We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. הגדרת FT-IR מיקרוסקופים ורכישת תמונות רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף בלוק קבוע פורמלין המוטבע פרפין רקמה ב 4 מיקרומטר עובי לשקופית תואמת IR באמצעות microtome. לחלופין, סעיף רקמת נוזל חנקן קפוא ב 4 מיקרומטר עובי על שקופית תואמת IR באמצעות cryostat. הערה: בדרך כלל, סעיף סדרתי יהיה גם רכש בשקופית זכוכית ומוכתמת במיוחד (כגון Haematoxylin וEosin (H &amp; E)) או כתם immunohistochemical. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית בשקופיות תואמות IR. שקופיות תואמות IR יכולות להיות שקופיות רעיוני IR עבור הדמיה השתקפות מצב (לדוגמא, שקופיות MirrIR, זהב) או שקופיות שקופות IR עבור הדמיה מצב שידור (למשל, BAF 2, CAF 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את המיקרוסקופ FT-IR וספקטרומטר או באמצעות אוויר יבש או גז חנקן יבש כדי להסיר מים באטמוספרה מהמערכת. חכה לפחות 45 דקות לפני ההדמיה כדי להבטיח purg יסודידואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני הגלאים מגניבים FPA (79 K) וגלאי MCT הפנימי במיקרוסקופ FT-IR באמצעות חנקן נוזלי. לקרר את הגלאים בערך כל שעה 6. זהירות! חנקן נוזלי הוא נוזל קירור ועלול לגרום לכוויות קור, כוויות קור ובמחנק חללים סגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות מדגם על הבמה מיקרוסקופ הדמיה FT-IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא האור הנראה הוא &quot;ON&quot; ולאחר מכן גם באמצעות המשקפת או תכנית לכידת מדגם (המספק בזמן אמת תמונה נראית לעין של הרקמה), תתמקד במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חבילת תוכנת חבילה כגון החלטות פרו ולחץ על &#39;אסוף&#39;, לאחר מכן &#39;אבחון&#39; ולאחר מכן בחר &#39;יישור ספקטרומטר &quot;לחץ. ודא שנתיב הקרן לגלאים הפנימיים ספקטרומטר אינו חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התקנת הדמיה &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;האלקטרוניקה&quot;, בחר &#39;המהירות&#39; המתאימה &#39;, תחת Saיחס mpling (UDR) &#39;ו&#39; הגדרות &#39;מסננים בהתאם למערכת. הערה: בדוגמא זו, ההגדרה היא המהירות = 2.5 KHz, UDR = 4 ומסננים = אין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;אופטיקה&quot; להבטיח כי &quot;מקור Mid-IR &#39;,&#39; צמצם פתוח &#39;ו&#39; מחליש קרן 100% &#39;נבחרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את המערכת, בכרטיסייה &#39;אופטיקה&#39;, &#39;הגלאי&#39; בחר בשם &quot;קרקע&quot;, &quot;מיקרוסקופ גלאי &#39;כ&#39;שמאל&#39;, ולאחר מכן בחרו באפשרות&quot; העברה &quot;או&quot; החזרה &#39;תחת&#39; מצב אופטיקה &#39;בהתאם לסוג של להחליק בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה, שיפתח את החלון &quot;לנסר הבקרה &#39;. הערה: למצב השתקפות לעקוב אחר הוראות ב1.12 1.13 ולמצב שידור לעקוב אחר הוראות ב1.14-1.16. המשך מ1.17 עבור שתי השתקפות והולכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצב השתקפות, וב# 8216; &quot;לחץ על &#39;לנסר בקרת גלם&quot;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. בשלב הבא, להזיז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה. &quot;החום&quot; השינוי והאפשרויות &#39;ניגודיות&#39; כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את ההתמקדות, זה לא יהיו כל השפעה על נתוני IR. המשך מ1.18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצב שידור, בלחיצה &quot;לנסר הבקרה &#39;על&#39; גלם &#39;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את תחתית התמקדות / אובייקטיבי הקבל להגדיל את מספר הספירות לmaximuמ &#39;. צפה בצורה של התמונה הימנית התחתונה בלנסר בקרה כדי להבטיח שזה גאוס במראה ואחיד יחסית. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה. הערה: אם כל הפיקסלים בתמונה interferogram FT-IR להלבין, להפחית את זמן האינטגרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה ולשכלל את המיקוד של התמונה. לחלופין, לשנות את אפשרויות חום ולעומת זאת כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד, אבל לא תהיה כל השפעה על נתוני IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת שלב, לעבור לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור &#39;כייל &quot;. ודא &#39;מחוץ לתחום (Oor)&#39; הערך הוא פחות מ 50 ואת ההבדל בין &#39;הגבוה השטף&#39; והספירות &#39;נמוך Flux &quot;הוא לפחות 4,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;אישור&#39; פעמיים. בכרטיסיות אופטיקה לבחור; &quot;MCT &#39;=&#39; הגלאי &#39;,&#39; Microsלהתמודד ימני &#39;=&#39; הגלאי &#39;ולאחר מכן לחץ על&#39; הגדרות &#39;. בשלב זה לא יהיה interferogram FT-IR על המסך. לחץ על &quot;מצא את Centerburst &#39;. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;אופטיקה&#39;, בחר שוב &#39;קרקע&#39; = &#39;הגלאי&#39;, &#39;מיקרוסקופים גלאי&#39; = &#39;שמאל&#39; ובחר &#39;הגדרות&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלנסר בקרה - להבטיח התמונה עדיין על אזור נקי ו&#39;כיול &#39;לחץ שוב. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לאסוף תמונת FT-IR רקע לתיקון לספיגה מהאווירה, המערכת והשקופיות. עבור לכרטיסייה &#39;האלקטרוניקה&#39; ובחר ברזולוציה הספקטרלית מתאימה, בדרך כלל של 4 סנטימטר -1 או 8 סנטימטר -1 לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית &#39;הרקע&#39; והקלד 128 ב&#39;סריקות לשתף להוסיף &quot;. בחר &#39;הקובץ החדש ... &quot;כפתור ולמקם את קובץ הרקע בקיפול מתאיםאה. בדוק כרטיסייה &#39;ההדמיה&#39; כדי להבטיח mosaicing היא 1 על ידי &#39;רקע&#39; 1. לחץ, לחכות לסריקה לסיים ולאשר היכן לשמור את הקובץ. לחץ על אזור תמונת FT-IR רקע ולבדוק את הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת תמונת פסיפס גדולה של המדגם, בחר בכרטיסייה &#39;ההדמיה&#39; ולהכניס את מספר מסגרות X ו- Y לגודל הפסיפס שברצונך לרכוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;הגדרות&#39; ובלנסר בקרה להשתמש בתצוגה חי IR כדי למצוא את השטח של עניין. אם לוקח בפסיפס, במרכז בשידור החי באמצע השטח של עניין. לחץ על &#39;אוקיי&#39;. עבור לכרטיסייה &#39;האלקטרוניקה&#39; והקלד את מספר הסריקות לשתף להוסיף (בדרך כלל ערך בין 2 ל 16 סריקות לרקמות). לחץ על &quot;סרוק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תמונת FT-IR שנאסף על המסך כדי להבטיח שזה נראה ממוקד. לחץ על התמונה כדי להעלות את ספקטרום IR ממיקום זה ולבדוק שזה נראה לי אות מקובלת על רעש. אקימחדש תמונה נראית לעין של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה ולייצא אותו לפורמט הנדרש, כגון ENVI-IDL. </li></ol> 2. התאמת מיקרוסקופ FT-IR ליכולות גבוהה הגדרה הערה: רוב מערכות FT-IR מצוידות במטרה כ הגדלה 15X ו 0.5 צמצם מספרי (NA). לתמונה במצב בהבחנה גבוהה, IR אובייקטיבי 36x או 74X תואם ניתן להשתמש כדי לתת עקיפת יכולות הדמיה מוגבלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אובייקטיבי 15X של המערכת על-ידי שחרור נגד כיוון השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג באו אובייקטיבי 36x או 74X במקומו. יישר את המטרה לפני השימוש. השתמש בצינורות ארכה העדשה להביא את המטרה קרובה מספיק למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רקמה תחת המטרה החדשה ולהתמקד באמצעות אור נראה או באמצעות המשקפת או תכנית לכידת לדוגמא. הערה: הדמיה גבוהה הגדרה חייב להיעשות במצב שידור. מרחק העבודה קרוב מאוד שליעדי se (1-2 מ&quot;מ) ועומק רדוד מאוד של מוקד דורשים התמקדות לאט ובזהירות, לוקחים זמן להוריד את המטרה בלי לגעת במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר הוראות 1.6-1.11. הערה: בשל היותו באופן משמעותי קשה יותר להתמקד והרבה פחות אור מגיע לגלאי, הפרוטוקול הבא מותאם המבוסס על 1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב שידור, לחץ על &#39;גלם&#39;. באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לרקמות ולהתמקד (באופן אידיאלי על קצה). הערה: זה עלול להיות קשה, ולכן להתאים את &quot;החום&quot; ואפשרויות &#39;ניגודיות&#39; כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד (האפשרויות הללו לא ישפיעו על נתוני IR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתמקד, באמצעות ג&#39;ויסטיק שליטת השלב ומהלך תצוגת IR החי לאזור נקי של השקופית. התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. התאם את תחתית התמקדות אובייקטיבית ללהגדיל את מספר הספירות למקסימום שלה. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם mosaicking תמונה ברזולוציה גבוהה, להתאים את הבמה כדי לאפשר תנועה נכונה הנדרשת על פני מרחקים לmosaicing מדויקת. כדי לשנות את הגדרות מרחק הבמה, ללכת &quot;שלב התקנה &#39;בלנסר בקרה ולהתאים את הגדרות יישור אופקית ואנכיות כדי לאפשר mosaicking הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מהלך ג&#39;ויסטיק שליטת שלב לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור &#39;כייל &quot;. ודאו מטווח ערך (Oor) ​​הוא פחות מ -50 בשני 36x ו74X יעדים. להבטיח את ההבדל בין השטף הגבוה והערכים נמוכים שטף הוא לפחות 1,000 ספירה למטרת 74X ו2,000 ספירה למטרת 36x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך 1.19-1.27. מספר הסריקות ב1.23 ו1.25 יצטרכו להיות מותאמים בשל אות מופחתת בכ -256 סריקות לתמונת הרקע ו16-128 סריקות לתמונת הרקמה. </li></ol> 3. מערכי נתוני Spectral לדמיין סיווג IR הערה: בסעיף זה, נדון כיצד לחזות ולחלץ נתונים מתמונות רפאים באמצעות עיבוד תמונת גיאו-מרחבים וניתוח תוכנה כגון ENVI + IDL, אולם התהליך דומה מאוד לכל תוכנה חלופית כגון MATLAB, תוכנה חופשית כגון CytoSpec , או תוכנה של מפתחי המכשיר. יש כמה טכניקות עיבוד רפאים שונות שניתן לבצע על נתוני IR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד תמונת גיאו-מרחבים פתוח ותוכנה לניתוח ולטעון את קובץ נתוני IR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל אלגוריתם תיקון בסיס לנתונים IR על ידי בחירה &quot;כלים Spectral&quot; ולגלול למטה ולחץ על &quot;ספקטרום ספיג&quot;. שים לב בתפריט מוקפץ ובחר &quot;קור Baselinection &quot; הערה: תיקון Baseline יסיר מדרון לקזז בסיס מנתונים בשל פיזור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע נורמליזציה Spectral, על ידי ratioing נתונים לשיא מסוים רפאים (בדרך כלל אמיד אני (1,650 -1 סנטימטר) או אמיד השני (1,550 -1 סנטימטר)) או באזור תחת אזור מוגדר של הספקטרום. עושה זאת על ידי בחירה באפשרות &quot;רגיל ספקטרום&quot; תחת אפשרויות תפריט &quot;הספיגה ספקטרה&quot;. הערה: הנורמליזציה Spectral מבוצעת כך שהבדלים בספקטרום הבדלים אמיתיים ביוכימי ולא בשל עובי או הבדלי צפיפות בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלגוריתם הפחתת רעש להסיר רעש מהספקטרום אם 28 דרושים. הערה: ישנן גישות זמינות מרובות שבו ניתן להשיג תיקון בסיס, נורמליזציה רפאים והפחתת רעש, עם רוב התוכנות שיש אלגוריתמים אוטומטיים שנבנו בכמו כן, יש מספר עולה של גישות שתתקנה ל.סטיות רפאים, אשר נדונו בפירוט 29-42; עם זאת, הקהילה עדיין אינה מסכימה על איזה מאלה יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב רשימה של כל תדרי IR שנאספו בתוך התמונה (בדרך כלל של טווח ספקטרום 900 ל -4,000 -1 סנטימטר). לחץ על התדרים שמתאימים למולקולות ביולוגיות ספציפיות להתבונן תמונה של הרקמה בתדר שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, לחץ על להקת 1,650 -1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חלבונים במדגם. לחלופין, לחץ על להקת 1,080 -1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חומצות גרעין במדגם. השתמש wavenumber 1,650 -1 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תמונות נוספות על ידי חישוב יחס רפאים שיא גובה, יחסי שיא שטח וכו &#39;שיאפשר להדמיה של רכיבי biomolecular שונים. לחץ על &quot;כלים Spectral &#39;ולאחר מכן בחר&#39; יחסי גובה שיא&quot; או &quot;חישוב שטח תמונה &#39;כדי ליצור תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את סעיף הרקמות הסמוך המקביל שמוכתם באמצעות מערכת תרמי שקופיות שלמה נפרדת שלוכדת תמונות brightfield. לצד תמונת IR, להציג את התמונה הדיגיטלית של הרקמה הצבעונית עם תכנית תמונה גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית על התמונה באזור של עניין ובחר פרופיל Z &quot;. זה ייתן לי המידע ספקטרלי בפיקסל נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל על ספקטרום IR של פיקסלים מרובים מכיתות מרובות, כגון השוואה בין סוגי תאים, מצבי מחלה. פיקסלים מארק ספציפיים בתמונה באמצעות כלי &#39;האזורים של עניין &quot;(ROI). כדי לבצע את זה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר &#39;כלי ROI &quot;. צור כיתות הלהיות מתויגות, למשל נורמלים, דיספלזיה, ושיעורי סרטן. לאחר מכן, בחר, &quot;סוג ROI &#39;-&#39; נקודה &#39;. לאחר מכן בחר את הכיתה כדי לבחור פיקסלים וללצייר על פיקסלים המתאימים בתמונת IR. לגזור את f הספקטרום הממוצעאו כל אחת מכיתות השימוש באפשרות &#39;ROI הממוצע &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו את הספקטרום נגזר על ידי התוויית בתוכנת גרפים. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR הוא שיטה המתעוררות להדמיה ביוכימיים ללא תווית של קטעי רקמה, עם הפוטנציאל יש תפקיד חשוב בשיפור הרמה הנוכחית של אבחון בפתולוגיה. תקן הזהב הנוכחי לפתולוגיה דורש רקמות לביופסיה, קבוע בפורמלין, משובץ בפרפין, מחולק מספר פעמים, ומוכתמות בכתמים מרובים. פתולוג מאומן יש להעריך באופן סובייקטיבי חזותי מבנה הרקמות ומורפולוגיה תאית כדי לקבוע אבחנה. כאן אנו מראים כיצד לאסוף תמונות IR ברזולוציה גבוהה מאותו הסוג של חלקים ודנו בכמה מהגישות חישוביות לבחינת הבדלים כימיים בין סוגי תאים ומצבי מחלה. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם על מנת להבטיח כי הרקמות מתמקדות מאוד בזהירות וכי המערכת מכוילת היטב כדי להבטיח נתונים ספקטרוסקופיות באיכות גבוהה מאוד. הטיפול בעת הגדרת המערכת במיוחד criti<html> cal בעת עבודה עם יעדי ההגדלה גבוהים. כדי לסייע בפתרון בעיות, ברשימה שלהלן מכסה חלק מהקשיים הפוטנציאליים נתקלו; בעיה: עוצמת IR נמוכה כאשר הדמיה בהשתקפות. פתרון: בדוק נטייה שקופיות IR כציפוי רעיוני עשוי להיות בצד הלא נכון של השקופית. בעיה: אות נמוכה / תמרור אזהרה אדומה בלנסר בקרה. פתרון: גלאים מגניבים עם LN2. חנקן נוזלי דרוש לגלאי FPA לתפקד ודורש מעת לעת שעקף את. שגיאות שגיאה / תנועת מהירות: בעיה. פתרון: איפוס ספקטרומטר ולצמצם את התנודות. תנודות יגרמו המראה נע בinterferometer שיפריעו. בעיה: קוצים אדי מים בנתונים. פתרון: להגדיל את הטיהור במערכת ולהגן על מדגם מאוויר. בעיה: centerburst לא חוקי. פתרון: מצא centerburst שוב. e_content &quot;&gt; בעיה:. הבדל שטף נמוך בשידור, למרות שהתמקד פתרון:. התאם הקבל תחתון זה יתרחש כאור IR לא להיות ממוקד לנקודה במדגם. במאמר זה, יש לנו התמקד בשאלה כיצד לרכוש בחדות גבוהה תמונות IR של רקמות באו שידור או מצב transflectance. הטבע של ההדמיה FT-IR, הם שיש שינויים רבים שניתן לעשות לרכישת נתונים, כגון, סוג של מצע, טכניקת קיבוע, עובי מדגם, רזולוציה רפאים, מהירות מראה interferometer וכו &#39;השפעתם של פרמטרים אלה יש נדון בפירוט רב לאחרונה 4,5,17,51. ישנם מספר של שינויים שניתן לעשות במערכת ההדמיה כולל הדמיה במצב 10,24,26 ATR ותוך שימוש בגישות תרמית בקנה מידה ננומטרי 52,53 כדי לאפשר הדמיה IR ברזולוציה גבוהה. המגבלה העיקרית עם ההדמיה IR ברזולוציה גבוהה היא שtiחייב להיות מוכן ssues בזהירות ורזה מספיק IR לעבור (בדרך כלל עובי 4 מיקרומטר). בנוסף, הולכה והחזרת ההדמיה FT-IR דורשת דגימות להיות יבש בשל הספיגה של IR על ידי מים. עם זאת, יש הדמיה FT-IR יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות, בכך שהוא יכול שטחים גדולים מאוד במהירות תמונה של רקמות תוך ביסוס מידע ביוכימי עשיר ומפורט. טכניקות דומות אחרות הנובעות מידע ביוכימיים באופנה ללא תווית כוללות ספקטרוסקופיית ראמאן, אולם בעת רכישת נתונים היא הרבה יותר איטית לרכוש תמונות. גישות הדמיה החדשה ראמאן הם מתעוררים כוללים פיזור ראמאן המאולץ (SRS) ופיזור קוהרנטית Antistokes ראמאן (CARS); עם זאת, יש להם טווח ספקטרום מוגבל גישה או הדמיה תדר אחד. ההתקדמות במהירות של רכישת נתונים, ברזולוציה מרחבית, וזמינות של גישות חישוביות הייתה בעל ערך עצום בקבלת מתאר לעצמי FT-IR<html> ing גישה ריאלי יותר לתרגום ככלי הדמיה חדש בפתולוגיה. ההתקדמות שחלה באחרונה ברזולוציה מרחבית הייתה חשובה במיוחד לפתולוגיה רקמה בשל סוגי תאים עיקריים שאינו פתיר באמצעות מערכות הדמיה FT-IR קונבנציונליות. המאמר האחרון על ידי אל Reddy et. הראה כיצד מודל מערכת אידיאלית להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של מערכת הדמיה FT-IR 5. דוגמא רקמת הכליה שהוצגה במאמר זה מדגימה את החשיבות של החלטות מרחבית גבוהות יותר כדי לחלץ מידע ביוכימיים ממבני גלומרולריות (איור 3 ואיור 5). בעתיד, התקדמות חדשה במקורות אור IR כבהירים מאוד לייזרי אשד קוונטית 54-57, הדמיה 3D רפאים 58, ופריצות דרך בתחום טכנולוגיות ננו IR 52,53,59,60 להחזיק אפיקים חדשים מרגשים של מחקר שעשויה להיות לי השלכות עצומות בעתיד של הדמיה רקמות. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; יש לנו הצגנו דוגמאות ליישומים בכבד ובמחלת כליות שבו יש צורך במידע ביוכימיים נוסף שיכול להיות בעל ערך לאבחון. המעבדה לפתולוגיה Spectral במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו מתמקדת בתרגום של טכנולוגיות ההדמיה IR לשיפור אבחון מחלה ושיפור חיזוי של תוצאת מטופל. ההדמיה FT-IR יכולה להתגבר על חלק מהמגבלות הנוכחיות בפועל פתולוגיה שבו מידע כמותי ואובייקטיבי נדרש. בפרט, עבודה בעתיד מתמקדת בזיהוי התחומים בפועל פתולוגיה הנוכחית שבו טכניקות הנוכחיות אינן מספקות רגישות אבחון נאותה או לספק מידע מוגבל. צורך ברור קיים בשיפור הפרקטיקה הנוכחית של פתולוגיה וכלפי נותן מידע נוסף לפתולוג על מצב המחלה של מטופל, שעשויה להיות בר השגה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה.

ספקטרוסקופיה IR כבר כלי אנליטי זמין בצורה כלשהי מאז 1930; עם זאת, הוא היה רק ​​בתוך העשור האחרון כי השטח של הדמיה רקמות עם FT-IR התפוצץ. ההתקדמות בFT-IR עבור הדמיה רקמות היו מונעת בחלקו גדול על ידי שלוש התפתחויות מרכזיות: 1) מהירות מוגברת של רכישת נתונים בשל הזמינות של מערך מישור מיקוד גדול (FPA) גלאים אשר בדרך כלל יש אלפי גלאים רגישים IR 1 , 2 פיתוח, 2) של אלגוריתמים לעיבוד מתקדמים וכוח חישוב לטיפול בנתונים היפרספקטרלית גדולים קובע 3, ו 3) מודלים של מערכות ההדמיה FT-IR על מנת למקסם את הרזולוציה מרחבית 4,5. יש כבר רב באיכות גבוהה ומאמרים נרחבים מאוד סוקרים תחום ספקטרוסקופיה FT-IR לאחרונה 6-16, בנוסף לנייר טבע פרוטוקולים המפרט את האמצעים לקבלת ספקטרום נקודה או מפות מרקמות 17. במאמר זה, אנו נתמקד בprotocol כדי להשיג תמונות של רקמות באמצעות 128 x 128 גלאים FPA במערכת FT-IR שונה עם יכולות גבוהה הגדרה. ההדמיה FT-IR הוצע ארוכה כדי להיות כלי פוטנציאלי רצוי לתא ורקמת הדמיה בשל היכולת להשיג תמונות שבו כל פיקסל יש שפע של מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR מבוססת על העיקרון שמולקולות ביולוגיים שונות במדגם כמותית לספוג אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום-; זה מאפשר לגזירה של &#39;טביעת אצבע ביוכימי &quot;. טביעת אצבע זה הוכחה במחקרים רבים לשנות בין סוגי תאים שונים ומצבי מחלה. שלא כמו בתרגול פתולוגיה הקונבנציונלי שבו כתמים וסמני immunohistochemical צריכים לשמש כדי לחזות ולזהות סוגי תאים ורקמות מבנים המשמשים כדי להנחות את אפשרויות אבחון וטיפול, התמונות מFT-IR נוצרות מבוססות על ביוכימיה הטבעית של הרקמה. Techniq הנוכחיue של רקמת צביעה לאבחון הוא זמן רב, הרסני, מייגע, ודורש מומחיות הסובייקטיבית של פתולוג, ואילו FT-IR מציע את הפוטנציאל להפוך את התהליך הזה מהיר, שאינו הרסני, מאוד אוטומטי, ואובייקטיבי יותר. בנוסף, FT-IR מציע מסלול חדשני לקבלת מידע ביוכימיים נוסף שעשויות לא להיות נגיש בקלות באמצעות טכניקות צביעה קונבנציונליות. אחד השיפורים המרגשים ביותר בשנים האחרונות היה הזמינות של גישות הדמיה ברזולוציה גבוהות שיכול כעת להרשות להדמיה והאפיון של סוגי תאים ורקמות מבנים שהם קריטיים לאבחון מחלה מקיף. אחת מן הטכניקות הללו הוא מוחלשות סה&quot;כ ההחזרה (ATR) FT-IR אשר משלב עדשה מוצקה טבילה (SIL) של מקדם שבירה גבוהה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה 18, עם מחקרים רבים מראים מאוד מרגשים היישומים שלה 19-25. בנוסף, זה wכפי שהודגם לאחרונה כי הרזולוציה מרחבית המוגברת הדמיה ATR יכולה לאפשר להדמיה והסיווג של אנדותל ותאי myoepithelial ברקמת שד אשר מהווים מרכיב מרכזי באבחון סרטן השד 26. בעוד ההדמיה ATR היא מאוד שימושית, טכניקה זו דורשת SIL ליצור קשר עם הרקמה ליצירת תמונות FT-IR; לכן, השימוש בו מוגבל במידה מסוימת לפתולוגיה הרקמה שבו אזורים גדולים של רקמות חייבים להיות צילמו במהירות. גישה שנייה הודגמה על ידי צימוד אובייקטיבי ההגדלה גבוהה למערכת FT-IR קיים המשתמשת בסינכרוטרון כמקור בהיר של IR, אפשר להאיר באופן מלא FPA ותמונה עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.54 x 0.54 מיקרומטר. זה אפשר לנו לחזות מבנים מרכזיים ברקמות שד וערמונית שאינם פתירה באמצעות מערכות FT-IR קונבנציונליים 4. בעוד עליות הדרמטיות אלה בresolutio המרחבית תמונת IRn היה מרגשים, השימוש בו נותר מוגבל בשל צורך בסינכרוטרון. בהמשך לכך, מערכת אופטימלית תוכננה שיכול גם לאפשר ליכולות גבוהה הגדרת הדמיה עם גודל פיקסל של 1.1 x 1.1 מיקרומטר ללא הדרישה של מקור סינכרוטרון אלא באמצעות מקור IR globar מסורתי 5. במאמר זה, אנו מראים כיצד לשנות מערכת הקיימת מסחרית FT-IR הדמיה כדי לאפשר הדמיה IR המוגבל עקיפה של רקמות עם אות מקובלת על יחס רעש באמצעות יעדים מרובים IR (15X, 36x, ו74X). גודל פיקסל האפקטיבי עם שלוש המטרות הוא 5.5 x 5.5 מיקרומטר (15X), 2.2 x 2.2 מיקרומטר (36x) ו -1.1 x 1.1 מיקרומטר (74X). לאחר מכן, אנו נותנים כמה דוגמאות לחשיבות של הרווחים ברזולוציה מרחבית לגילוי מחלה בביופסיות של כבד וכליות 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) הדמיה ספקטרוסקופיות היא גישה המתעוררות כדי להשיג תמונות מפורטות שקשרו מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR של רקמה מבוססת על העיקרון כי אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום נספגים על ידי קשרים כימיים שונים (לדוגמא, C = O, CH, NH) בתוך תאים או רקמות, כי אז יכול להיות קשורה לנוכחות והרכב של מולקולות ביולוגיות (למשל, שומנים, DNA, גליקוגן, חלבון, קולגן). בתמונת FT-IR, כל פיקסל בתמונה מורכב מספקטרום אינפרא אדום (IR) שלם שיכול לתת מידע על המצב ביוכימי של התאים כי אז יכול להיות מנוצלים לתא מסוג או סיווג מחלה מהסוג. במאמר זה, אנו מציגים: איך להשיג תמונות IR מרקמות אנושיות באמצעות מערכת FT-IR, כיצד לשנות מכשור הקיים, כדי לאפשר יכולות הדמיה בחדות גבוהה, ואיך לדמיין תמונות FT-IR. לאחר מכן, אנו מציגים כמה יישומים של FT-IRלפתולוגיה באמצעות הכבד וכליות כדוגמאות. ההדמיה FT-IR מחזיקה יישומים מרגשים במתן מסלול רומן כדי להשיג מידע ביוכימיים בתאים ורקמות במסלול הלא-perturbing לחלוטין ללא תווית כלפי נותן תובנה חדשה שינויי biomolecular כחלק מתהליכי המחלה. בנוסף, מידע ביוכימי זה עלול לאפשר לניתוח אובייקטיבי ואוטומטי של היבטים מסוימים של אבחון מחלה.

ההדמיה FT-IR מאפשרת הגזירה של תמונות IR של רקמה שיכול לתת לי ניגודים שונים בהתאם לתדר IR של עניין. בנוסף, בתמונת IR, כל פיקסל מורכב מכל קשת IR, עם פסגות שונות המתאימות למולקולות ביולוגיות שונות שיכול לתת מידע על התכונות הביוכימיות של סוגי תאים או מצבי מחלה (איור 1). הנה, יש לנו לראות איך להשוות חתימות רפאים בין מעמדות, סיווג אוטומטי זאת יותר מתקדם אפשרי באמצעות אלגוריתמים נוספים 3,43-50, כגון סיווג בייס, אקראי יערות, ברשתות עצביות מלאכותיות, והיררכי Cluster ניתוח יכול להתבצע על נתונים. גישות סיווג בפיקוח תאפשר לבניית מסווג שניתן לאמן כדי לאפשר להכרה אוטומטית של סוגי תאים או מצבי מחלה. גישות סיווג ללא השגחה יכולות לשמש כדי לחפש באופן טבעי DIFferences ברקמה או תאים עקב שונות ביוכימיים. מכשור FT-IR התפתח במהלך העשורים האחרונים, מהמדידה בנקודה / מצב מיפוי בודד באמצעות פתחים אטומים IR למצב הדמיה באמצעות יעדי Cassegrain, או באמצעות אובייקטיבי מאיר יחד עם מטרת איסוף בשידור-מצב או מטרה אחת כי הן נדלקת ואוסף בהשתקפות של מצב (איור 2). לאחרונה הודגם כי מטרת האיסוף במצב שידור יכולה להיות כיבתה להגדלה גבוהה יותר ואובייקטיבי צמצם מספרי כדי לאפשר הדמיה עקיפה מוגבלת IR, שמובילה לעלייה ניכר ברזולוציה מרחבית של תמונות IR שנאספו 4,5. ההתקדמות ברזולוציה מרחבית להדמית רקמות הייתה חשיבות קריטית כפי שאנו יכולים כעת לזהות סוגי תאים ומבני רקמות, למשל היחידות פונקציונליות של הכליות, glomeruli, באמצעות מותאמת בביתמערכות FT-IR (איור 3). ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה מאפשרת לתמונות מפורטות של רקמות לבדיקה כדי לזהות אזורים חריגים ולזהות הבדלים ביוכימיים בין סוגי תאים שונים. בליבת רקמת כבד, אפשר לדמיין hepatocytes ואזורים של הסתננות סיסטיק שחלק שני תחומים נפרדים של דיספלזיה ושחמת כבד שאינו dysplastic (איור 4). אנחנו עובדים כדי לנצל את זה לקראת ביצוע כלי אבחון אוטומטי לשימוש במקרים קשים של מחלת כבד. חשוב לציין, ברזולוציה מרחבית המוגברת יכולה כעת מאפשרת לנו לבודד את התכונות מבניות ספציפיות שעשויים להיות שינוי כימי במחלה לפני שינויים היסטולוגית ניכרים. לדוגמא, אנו מתמקדים בזיהוי שינויים ביוכימיים במבני גלומרולרי הכליות כגון כמוסה של באומן, מזנגיום, קרום במרתף גלומרולרי וקרום במרתף צינורי, לפני<html> שינויים שזוהו על ידי פתולוג ניתן לצפות (איור 5). בפרט, אנו מעוניינים בזיהוי שינויים הקשורים להתקדמות נפרופתיה סוכרתית ודחייה כרונית בחולים שעבר השתלה, שבו טכניקות הנוכחיות אינן מצליחות לזהות שינויים באופנה מספיק מוקדם להתערבות מוצלחת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> איור 1. תמונות FT-IR וקשת מליבה כבד. תמונה של (A) H &amp; E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד ותמונות של ספיגת IR סעיף סדרתי של אותה הליבה ב( B) 3286 -1 סנטימטר ו- (ג) 2,603 -1 סנטימטר, אשר הדגיש תכונות מבניות שונות. ספקטרום IR אופייני של רקמה (ד &#39;), עם פסגות חשובות שכותרת. בר סולם = 100 מיקרומטר.&quot;Target =&quot; fig1large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> איור אופטיקה 2. מצבי פעולה סכמטית המפרטים מיקרוסקופ FT-IR. (א) במצב הולכה, המדגם מואר דרך האובייקטיבית התחתון, והאור עובר דרך הדגימה שנאסף על ידי המטרה העליונה. (ב) במצב השתקפות, המטרה העליונה משמשת גם כדי להאיר את המדגם ולאסוף את האור מוחזר. המטרה התחתונה היא לא בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> איור 3. השוואה של בידוליעדי t מיקרוסקופ על תמונות FT-IR של glomerulus כליות ב2,925 -1 סנטימטר. מטרה () 15X איסוף עם NA = 0.5 (גודל 5.5 x 5.5 מיקרומטר פיקסל). אובייקטיבי (B) 36x איסוף עם NA = 0.5 (גודל 2.2 x 2.2 מיקרומטר פיקסל). (C) 74X איסוף אובייקטיבי עם NA = 0.65 (גודל 1.1 x 1.1 מיקרומטר פיקסל). בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> איור 4. הבדלים בין Spectral סיסטיק וhepatocytes בליבה כבד. (א) H &amp; E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד. (ב) תמונה של ליבה סידורי סעיף הסרוק בFT-IR (הגדרה אובייקטיבית 36x). (ג) נציגספקטרום resentative של hepatocytes וסיסטיק, שנלקח מהאזורים של רקמה מסומנת בחצים ב (א) ו- (ב). סרגל = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> בידול איור 5. תכונות ביופסית רקמת הכליה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה. סעיף (א) תקופתי חומצה שיף מוכתם בתכונות להיעקר שכותרת. High-Definition תמונת FT-IR של 2 אזור CH סימטרי המתיחה (36x הגדרה אובייקטיבית) של סעיף סדרתי של אותה הרקמה (B). (C) תכונות שכותרתו ב() הופק באמצעות תמונת FT-IR ב( B) כדי להיות מסוגל כימי DIFferentiate ארבע התכונות של הרקמות. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology at JoVE.com

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) Spectroscopic הדמיה של סעיפים רקמה אנושיים לשיפור פתולוגיה

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

high-definition-fourier-transform-infrared-ft-ir-spectroscopic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Medicine

Unit 1

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

z-Transform

SCIENTISTS IN ACTION

33.1K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

הדמיה אופטית של תחום תדר<em&gt; גופיים</em&gt; דוגמאות כריתת ריאה: קבלת תמונה אחד לאחד למתאם היסטופתולוגיה

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Bioengineering

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

יוניברסל כף היד תלת ממדי Optoacoustic הדמיה בדיקה לרקמות עמוקות אנגיוגרפיה אדם ופונקציונליים פרה-קליניים מחקרים בזמן אמת

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Cancer Research

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

הדמיה של terahertz ליצירת פרוטוקול עבור גידולים בסרטן השד הטריים

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Engineering

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

הדמיה מולטימודליות וספקטרוסקופיה סיבים צרור פלטפורמת Microendoscopy עבור לא פולשני,<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקת רקמות

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

הדמיה תלת מימדית של רקמה נושאת גידול באמצעות הלבנה איטרטיבית מרחיבה את גישת המולטיפלקסיות

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מקיף לזיהוי תאים וניתוח מטבולי באמצעות OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: OPTIR-FISH משולב לניתוח מטבולי וזהות של תא בודד בסביבות מורכבות

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

הכלאה פוטותרמית אופטית אינפרא אדום-פלואורסצנטי באתרו (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) Spectroscopic הדמיה של סעיפים רקמה אנושיים לשיפור פתולוגיה

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST