We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. La creación de un FT-IR Microscopio y adquisición de tejidos Imágenes <ol><li> Sección de un bloque de tejido incluido en parafina fijado en formol al 4 micras de espesor a una diapositiva compatible IR utilizando un microtomo. Alternativamente, la sección un nitrógeno tejido congelado líquido a 4 micras de espesor sobre una diapositiva compatible IR utilizando un criostato. NOTA: Por lo general, una sección de serie también será adquirida en un portaobjetos de vidrio y se tiñó con un especial (como hematoxilina y eosina (H &amp; E)) o tinción inmunohistoquímica. Además, las líneas celulares cultivadas pueden ser cultivadas en portaobjetos compatibles IR. Diapositivas compatibles IR pueden ser diapositivas reflectantes IR para imágenes reflexión modo (por ejemplo, diapositivas mirrir, oro) o IR diapositivas transparentes para la imagen modo de transmisión (por ejemplo, BaF2, CaF2). </li><li> Purgar el microscopio FT-IR y el espectrómetro utilizando aire seco o gas nitrógeno seco para eliminar el agua atmosférica del sistema. Espere al menos 45 minutos antes de la proyección de imagen para asegurar una minuciosa Purge. </li><li> Enfriar tanto el detector FPA (a 79 K) y el detector MCT interna en el microscopio FT-IR usando nitrógeno líquido. Enfriar los detectores aproximadamente cada 6 horas. ¡CUIDADO! El nitrógeno líquido es un fluido criogénico y puede causar quemaduras por frío, congelación y en espacios cerrados asfixia. </li><li> Montar la diapositiva muestra sobre la platina del microscopio para imágenes FT-IR. </li><li> Asegúrese de que la luz visible es &quot;ON&quot; y, a continuación, ya sea usando los binoculares o el programa de captura de la muestra (que proporciona una imagen en tiempo real visible del tejido), se centran en la muestra. </li><li> Abra el paquete de software de paquete como resoluciones a favor y haga clic en &quot;recoger&quot;, a continuación, haga clic en &#39;Diagnósticos&#39; y seleccione &#39;Alinear Espectrómetro&#39;. Asegúrese de que la trayectoria del haz al detector interno espectrómetro no esté obstruido. </li><li> Haga clic en &quot;Configuración de imagen&quot;. </li><li> En la pestaña de &#39;Electrónica&#39;, seleccione la &#39;velocidad&#39; adecuada &#39;Bajo SaRatio mpling (UDR) &quot;y&quot; ajustes de filtros &#39;en función del sistema. NOTA: En este ejemplo, el entorno es Velocidad = 2,5 KHz, UDR = 4 y Filtros = Ninguno. </li><li> En la pestaña &#39;Óptica&#39; aseguran que se seleccionan &quot;fuente de mitad de IR &#39;,&#39; apertura abierto &#39;y&#39; 100% atenuador de haz &#39;. </li><li> Para calibrar el sistema, en la pestaña &#39;Óptica&#39;, seleccione &#39;detector&#39; como &#39;tierra&#39;, &#39;Microscopio Detector&#39; como &#39;Izquierda&#39;, y luego seleccione ya sea &quot;transmitancia&quot; o &quot;Reflexión&quot; en &quot;modo de Óptica&quot; en función del tipo de la corredera que se utiliza. </li><li> Haga clic en Configuración, que abrirá la ventana &quot;Control Lancer &#39;. NOTA: Para el modo de reflexión siga las instrucciones en 1,12 y 1,13 y para el modo de transmisión sigue las instrucciones en 1.14 a 1.16. Continúe desde 1,17 tanto para la reflexión y transmisión. </li><li> Para el modo de reflexión, en y# 8216; &#39;clic&#39; Control de Lancer Raw &#39;. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), vaya a un área limpia en la diapositiva. </li><li> Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos. A continuación, mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido, y perfeccionar el enfoque de la imagen. Cambiar &quot;calor&quot; y las opciones de &#39;contraste&#39; para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque, esto no tendrá ningún efecto en los datos de IR. Continúe desde 1,18. </li><li> Para el modo de transmisión, en haga clic en &#39;Control de Lancer&#39; en &#39;Raw&#39;. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), vaya a un área limpia de la diapositiva. </li><li> Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos. </li><li> Ajustar la parte inferior de enfoque / objetivo condensador para aumentar el número de cuentas a su maximum. Ver la forma de la imagen inferior derecha en el control de Lancer para asegurarse de que es gaussiana en apariencia y relativamente uniforme. Ajuste el tiempo de integración de nuevo a alrededor de 8.000 cuentas. NOTA: Si cualquiera de los píxeles en la imagen interferograma FT-IR gire blanco, reducir el tiempo de integración. </li><li> Mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido y perfeccionar el enfoque de la imagen. Opcionalmente, cambie las opciones calor y contraste para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque, pero no tendrá ningún efecto en los datos de IR. </li><li> Utilizando la palanca de control de la etapa, vaya a un área limpia de la diapositiva. Pulse el botón &quot;Calibrar&quot;. Asegúrese de que el &#39;Out Of Range (FQ) «valor es menor que 50 y la diferencia entre el&#39; High Flux &#39;y cuenta&#39; Low Flux &#39;es al menos 4.000 recuentos. </li><li> Seleccione &quot;Aceptar&quot; dos veces. En las fichas de óptica seleccionar; &#39;MCT&#39; &#39;detector&#39; = &#39;Microsfrente Detector &#39;=&#39; derecho &#39;y haga clic en &quot;Configuración&quot;. En este punto habrá un interferograma FT-IR en la pantalla. Haga clic en &quot;Buscar Centerburst &#39;. Haga clic en &#39;OK&#39;. </li><li> En la pestaña &#39;Óptica&#39;, vuelva a seleccionar &#39;detector&#39; = &#39;tierra&#39;, &#39;Microscopio Detector&#39; = &quot;izquierda&quot; y seleccione &quot;Configuración&quot;. </li><li> En Control de Lancer - que la imagen es aún en un área limpia y haga clic en &#39;Calibrar&#39; de nuevo. Haga clic en &#39;OK&#39;. </li><li> A continuación, recoger una imagen de FT-IR de fondo para corregir la absorbancia de la atmósfera, del sistema y de diapositivas. Ve a la pestaña &#39;Electrónica&#39; y seleccione una resolución espectral adecuada, típicamente de 4 cm-1 o 8 cm -1 para el tejido. </li><li> Ve a la pestaña &quot;fondo&quot; y escriba 128 en &#39;Scans para co-add&#39;. Seleccione la opción &#39;Nuevo archivo ... &quot;botón y colocar el archivo de fondo en pliegue apropiadoer. Compruebe la pestaña &#39;Imaging&#39; para asegurarse de mosaicos es de 1 por 1. Haga clic en el &quot;fondo&quot;, esperar a que la exploración hasta el final y confirmar que desea guardar el archivo. Haga clic en una región en la imagen de fondo FT-IR y comprobar el espectro. </li><li> Para tomar una imagen grande mosaico de la muestra, seleccione la pestaña &#39;Imaging&#39; e introduzca el número de cuadros X e Y para el tamaño del mosaico que desea adquirir. </li><li> Haga clic en &quot;Configuración&quot; y en el Control Lancer utilizar la vista de IR en vivo para encontrar el área de interés. Si se toma un mosaico, centrar la transmisión en vivo en el medio de la zona de interés. Haga clic en &#39;OK&#39;. Ve a la pestaña &#39;Electrónica&#39; y escriba el número de exploraciones para co-add (normalmente un valor entre 2 y 16 exploraciones para el tejido). Haga clic en «Buscar». </li><li> Compruebe la imagen FT-IR recogido en la pantalla para asegurarse de que se ve enfocado. Haga clic sobre la imagen para que aparezca un espectro IR de ese lugar y comprobar que parece tener una señal aceptable al ruido. Acquire una imagen visible de la muestra. </li><li> Guarda la imagen y exportarla al formato requerido, tales como ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adaptación de un microscopio FT-IR para capacidades de alta definición NOTA: La mayoría de los sistemas de FT-IR están equipadas con un objetivo aproximadamente con un aumento de 15x y 0,5 apertura numérica (NA). Para la imagen en modo de alta definición, un IR compatible 36X o 74X objetivo puede ser usado para dar difracción capacidades de imagen limitados. <ol><li> Retire 15X el objetivo del sistema desatornillando hacia la izquierda. </li><li> Atornillar ya sea en el objetivo 36X o 74X en su lugar. Alinear el objetivo antes de su uso. Utilice tubos de extensión de la lente para llevar el objetivo lo suficientemente cerca de la muestra. </li><li> Coloque el tejido bajo el nuevo objetivo y enfoque utilizando la luz visible ya sea utilizando los prismáticos o programa Capture de la muestra. NOTA: Imágenes de alta definición debe hacerse de modo de transmisión. La estrecha distancia de trabajo de laobjetivos en sí (1-2 mm) y muy poca profundidad de foco requiere centrarse despacio y con cuidado, teniendo tiempo para bajar el objetivo sin tocar la muestra. </li><li> Siga las instrucciones de 1,6 a 1,11. NOTA: Debido a ser mucho más difícil de enfocar y mucho menos luz que llega al detector, el siguiente protocolo se ajusta basándose en 1.14. </li><li> En el modo de transmisión, haga clic en &#39;Raw&#39;. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), mover a los tejidos y centrarse (idealmente en un borde). NOTA: Esto puede ser difícil, por lo tanto, ajustar el &quot;calor&quot; y las opciones de &#39;contraste&#39; para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque (estas opciones no afectan a los datos IR). </li><li> Una vez centrado, con el joystick de control de la etapa y la vista IR vivo traslado a una zona limpia de la diapositiva. Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos. Ajustar la parte inferior de enfoque objetivoaumentar el número de recuentos a su máximo. Ajuste el tiempo de integración de nuevo a alrededor de 8.000 cuentas. </li><li> Mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido, y perfeccionar el enfoque de la imagen. </li><li> Si mosaicos de una imagen en alta resolución, ajuste la etapa para permitir el movimiento correcto requerido a través de distancias para los mosaicos de precisión. Para cambiar los ajustes de distancia de la etapa, vaya a &#39;fase de instalación &quot;en el Control Lancer y ajustar la configuración de alineación horizontal y vertical para permitir la creación de mosaicos correcta. </li><li> Utilizando la palanca de control de movimiento etapa a una zona limpia de la diapositiva. Pulse el botón &quot;Calibrar&quot;. Asegúrese de que el fuera de rango (FQ) valor es inferior a 50, tanto para 36X y 74X objetivos. Asegúrese de que la diferencia entre el alto flujo y los valores Low Flux es de al menos 1.000 cuentas para el objetivo 74X y 2000 conteos para el objetivo de 36X. </li><li> Continuar 1,19-1,27. El número de exploraciones en 1,23 y1.25 tendrá que ser ajustado debido a la señal reducida a aproximadamente 256 exploraciones para la imagen de fondo y de 16 a 128 barridos para la imagen de los tejidos. </li></ol> 3. Visualización de y clasificar al espectro IR Conjuntos de datos NOTA: En esta sección, vamos a discutir la forma de visualizar y extraer datos de imágenes espectrales utilizando el procesamiento de imágenes geoespaciales y análisis de software tales como ENVI + IDL, sin embargo, el proceso es muy similar para cualquier software alternativo, como MATLAB, el software libre como Cytospec o el propio software del desarrollador instrumento. Hay algunas diversas técnicas de procesamiento espectral que se pueden realizar en los datos infrarrojos. <ol><li> Abrir el procesamiento de imágenes geoespaciales y software de análisis y cargar el archivo de datos IR. </li><li> Aplicar un algoritmo de corrección de línea de base a los datos de IR seleccionando &quot;Herramientas espectrales&quot; y desplácese hacia abajo y haga clic en &quot;espectros de absorción&quot;. Observar un menú emergente y seleccione &quot;corre Línea Basección &quot; NOTA: La corrección de línea de base eliminará una pendiente de compensación de línea de base a partir de los datos debido a la dispersión </li><li> Realizar la normalización espectral, por ratioing los datos a un cierto pico espectral (típicamente de amida I (1650 cm -1) o amida II (1550 cm -1)) o área bajo una región definida de los espectros. Para ello, seleccione &quot;Normal espectros&quot; en el capítulo &quot;Absorbancia Spectra&quot; Opciones del menú. NOTA: Spectral normalización se lleva a cabo de modo que las diferencias en los espectros son verdaderas diferencias bioquímicas y no debido a espesor o diferencias de densidad entre las muestras. </li><li> Usa un algoritmo de reducción de ruido para eliminar el ruido de los espectros 28 si es necesario. NOTA: Hay varios enfoques disponibles por los cuales la corrección de línea de base, la normalización espectral y la reducción de ruido se pueden lograr, con la mayoría del software que tiene algoritmos automatizados construidos en Además, hay un número emergente de enfoques que corregir para.aberraciones espectrales, que han sido discutidos en detalle 29-42; Sin embargo, la comunidad aún no está de acuerdo en cuales de ellas son necesarias. </li><li> Observar una lista de todas las frecuencias IR recogidos dentro de la imagen (típicamente de un rango espectral de 900 a 4000 cm -1). Haga clic en las frecuencias que corresponden a biomoléculas específicas para observar una imagen del tejido en la frecuencia seleccionada. <ol><li> Por ejemplo, haga clic en la banda de 1650 cm -1 para observar la distribución de las proteínas en la muestra. Alternativamente, haga clic en la banda de 1080 cm -1 para observar la distribución de los ácidos nucleicos en la muestra. Utilice el número de onda 1650 cm -1. </li></ol></li><li> Crear imágenes adicionales mediante el cálculo de coeficientes espectrales pico de altura, relaciones de área de pico, etc., que permitan la visualización de los diferentes componentes biomoleculares. Haga clic en &quot;Herramientas espectrales &#39;y luego seleccione&#39; Ratios altura del pico&quot; o &quot;Calcular el área de imagen &#39;para crear imágenes. </li><li> Busque en la sección de tejido adyacente correspondiente que se tiñeron utilizando un sistema de imágenes de diapositivas todo único que captura imágenes de campo claro. Junto a la imagen IR, que aparezca la imagen digital del tejido teñido con un programa de imagen visible. </li><li> Haga clic derecho sobre la imagen en una región de interés y seleccione el perfil de Z &#39;. Esto le dará a la información espectral en el píxel seleccionado. </li><li> Mira los espectros IR de múltiples píxeles de varias clases, tales como la comparación de tipos celulares, estados de enfermedad. Marcar píxeles específicos sobre la imagen utilizando el &#39;regiones de interés &quot;herramienta (ROI). Para realizar esto, haga clic derecho sobre la imagen y selecciona &quot;herramienta de ROI. Crear las clases que estén etiquetados, por ejemplo normal, displasia, y clases de cáncer. A continuación, seleccione &quot;Tipo de retorno de la inversión &#39;-&#39; Point &#39;. A continuación, seleccione la clase para seleccionar píxeles para y se basan en los píxeles correspondientes en la imagen IR. Derivar los espectros promedio fo cada una de las clases utilizando la herramienta &#39;ROI promedio&#39;. </li><li> Comparación de los espectros obtenidos por el trazado de en software de gráficos. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR es una modalidad emergente de libre de etiquetas de imágenes bioquímica de las secciones de tejido, con el potencial de tener un papel importante en la mejora del nivel actual de diagnóstico en la patología. El actual estándar de oro para la patología requiere tejidos para realizar una biopsia, se fijaron en formol, embebidos en parafina, seccionadas varias veces, y se tiñeron con múltiples manchas. Un patólogo altamente capacitado tiene que evaluar subjetivamente visualmente la estructura del tejido y la morfología celular para determinar un diagnóstico. Aquí te mostramos cómo recoger imágenes infrarrojas de alta resolución desde el mismo tipo de secciones y discutir algunos de los enfoques computacionales para examinar las diferencias químicas entre los tipos de células y estados de enfermedad. Los pasos críticos dentro de este protocolo son asegurar que los tejidos se centran mucho cuidado y que el sistema está bien calibrados para asegurar que los datos espectroscópicos de muy alta calidad. El cuidado al configurar el sistema es particularmente criti<html> cal cuando se trabaja con objetivos de gran aumento. Para ayudar en la solución de problemas, la siguiente lista cubre algunos de los potenciales dificultades encontradas; Problema: Baja intensidad de IR cuando se generan imágenes en la reflexión. Solución: Compruebe la orientación de diapositivas IR como el revestimiento reflectante puede estar en el lado equivocado de la diapositiva. Problema: Baja señal / señal de alerta roja en el Control de Lancer. Solución: detectores frescos con LN2. Se requiere de nitrógeno líquido para los detectores FPA para funcionar y requiere periódicamente rellenada. Problema: Velocity errores error / movimiento. Solución: Cambiar espectrómetro y reducir las vibraciones. Las vibraciones harán que el espejo móvil en el interferómetro a ser perturbado. Problema: los picos de vapor de agua en los datos. Solución: Aumentar la purga del sistema y proteger la muestra de aire. Problema: centerburst válido. Solución: Encuentra centerburst nuevo. e_content &quot;&gt; Problema:. diferencia de bajo flujo en la transmisión, a pesar de que se centró Solución:. Ajuste condensador inferior Esto ocurrirá cuando la luz IR no se está enfocada a un punto en la muestra. En este trabajo, nos hemos centrado en la forma de adquirir imágenes de alta definición IR de los tejidos, ya sea en el modo de transmisión o transflectancia. La naturaleza de las imágenes FT-IR, es que hay múltiples modificaciones que se pueden hacer a la adquisición de datos, tales como, el tipo de sustrato, la técnica de fijación, espesor de la muestra, la resolución espectral, interferómetro velocidad Espejo etc. El efecto de estos parámetros tiene ha discutido en extenso detalle recientemente 4,5,17,51. Hay una serie de modificaciones que pueden introducirse en el sistema de formación de imágenes incluyendo imágenes en modo ATR 10,24,26 y el uso de enfoques térmicas nanoescala 52,53 para permitir la formación de imágenes IR de alta resolución. La principal limitación con imágenes de infrarrojos de alta resolución es que el tiEMAS deben ser cuidadosamente preparados y lo suficientemente delgada para IR para pasar a través (típicamente 4 micras de espesor). Además, las imágenes de FT-IR de transmisión y reflectancia requiere las muestras a ser seco debido a la absorbancia de IR por el agua. Sin embargo, las imágenes de FT-IR tiene ventajas significativas sobre otras técnicas, ya que puede imagen muy rápidamente grandes áreas de tejido mientras que se derivan información bioquímica rica y detallada. Otras técnicas similares que se derivan información bioquímica de una manera libre de etiquetas incluyen la espectroscopia Raman, sin embargo el tiempo de adquisición de datos es mucho más lento para adquirir imágenes. Están surgiendo enfoques de imagen Nueva Raman incluyendo la dispersión Raman estimulada (SRS) y coherente Antistokes dispersión Raman (CARS); sin embargo, tienen rango espectral de acceso limitado o imágenes de una sola frecuencia. Los avances en la velocidad de adquisición de datos, la resolución espacial, y la disponibilidad de métodos de cálculo han sido de gran valor en la toma de FT-IR imaging un enfoque más factible para la traducción como una nueva herramienta de imagen en patología. Los recientes avances en la resolución espacial han sido especialmente importantes para la patología del tejido debido a tipos de células clave no son resolubles mediante sistemas de imágenes de FT-IR convencionales. El trabajo reciente de Reddy et al. mostró cómo modelar un sistema ideal para obtener la resolución espacial óptima de un sistema de imagen FT-IR 5. El ejemplo tejido renal se presenta en este trabajo se demuestra la importancia de una mayor resolución espacial con el fin de extraer información bioquímica de las estructuras glomerulares (Figura 3 y Figura 5). En el futuro, los nuevos avances en Quantum Cascade Lasers como muy brillantes fuentes de luz IR 54-57, imagen espectral 3D de 58 años, y los avances en el campo de las tecnologías de nanoescala IR 52,53,59,60 sostienen emocionantes nuevas vías de investigación que pueden tener enormes implicaciones en el futuro de la imagen de tejidos. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; Hemos presentado ejemplos de aplicaciones en enfermedades hepáticas y renales, donde hay una necesidad de información bioquímica adicional que puede ser de valor diagnóstico. La espectral Patología Laboratorio en el Departamento de Patología de la Universidad de Illinois en Chicago se centra en la traducción de las tecnologías de imágenes IR a mejorar el diagnóstico de enfermedades y la mejora de la predicción de la evolución del paciente. Imágenes FT-IR puede superar algunas de las limitaciones actuales en la práctica patología donde se requiere información cuantitativa y objetiva. En particular, el trabajo futuro se centra en la identificación de áreas en la práctica la patología actual donde las técnicas actuales no proporcionan sensibilidad diagnóstica adecuada o proporcionar información limitada. Existe una clara necesidad en la mejora de la práctica actual de la patología y hacia dar más información al patólogo sobre el estado de la enfermedad de un paciente, que puede ser alcanzable usando formación de imágenes de alta definición FT-IR.

Espectroscopia IR ha sido una herramienta de análisis disponible en alguna forma desde la década de 1930; Sin embargo, sólo se ha sido en la última década que el área de formación de imágenes de tejido con FT-IR se ha disparado. Los avances de la FT-IR para obtener imágenes de tejidos se han impulsado en gran parte por tres acontecimientos fundamentales: 1) aumento de la velocidad de adquisición de datos debido a la disponibilidad de un gran conjunto de plano focal (FPA) detectores que típicamente tienen miles de infrarrojos detectores sensibles 1 , 2, 2) el desarrollo de algoritmos de procesamiento de avanzada y capacidad de cálculo para manejar grandes datos hiperespectrales establece 3, y 3) el modelado de sistemas de imágenes FT-IR para maximizar la resolución espacial de 4,5. Ha habido numerosos alta calidad y muy extensos artículos que analizan el campo de la espectroscopia FT-IR recientemente 6-16, además de un artículo de Nature Protocolos que detalla los pasos para obtener el punto espectros o mapas de los tejidos 17. En este artículo, nos centraremos en la protocol para obtener imágenes de los tejidos utilizando un detector de 128 x 128 FPA en un sistema de FT-IR modificado con capacidades de alta definición. Imágenes FT-IR mucho tiempo se ha sugerido que es una herramienta potencialmente deseables para celular y imágenes de tejidos debido a la capacidad de obtener imágenes en las que cada píxel tiene una gran cantidad de información bioquímica. Formación de imágenes FT-IR se basa en el principio de que diferentes biomoléculas en una muestra absorberán cuantitativamente diferentes regiones del infrarrojo medio; esto permite la derivación de una &quot;huella digital bioquímica &#39;. Esta huella digital había sido demostrado en muchos estudios para alterar entre los diferentes tipos de células y estados de enfermedad. A diferencia de la patología en la práctica convencional, donde las manchas y marcadores inmunohistoquímicos necesitan ser utilizado para visualizar e identificar tipos de células y estructuras de tejido que se utilizan para guiar las opciones de diagnóstico y tratamiento, las imágenes de FT-IR se forman sobre la base de la bioquímica inherente del tejido. El techniq actualue tinción de tejido para el diagnóstico es que consume tiempo, destructivo, laborioso, y requiere experiencia subjetiva del patólogo, mientras que FT-IR ofrece el potencial para hacer de este proceso rápido, no destructivo, altamente automatizada, y más objetiva. Además, FT-IR proporciona una nueva ruta para la obtención de información bioquímica adicional que puede no ser fácilmente accesible a través de técnicas de tinción convencionales. Uno de los avances más emocionantes en los últimos años ha sido la disponibilidad de métodos de formación de imágenes de alta resolución que ahora se puede permitir la visualización y caracterización de los tipos de células y estructuras de tejido que son críticos para el diagnóstico de enfermedades integral. Una de estas técnicas es de reflectancia total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora una lente de inmersión sólido (SIL) de un alto índice de refracción que permite la formación de imágenes de alta resolución 18, con muchos estudios muy interesantes que muestra sus aplicaciones 19-25. Además, wcomo ha demostrado recientemente que el aumento de la resolución espacial asociada con las imágenes de ATR puede permitir la visualización y clasificación de células endoteliales y mioepiteliales en el tejido mamario que forman un componente clave de diagnóstico de cáncer de mama 26. Mientras que las imágenes ATR es muy útil, esta técnica requiere que el SIL para hacer contacto con el tejido para formar imágenes FT-IR; por lo tanto, su uso es algo limitada para patología del tejido donde grandes regiones de tejidos deben ser reflejados rápidamente. Un segundo enfoque se demostró mediante el acoplamiento de un objetivo de gran aumento a un sistema de FT-IR existente que utiliza un sincrotrón como fuente luminosa de IR, es posible iluminar plenamente de FPA y la imagen con un tamaño efectivo de píxel de 0,54 x 0,54 m. Esto permitió a visualizar las estructuras clave en tejidos de mama y de próstata que no se puede resolver utilizando sistemas de FT-IR convencional 4. Si bien estos aumentos dramáticos en la imagen IR resolutio espacialn eran alucinantes, su uso sigue siendo limitado debido a que requiere un sincrotrón. Posteriormente, un sistema óptimo fue diseñado, que también podría permitir capacidades de imagen de alta definición con un tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles sin el requisito de una fuente de sincrotrón, sino más bien el uso de una fuente de IR GLOBAR tradicional 5. En este artículo, mostramos cómo modificar un sistema de imagen existente comercial FT-IR para permitir la difracción de imágenes IR limitado de tejidos con una señal aceptable a ruido utilizando múltiples objetivos IR (15X, 36X, 74X y). El tamaño efectivo de píxeles con los tres objetivos es de 5,5 x 5,5 m (15X), 2,2 x 2,2 m (36X) y 1,1 x 1,1 m (74X). A continuación damos algunos ejemplos de la importancia de los avances en la resolución espacial para la detección de la enfermedad en el hígado y el riñón biopsias 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

De alta definición Transformada de Fourier de infrarrojos (FT-IR) imágenes espectroscópicas es un enfoque emergente para obtener imágenes detalladas que se han asociado información bioquímica. Imágenes FT-IR de tejido se basa en el principio de que las diferentes regiones de las infrarrojo medio son absorbidos por diferentes enlaces químicos (por ejemplo, C = O, CH, NH) dentro de las células o tejidos que luego pueden estar relacionados con la presencia y composición de biomoléculas (por ejemplo, lípidos, DNA, glucógeno, proteínas, colágeno). En una imagen FT-IR, cada píxel dentro de la imagen comprende un espectro de infrarrojos (IR) que puede dar información sobre el estado bioquímico de las células que a continuación pueden ser explotadas para el tipo celular o de tipo enfermedad de clasificación. En este artículo, nos muestran: cómo obtener imágenes infrarrojas de los tejidos humanos utilizando un sistema FT-IR, como modificar la instrumentación existente para permitir capacidades de imagen de alta definición, y cómo visualizar imágenes FT-IR. A continuación, presentamos algunas aplicaciones de FT-IRde la patología utilizando el hígado y el riñón como ejemplos. Imágenes FT-IR tiene aplicaciones interesantes en la prestación de una ruta nueva para obtener información bioquímica de las células y tejidos en una ruta que no cause interferencias enteramente etiqueta-libre hacia dar una nueva visión de los cambios biomoleculares como parte de los procesos de enfermedad. Además, esta información bioquímica potencialmente puede permitir un análisis objetivo y automatizado de ciertos aspectos de diagnóstico de la enfermedad.

Formación de imágenes FT-IR permite la derivación de imágenes IR de tejido que pueden dar diferentes contrastes dependiendo de la frecuencia IR de interés. Además, en una imagen IR, cada píxel se compone de todo el espectro IR, con diferentes picos correspondientes a diferentes biomoléculas que pueden dar información acerca de las propiedades bioquímicas de tipos de células o estados de enfermedad (Figura 1). Aquí, hemos demostrado cómo comparar las firmas espectrales entre las clases, clasificación automatizada sin embargo más avanzado es posible el uso de algoritmos adicionales 3,43-50, como la clasificación bayesiana, Random Forests, Redes Neuronales Artificiales y Análisis Cluster Jerárquico se puede realizar en la datos. Enfoques clasificación supervisada permitirán la construcción de un clasificador que puede ser entrenado para permitir el reconocimiento automático de tipos de células o estados de enfermedad. Enfoques de clasificación no se pueden utilizar para buscar natural difconferencias en el tejido o células debido a la variación de bioquímica. Instrumentación FT-IR ha evolucionado a lo largo de las últimas décadas, a partir de la medición en un punto único modo / mapeo usando IR aberturas opacos a modo de imagen usando objetivos Cassegrain, utilizando un objetivo que ilumina junto con un objetivo recolectar en el modo de transmisión o un solo objetivo que ambos se ilumina y se acumula en-modo de reflexión (Figura 2). Se ha demostrado recientemente que el objetivo recoger en el modo de transmisión podría ser cambiado para un mayor aumento y objetivo numérico de abertura para permitir la formación de imágenes IR de difracción limitada, que conduce a aumentos sustanciales en la resolución espacial de las imágenes IR recogidos 4,5. Los avances en la resolución espacial de las imágenes de tejidos han sido de vital importancia ya que ahora podemos identificar los tipos de células y estructuras de tejido, por ejemplo, las unidades funcionales del riñón, los glomérulos, mediante la adaptación de la casaSistemas de FT-IR (Figura 3). De alta definición de imagen FT-IR permite obtener imágenes más detalladas de los tejidos para ser examinados para identificar las regiones anormales e identificar diferencias bioquímicas entre diferentes tipos de células. En un núcleo de tejido hepático, es posible visualizar los hepatocitos y las regiones de la infiltración de fibrosis que divide dos áreas distintas de la displasia y cirrosis no displásico (Figura 4). Estamos trabajando para explotar este hacia la fabricación de herramientas de diagnóstico automatizados para uso en casos difíciles de enfermedad hepática. Es importante destacar que el aumento de la resolución espacial puede ahora nos permitirá aislar las características estructurales específicas que pueden ser modificados químicamente por la enfermedad antes de los cambios histológicos son evidentes. Por ejemplo, estamos enfocados en la identificación de los cambios bioquímicos en las estructuras glomerulares del riñón como la cápsula de Bowman, mesangio, la membrana basal glomerular y la membrana basal tubular, antes<html> cambios identificados por el patólogo se pueden observar (Figura 5). En particular, estamos interesados ​​en la identificación de los cambios asociados con la progresión de la nefropatía diabética y el rechazo crónico en pacientes trasplantados, donde las técnicas actuales no logran identificar los cambios de una manera lo suficientemente temprano para una intervención exitosa. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figura 1. imágenes FT-IR y el espectro de un núcleo de hígado. Imagen de (A) H &amp; E manchadas núcleo de la biopsia hepática e imágenes de absorbancia IR de la sección de serie del mismo núcleo en (B) 3286 cm -1 y (C) 2603 cm-1, que puso de relieve las diferentes características estructurales. (D) Espectro de IR típico de tejido, con picos importantes rotulados. Barra de escala = 100 micras.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figura 2. Óptica detallan los modos de operación del microscopio FT-IR esquemáticos. (A) En el modo de transmisión, la muestra se ilumina a través del objetivo de fondo, y la luz que pasa a través de la muestra se recoge por el objetivo superior. (B) En el modo de reflexión, el objetivo superior sirve para iluminar la muestra y para recoger la luz reflejada. El objetivo final no se usa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figura 3. Comparación de diferencamisetas objetivos de microscopio en las imágenes FT-IR de un glomérulo renal en 2925 cm -1. (A) 15X objetivas recogiendo con NA = 0,5 (tamaño 5.5 x 5.5 m pixel). (B) 36X objetivo de recogida con NA = 0,5 (tamaño 2.2 x 2.2 m pixel). (C) 74X recogiendo objetivo con NA = 0,65 (tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles). La barra de escala = 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figura 4. diferencias espectrales entre fibrosis y hepatocitos en un núcleo de hígado. (A) H &amp; E manchadas núcleo de biopsia de hígado. (B) Imagen de una sección de núcleo en serie escaneada en FT-IR (36X configuración objetiva). (C) Repespectros repre- de los hepatocitos y fibrosis, tomada desde regiones de tejido indicadas por las flechas en (A) y (B). Barra de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figura 5. Diferenciación de las características de la biopsia de tejido renal mediante el uso de alta definición de imagen FT-IR. (A) sección teñida de ácido periódico de Schiff con las características que se extrae la etiqueta. (B) de alta definición de imagen FT-IR de la región CH 2 estiramiento asimétrico (36X configuración objetiva) de una sección de serie del mismo tejido. (C) Características etiquetado en (A) extraído por medio de la imagen de FT-IR en (B) para poder químicamente differentiate las cuatro características del tejido. La barra de escala = 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Alta definición Fourier Transform Infrared (FT-IR) espectroscópico de imágenes de cortes de tejidos humanos a la mejora de Patología

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.1K vistas.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Frecuencia de imagen óptica de dominio de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Piezas de resección pulmonar: Obtención de One to One de imagen para estudio histopatológico de correlación

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Investigación

Bioingeniería

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Medicina

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mano-tridimensional optoacústica Imaging Sonda de Tejido Profundo Angiografía Humano y Estudios preclínicos funcionales en Tiempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Investigación sobre el cáncer

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

Protocolo de imágenes y caracterización de Terahertz para tumores de cáncer de mama recién extirpados

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Ingeniería

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva,<em&gt; En Vivo</em&gt; Análisis de Tejidos

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo completo para la identificación celular y el análisis metabólico mediante OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: OPTIR-FISH integrado para el análisis metabólico y de identidad de una sola célula en entornos complejos

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Alta definición Fourier Transform Infrared (FT-IR) espectroscópico de imágenes de cortes de tejidos humanos a la mejora de Patología

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