 ميكرون (15X)، 2.2 X 2.2 ميكرون (36X) و 1.1 X 1.1 ميكرون (74X). نحن ثم إعطاء بعض الأمثلة على أهمية المكاسب التي تحققت في التحليل المكاني للكشف عن المرض في الكبد والكلى الخزعات 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) التصوير الطيفي هو نهج الناشئة للحصول على صور مفصلة التي ترتبط المعلومات الكيميائية الحيوية. ويستند التصوير FT-IR من الأنسجة على مبدأ أن مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء يتم امتصاصها عن طريق روابط كيميائية مختلفة (على سبيل المثال، C = O، CH، NH) داخل الخلايا أو الأنسجة التي يمكن بعد ذلك أن تكون ذات صلة إلى وجود وتكوين من الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، والدهون، DNA، الجليكوجين، والبروتين، الكولاجين). في صورة FT-IR، كل بكسل في الصورة يتكون بأكمله الأشعة تحت الحمراء (IR) الطيف التي يمكن أن تعطي معلومات عن حالة البيوكيميائية للخلايا التي يمكن بعد ذلك استغلالها لخلية من نوع أو مرض من نوع التصنيف. في هذه الورقة، وتبين لنا: كيفية الحصول على صور الأشعة تحت الحمراء من الأنسجة البشرية باستخدام نظام FT-IR، وكيفية تعديل الأجهزة الموجودة للسماح للقدرات التصوير عالي الوضوح، وكيفية تصور الصور FT-IR. نحن بعد ذلك تقديم بعض التطبيقات من FT-IRلعلم الأمراض باستخدام الكبد والكلى على سبيل المثال. التصوير FT-IR يحمل تطبيقات مثيرة في توفير طريقا جديدا للحصول على المعلومات الحيوية من الخلايا والأنسجة في غير الاقلاق مسار تماما خالية من التسمية نحو إعطاء نظرة جديدة إلى تغييرات الجزيئية البيولوجية كجزء من عمليات المرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه المعلومات الحيوية يحتمل يسمح للتحليل الموضوعي والآلي لبعض جوانب تشخيص الأمراض.

التصوير FT-IR يسمح للاشتقاق من الصور IR من الأنسجة التي يمكن أن تعطي تناقضات مختلفة تبعا لتردد الأشعة تحت الحمراء من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، في صورة الأشعة تحت الحمراء، ويتكون كل بكسل من الطيف IR بأكمله، مع قمم مختلفة الموافق الجزيئات الحيوية المختلفة التي يمكن أن تعطي معلومات حول الخصائص الكيميائية الحيوية من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية (الشكل 1). هنا، لقد أظهرنا كيفية مقارنة بصمات طيفية بين الطبقات، وتصنيف ولكن أكثر تقدما الآلي ممكن باستخدام خوارزميات إضافية 3،43-50، مثل تصنيف النظرية الافتراضية، عشوائية الغابات، الشبكات العصبية الاصطناعية، والهيكل التنظيمي تحليل العنقودية لا يمكن أن يؤديها على البيانات. سوف النهج تصنيف تحت الملاحظة تسمح لبناء المصنف الذي يمكن تدريب للسماح للاعتراف الآلي من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية. النهج تصنيف غير خاضعة للرقابة يمكن أن تستخدم للبحث عن DIF التي تحدث بشكل طبيعيمن مؤتمرات في الأنسجة أو الخلايا بسبب التباين الكيمياء الحيوية. وقد تطورت FT-IR الأجهزة على مدى العقود القليلة الماضية، من قياس في نقطة / وضع الخرائط واحد باستخدام الأشعة تحت الحمراء فتحات مبهمة إلى وضع التصوير باستخدام الأهداف Cassegrain، وذلك باستخدام إما الهدف إلقاء الضوء على جانب وجود هدف جمع في نقل الوضع أو هدف واحد أن كلا ينير ويجمع في انعكاس الوضع (الشكل 2). وقد تجلى مؤخرا أن الهدف جمع في وضع الإرسال يمكن أن تنتقل عن الملاعب لالتكبير العالي والهدف الفتحة العددية للسماح للحيود محدود التصوير الأشعة تحت الحمراء، الذي يؤدي إلى زيادات كبيرة في القرار المكانية التي تم جمعها من الصور IR 4،5. قد يكون تقدما في القرار المكانية للتصوير الأنسجة ذات أهمية حاسمة كما يمكننا الآن تحديد أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة، وعلى سبيل المثال وحدات وظيفية في الكلى، الكبيبات، وذلك باستخدام تكييفها في المنزلأنظمة FT-IR (الشكل 3). عالية الوضوح التصوير FT-IR يسمح للصور مفصلة من الأنسجة لفحصها لتحديد المناطق غير الطبيعية وتحديد الاختلافات الحيوية بين أنواع مختلفة من الخلايا. في نواة أنسجة الكبد، فمن الممكن لتصور خلايا الكبد والمناطق بالتسلل التليف الذي يقسم منطقتين متميزة من النمو الشاذ وتليف الكبد غير التنسج (الشكل 4). ونحن نعمل على استغلال هذا لجعل أدوات التشخيص الآلي للاستخدام في الحالات الصعبة من مرض في الكبد. الأهم من ذلك، يمكن زيادة القرار المكانية الآن تسمح لنا لعزل السمات الهيكلية المحددة التي يمكن تعديلها كيميائيا بواسطة المرض قبل التغيرات النسيجية واضحة. على سبيل المثال، نحن نركز على تحديد التغيرات البيوكيميائية في الهياكل الكبيبي في الكلى مثل كبسولة بومان، مسراق الكبيبة، الغشاء القاعدي الكبيبي وأنبوبي الغشاء القاعدي، قبل<html> التغييرات التي تم تحديدها من قبل الطبيب الشرعي ويمكن ملاحظة (الشكل 5). على وجه الخصوص، ونحن مهتمون في تحديد التغييرات المرتبطة تطور اعتلال الكلية السكري والرفض المزمن في مرضى زرع، حيث فشلت تقنيات الحالية لتحديد التغييرات بطريقة وقت مبكر بما يكفي لتدخل ناجح. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> الشكل 1. الصور FT-IR والطيف من نواة الكبد. صورة (A) H &amp; E الملون الأساسية من خزعة الكبد وصور الأشعة تحت الحمراء الامتصاصية من قسم التسلسلي للنفس الأساسية في (B) 3،286 سم -1 و (C) 2،603 سم -1، الذي سلط الضوء على السمات الهيكلية مختلفة. (D) نموذجي طيف الأشعة تحت الحمراء من الأنسجة، مع القمم الهامة المسمى. على نطاق وبار = 100 ميكرون.fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> الشكل 2. البصريات التخطيطي بالتفصيل وسائط تشغيل المجهر FT-IR. (A) في وضع الإرسال، يضيء العينة من خلال هدف القاع، والضوء المار من خلال العينة التي تم جمعها من قبل الهدف العلوي. (B) في وضع التأمل، والهدف من كبار يخدم على حد سواء لإلقاء الضوء على عينة وجمع الضوء المنعكس. لم يتم استخدام الهدف السفلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> الشكل 3. مقارنة بين مختلفاأهداف المجهر ر على الصور FT-IR من الكبيبة الكلى في 2،925 سم -1. (A) 15X جمع الهدف مع NA = 0.5 (حجم 5.5 × 5.5 ميكرون بكسل). (B) 36X الهدف جمع مع NA = 0.5 (حجم 2.2 X 2.2 ميكرون بكسل). (C) جمع الهدف مع NA 74X = 0.65 (حجم 1.1 X 1.1 ميكرون بكسل). شريط النطاق = 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> الشكل 4. الاختلافات الطيفية بين التليف وخلايا الكبد في نواة الكبد. (A) H &amp; E الملون الأساسية من خزعة الكبد. (ب) صورة لمقطع الأساسية التسلسلي الممسوحة ضوئيا في FT-IR (36X الإعداد موضوعي). (C) معدل تقييمأطياف resentative من خلايا الكبد والتليف، والتي اتخذت من مناطق الأنسجة المشار إليها السهام في (A) و (B). على نطاق وبار = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> الشكل 5. التمايز من الميزات خزعة نسيج الكلى من خلال استخدام عالية الوضوح التصوير FT-IR. (A) الدوري حمض شيف القسم الملون مع ميزات ليكون استخراجه المسمى. (B) عالية الوضوح FT-IR صورة CH 2 غير المتماثلة المنطقة الممتدة (36X الإعداد موضوعي) من قسم التسلسلي للالأنسجة نفسها. (C) ملامح وصفت في (A) استخراج باستخدام صورة FT-IR في (ب) أن يكون قادرا على DIF كيميائياferentiate الميزات أربعة من الأنسجة. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology at JoVE.com

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) طيفية التصوير من أقسام الأنسجة البشرية نحو تحسين علم الأمراض

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

high-definition-fourier-transform-infrared-ft-ir-spectroscopic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Medicine

Unit 1

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

z-Transform

SCIENTISTS IN ACTION

33.1K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

التصوير الضوئي المجال تواتر<em&gt; خارج الجسم</em&gt; عينات استئصال الرئة: الحصول على صورة واحدة واحدة لارتباط لالتشريح المرضي

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Bioengineering

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

عالمية باليد ثلاثي الأبعاد بصري سمعي التصوير دقق في الأنسجة العميقة تصوير الأوعية الدموية الإنسان والدراسات ما قبل السريرية وظيفية في الوقت الحقيقي

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Cancer Research

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

تيراهيرتز التصوير وبروتوكول التوصيف لأورام سرطان الثدي المكوس حديثا

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Engineering

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

المتعدد الوسائط التصوير ومنهاج Microendoscopy الطيفي الألياف الرزمة لغير الغازية،<em&gt; في فيفو</em&gt; تحليل الأنسجة

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الحاملة للورم باستخدام التبييض التكراري يمتد إلى نهج تعدد الإرسال

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

في الوقت الحقيقي ، بلونين تحفيز رامان تشتت التصوير من دماغ الفأر لتشخيص الأنسجة

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>بروتوكول شامل لتحديد الخلايا وتحليل التمثيل الغذائي باستخدام OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: OPTIR-FISH المتكامل لتحليل التمثيل الغذائي والهوية أحادي الخلية في البيئات المعقدة

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

التهجين البصري للأشعة تحت الحمراء الحرارية الضوئية في الموقع (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) طيفية التصوير من أقسام الأنسجة البشرية نحو تحسين علم الأمراض

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST