We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. Criação de um FT-IR Microscópio e Aquisição de Tecidos Images <ol><li> Seção de um bloco fixado em formol tecido embebido em parafina em 4 mm de espessura para um slide de IR compatível usando um micrótomo. Como alternativa, uma seção de nitrogênio tecido congelado líquido a 4 mm de espessura para um diapositivo compatível IR usando um criostato. NOTA: Normalmente, uma seção de série também será adquirido em uma lâmina de vidro e corados com uma especial (como Hematoxilina e Eosina (H &amp; E)) ou coloração imuno-histoquímica. Além disso, as linhas de células em cultura pode ser crescida em lâminas compatíveis IR. Lâminas compatíveis IR pode ser lâminas reflexivas IR para modo de imagem reflexão (por exemplo, MirrIR slide, ouro) ou IR lâminas transparentes para o modo de transmissão de imagem (por exemplo, BaF 2, CaF 2). </li><li> Purga-se o microscópio de FT-IR utilizando um espectrómetro e ar seco ou azoto seco para remover a água da atmosfera a partir do sistema. Espere pelo menos 45 minutos antes de imagem para garantir uma completa Purge. </li><li> Arrefecer tanto o detector FPA (a 79 K) e o detector de TMC interno no microscópio de FT-IR utilizando azoto líquido. Arrefecer os detectores de aproximadamente a cada 6 horas. CUIDADO! O nitrogênio líquido é um fluido criogênico e pode causar queimaduras de frio, queimaduras e em espaços fechados asfixia. </li><li> Montar a lâmina amostra na platina do microscópio para a imagiologia de FT-IR. </li><li> Garantir a luz visível é &quot;ON&quot; e em seguida, usando os binóculos ou o programa de captura de amostra (que fornece uma imagem em tempo real visível do tecido), concentrar-se na amostra. </li><li> Abra o pacote de software pacote, tais como resoluções pró e clique em &quot;Collect&quot;, depois clique em &quot;Diagnóstico&quot; e, em seguida, selecione &quot;Align Spectrometer&quot;. Certifique-se de que o caminho do feixe ao detector interno espectrômetro não está obstruído. </li><li> Clique em &quot;Configuração de Imagem &#39;. </li><li> Na aba &#39;Eletrônica&#39;, selecione a opção &#39;Speed&#39; adequado, &#39;Under SaRácio mpling (UDR) &#39;e&#39; configurações &#39;Filtros, dependendo do sistema. NOTA: Neste exemplo, o cenário é Velocidade = 2,5 KHz, UDR = 4 e Filtros = None. </li><li> Na aba &#39;Optics&#39; garantir que «fonte Mid-IR &#39;,&#39; Open abertura&quot; e &quot;100% atenuador feixe &#39;são selecionados. </li><li> Para calibrar o sistema, no separador &quot;Optics&quot;, selecione &quot;Detector &#39;como&#39; terra &#39;,&#39; Microscópio Detector &#39;como&#39; Esquerda &#39;, e, em seguida, selecione&#39; Transmitância &#39;ou&#39; Reflectance&quot; em &quot;modo de Óptica&quot;, dependendo do tipo de deslizar a ser utilizado. </li><li> Clique em Configurar, que vai abrir a janela &quot;Controle Lancer &#39;. NOTA: Para o modo de reflexão seguir as instruções em 1,12 e 1,13 e para o modo de transmissão de seguir as instruções em 1,14-1,16. Continue de 1,17 tanto para reflexão e transmissão. </li><li> Para o modo de reflexão, no &amp;# 8216; &#39;clique em&#39; Control Lancer Raw &#39;. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), se deslocar para uma área limpa no slide. </li><li> Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens. Em seguida, a fase de mover-se para encontrar um pedaço de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido, e aperfeiçoar a focagem da imagem. Opções &#39;Contraste&#39; para ajudar a formar uma imagem para melhorar focando Change &#39;calor&#39; e, este não terá nenhum efeito sobre os dados IR. Continue a partir de 1,18. </li><li> Para o modo de transmissão, clique &#39;Control Lancer&#39; on &#39;Raw&#39;. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), se deslocar para uma área limpa do slide. </li><li> Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens. </li><li> Ajustar o objectivo de focagem inferior / condensador para aumentar o número de contagens para a sua maximum. Assista a forma da imagem inferior direito no controle Lancer para garantir que ele é Gaussian na aparência e relativamente uniforme. Ajuste o tempo de integração novamente para aproximadamente 8.000 contagens. NOTA: Se algum dos pixels na imagem interferogram o FT-IR virar branco, reduzir o tempo de integração. </li><li> Mover a etapa de encontrar uma peça de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido e aperfeiçoar a focagem da imagem. Opcionalmente, altere as opções de calor e de contraste para ajudar a formar uma imagem para melhorar a focalização, mas não terá nenhum efeito sobre os dados IR. </li><li> Usando o joystick de controle fase, passar para uma área limpa do slide. Pressione o botão &quot;Calibrar&quot;. Verifique se o &#39;Out Of Range (OOR)&#39; valor é inferior a 50 e a diferença entre o &#39;High Flux&#39; e conta &#39;Low Flux &quot;é, no mínimo, 4.000 contagens. </li><li> Selecione &quot;OK&quot; duas vezes. Nos guias óptica selecionar; &#39;MCT&#39; &#39;detector&#39; = &#39;Microslidar Detector &#39;=&#39; direita &#39;e, em seguida, clique em &quot;Setup&quot;. Neste ponto, haverá uma interferogram FT-IR na tela. Clique em &quot;Localizar Centerburst &#39;. Clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Na aba &quot;Optics&quot;, selecione novamente &#39;detector&#39; = &#39;Ground&#39;, &#39;Microscópio Detector&#39; = &quot;Esquerda&quot; e selecione &quot;Setup&quot;. </li><li> In Control Lancer - garantir que a imagem ainda está em uma área limpa e clicar em &#39;Calibrar&#39; novamente. Clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Em seguida, recolher imagem de FT-IR um fundo para corrigir a absorvância a partir da atmosfera, e sistema de corrediça. Vá até a aba &#39;Eletrônica&#39; e selecione uma resolução espectral adequado, tipicamente de 4 cm-1 ou 8 centímetros -1 para tecido. </li><li> Vá para a aba &quot;fundo&quot; e digite 128 em &#39;Scans para co-adicionar&#39;. Selecione a opção &quot;New File ...&quot; botão e coloque o arquivo de fundo em dobra apropriadoer. Confira a página &#39;Imagem&#39; para garantir mosaicing é um por 1. Clique em &quot;fundo&quot;, aguarde a verificação para terminar e confirmar o local para salvar o arquivo. Clique em uma região na imagem FT-IR de fundo e verificar o espectro. </li><li> Para ter uma imagem grande mosaico da amostra, selecione a guia &#39;Imagem&#39; e insira o número de quadros X e Y para o tamanho do mosaico você deseja adquirir. </li><li> Clique em &quot;Setup&quot; e no controle Lancer usar a exibição de IR ao vivo para encontrar a área de interesse. Se tomar um mosaico, centralizar a transmissão ao vivo no meio da área de interesse. Clique em &quot;Ok&quot;. Vá até a aba &#39;Eletrônica&#39; e digite o número de scans para co-add (normalmente um valor entre 2 e 16 scans para o tecido). Clique em &#39;Scan&#39;. </li><li> Verifique a imagem FT-IR recolhido na tela para garantir que parece focada. Clique na imagem para abrir um espectro de IR a partir desse local e verificar que ele parece ter um sinal aceitável ao ruído. Acquire uma imagem visível da amostra. </li><li> Salve a imagem e exportá-lo para o formato exigido, como ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adaptar um Microscópio FT-IR para capacidades de alta definição NOTA: A maioria dos sistemas FT-IR são equipados com uma ampliação de 15x objetivo aproximadamente 0,5 e abertura numérica (NA). Para a imagem no modo de alta definição, uma IR compatível 36X ou 74x objectivo pode ser usado para dar difração capacidades de imagem limitadas. <ol><li> Retirar objetivo 15X do sistema, desapertando sentido anti-horário. </li><li> Aparafusar a objectiva 36X ou 74x em seu lugar. Alinhar o objectivo antes da utilização. Utilize tubos de extensão da lente para trazer o suficiente o objectivo perto da amostra. </li><li> Coloque o tecido sob o novo objetivo e foco usando a luz visível usando as binóculos ou programa Capture Sample. NOTA: Imagens de alta definição deve ser feita em modo de transmissão. A distância de trabalho muito próximo doobjetivos SE (1-2 mm) e muito pouca profundidade de foco requer focando devagar e com cuidado, tendo tempo para diminuir o objetivo sem tocar na amostra. </li><li> Siga as instruções de 1,6-1,11. NOTA: Devido a ser significativamente mais difícil de se concentrar e muito menos luz que atinge o detector, o protocolo seguinte é ajustada com base em 1,14. </li><li> No modo de transmissão, clique em &#39;Raw&#39;. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), passar para o tecido e foco (de preferência em uma borda). NOTA: Isso pode ser difícil, por ajustar o &#39;calor&#39; e opções &#39;Contraste&#39; para ajudar a formar uma imagem para melhorar a focalização (essas opções não afetam os dados IR). </li><li> Uma vez que o foco, usando o joystick controle do estágio ea vista IR movimento ao vivo para uma área limpa do slide. Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens. Ajuste o fundo com foco objetivoaumentar o número de contagens para o seu máximo. Ajuste o tempo de integração novamente para aproximadamente 8.000 contagens. </li><li> Mover a etapa de encontrar uma peça de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido, e aperfeiçoar a focagem da imagem. </li><li> Se mosaicagem uma imagem em alta resolução, ajustar o estágio para permitir o movimento correto necessário através de distâncias para mosaicing preciso. Para alterar as configurações de distância do palco, ir a &#39;fase Setup&#39; em Controle Lancer e ajustar as configurações de alinhamento horizontal e vertical para permitir mosaicking correta. </li><li> Usando o movimento joystick controle palco para uma área limpa do slide. Pressione o botão &quot;Calibrar&quot;. Verifique se o valor fora do intervalo (OOR) é inferior a 50, tanto para 36X e 74x objetivos. Garantir a diferença entre o alto fluxo e baixos valores de fluxo é, pelo menos, 1.000 contagens para o objetivo 74x e 2.000 contagens para o objetivo 36X. </li><li> Continue 1,19-1,27. O número de scans em 1,23 e1.25 terá de ser ajustado em função de sinal reduzido para aproximadamente 256 varreduras para a imagem de fundo e 16-128 scans imagem do tecido para. </li></ol> 3. visualizar e Classificando IR espectrais conjuntos de dados NOTA: Nesta seção, vamos discutir a forma de visualizar e extrair dados de imagens espectrais usando processamento de imagens geoespaciais e análise de software, tais como ENVI + IDL, no entanto, o processo é muito semelhante para qualquer software alternativo, como MATLAB, software livre, como CytoSpec ou o próprio software do desenvolvedor instrumento. Existem algumas técnicas de processamento espectral diferentes que podem ser realizados sobre os dados de IV. <ol><li> Abrir o processamento de imagens geoespaciais e software de análise e carregar o arquivo de dados IR. </li><li> Aplicar um algoritmo de correção de linha de base para os dados do IR, selecionando &quot;Ferramentas espectral&quot; e role a página e clique em &quot;espectros Absorbance&quot;. Observar um menu pop-up e selecione &quot;linha de base correcção &quot; NOTA: correção de linha de base irá remover uma inclinação deslocamento da linha de base a partir dos dados devido à dispersão </li><li> Realizar normalização espectral, por ratioing os dados para uma determinada pico espectral (tipicamente de Amida I (1,650 centímetros -1) ou Amida II (1550 centímetros -1)) ou área sob uma região definida dos espectros. Faça isso selecionando &quot;espectros Normal&quot; sob o título &quot;Absorbance Spectra&quot; opções de menu. NOTA: Spectral normalização é realizada para que as eventuais diferenças de espectros são verdadeiras diferenças bioquímicas e não devido à espessura ou diferenças de densidade entre as amostras. </li><li> Use um algoritmo de redução de ruído para remover o ruído a partir dos espectros se necessário 28. NOTA: Existem várias formas de tratamento disponíveis, através da qual a correção de linha de base, a normalização espectral e redução de ruído pode ser alcançado, com a maioria dos softwares de ter algoritmos automáticos construídos em Além disso, há um número emergente de abordagens que irão corrigir para.aberrações espectrais, que foram discutidas em detalhe 29-42; No entanto, a comunidade ainda não concordam em que estes elementos são necessários. </li><li> Observar uma lista de todas as frequências RI recolhidos no interior da imagem (tipicamente de um intervalo espectral de 900 a 4.000 cm-1). Clique sobre as frequências que correspondem a biomoléculas específicas para observar uma imagem do tecido para a frequência seleccionada. <ol><li> Por exemplo, clique na banda de 1650 centímetros -1 para observar a distribuição de proteínas na amostra. Alternativamente clique na banda de 1080 centímetros -1 para observar a distribuição de ácidos nucleicos na amostra. Use wavenumber 1650 centímetros -1. </li></ol></li><li> Criar imagens adicionais por computação rácios espectral de pico altura, proporções de áreas de pico, etc., que permitam a visualização dos diferentes componentes biomoleculares. Clique em &#39;Ferramentas&#39; e espectrais em seguida, selecione &quot;Rácios altura do pico&quot; ou &quot;calcular a área de Imagem &#39;para criar imagens. </li><li> Digitalizar o corte de tecido adjacente correspondente que está manchado usando um sistema de slides imager todo separado que captura imagens de campo claro. A imagem IR Ao lado, trazer a imagem digital do tecido manchado com um programa de imagem visível. </li><li> Botão direito do mouse sobre a imagem em uma região de interesse e selecione o perfil Z &#39;. Isso dará a informação espectral no pixel selecionado. </li><li> Veja o espectros IR de vários pixels de várias classes, tais como comparando os tipos de células, estados de doença. Marcar pixels específicas sobre a imagem usando o &#39;regiões de interesse&#39; (ROI) da ferramenta. Para realizar isso, clique direito sobre a imagem e selecione &quot;ferramenta ROI&quot;. Criar as classes que devem ser rotulados, por exemplo normal, displasia, e aulas de câncer. Em seguida, selecione &quot;Tipo de ROI &#39;-&#39; Point &#39;. Em seguida, selecione a classe para selecionar pixels para e desenhar sobre os pixels adequadas a imagem IR diante. Derivar a média espectros fou cada uma das classes que usam a ferramenta &#39;ROI médio&#39;. </li><li> Compare espectros obtidos por plotagem em software gráfico. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR é uma modalidade emergente de livre-label imaging bioquímica de cortes de tecidos, com o potencial de ter um papel importante na melhoria do padrão atual de diagnóstico em patologia. O padrão ouro atual para a patologia requer tecidos para a biópsia, fixados em formol, embebidos em parafina, seccionados várias vezes, e corados com várias manchas. Um patologista altamente treinados tem de avaliar subjetivamente visualmente a estrutura do tecido e morfologia celular, para determinar um diagnóstico. Aqui nós mostramos como coletar imagens de infravermelho de alta resolução a partir do mesmo tipo de seções e discutir algumas das abordagens computacionais para examinar as diferenças químicas entre os tipos de células e estados de doença. Os passos críticos dentro deste protocolo são para garantir que os tecidos são muito cuidadosamente focado e que o sistema está bem calibrado para garantir que os dados espectroscópicos de qualidade muito elevada. O cuidado ao configurar o sistema é particularmente criti<html> cal quando se trabalha com objetivos de alta ampliação. Para ajudar na solução de problemas, a seguinte lista abrange alguns dos potenciais dificuldades encontradas; Problema: intensidade IR Low na obtenção de imagens em reflexão. Solução: Verifique IR orientação slide como o revestimento reflexivo pode estar no lado errado do slide. Problema: Baixo sinal de aviso / Red em Controle Lancer. Solução: detectores de frescos com LN2. O nitrogênio líquido é necessário para os detectores FPA para funcionar e requer periodicamente sendo tampo. Erros de erro / movimento Velocity: problema. Solução: Repor espectrômetro e reduzir as vibrações. Vibrations fará com que o espelho se movendo no interferômetro de ser perturbado. Problema: spikes vapor de água na dados. Solução: Aumentar a purga no sistema e proteger amostra de ar. Problema: centerburst inválido. Solução: Encontre centerburst novamente. e_content &quot;&gt; Problema:. diferença Baixo fluxo de transmissão, embora focado. Solução: Ajuste condensador inferior Isso ocorrerá quando a luz IR não está sendo focado para um ponto na amostra. Neste trabalho, temos nos concentrado em como adquirir imagens de alta definição de IR de tecidos em qualquer modo de transmissão ou de transflectância. A natureza das imagens de FT-IR, é que existem várias modificações que podem ser feitas para a aquisição de dados, tais como, o tipo de substrato, técnica de fixação, espessura da amostra, a resolução espectral, interferômetro velocidade espelho etc. O efeito desses parâmetros possui foi discutido em grande detalhe recentemente 4,5,17,51. Há uma série de modificações que podem ser feitas para o sistema de imagem, incluindo imagens no modo ATR 10,24,26 e usando abordagens térmicas nanoescala 52,53 para permitir imagens de alta resolução IR. A principal limitação com alta resolução de imagem IR é que a tissues deve ser cuidadosamente preparada e fino o suficiente para IR de passar por (tipicamente 4 espessura mm). Além disso, a transmissão e reflectância de imagem de FT-IR requer as amostras a ser seca, devido à absorção de IV, pela água. No entanto, a imagem de FT-IR tem vantagens significativas sobre outras técnicas, em que ele pode rapidamente grandes áreas de imagem de tecido, enquanto que derivam informação bioquímica rico e detalhado. Outras técnicas similares que derivam informação bioquímica de uma forma livre de marcador incluem a espectroscopia de Raman, no entanto, o tempo de aquisição de dados é muito mais lento para aquisição de imagens. Abordagens de imagem New Raman estão surgindo incluindo Stimulated Raman (SRS) e coerente Antistokes espalhamento Raman (CARS); no entanto, eles têm acesso à gama espectral limitada ou de imagem de uma única frequência. Os avanços na velocidade de aquisição de dados, resolução espacial, e disponibilidade de abordagens computacionais têm sido de enorme valor na tomada de imag FT-IRing uma abordagem mais viável para a tradução como uma nova ferramenta de imagem na patologia. Os recentes avanços na resolução espacial têm sido particularmente importante para a patologia do tecido devido à tipos de células-chave não sendo resolvido usando sistemas de imagem FT-IR convencionais. O artigo recente de Reddy et al. mostrou como modelar um sistema ideal para obter a resolução espacial óptima de um sistema de imagem de FT-IR 5. O exemplo de tecido renal apresentada neste artigo demonstra a importância de resoluções espaciais mais altas a fim de extrair informação bioquímica de estruturas glomerular (Figura 3 e Figura 5). No futuro, os novos avanços em Quantum Cascade Lasers fontes de luz IR como muito brilhantes 54-57, 3D imagem espectral 58, e avanços no campo das tecnologias em nanoescala IR 52,53,59,60 realizar novos caminhos de pesquisa que podem ter grandes implicações para o futuro da imagem do tecido. <p clburro = &quot;jove_content&quot;&gt; Nós apresentamos exemplos de aplicações em fígado e doença renal, onde há uma necessidade de informação bioquímica adicional que pode ser de valor diagnóstico. O Spectral Patologia Laboratório do Departamento de Patologia da Universidade de Illinois em Chicago é focada na tradução de tecnologias de imagem IR no sentido de melhorar o diagnóstico da doença e melhorou a previsão de evolução de pacientes. Imaging FT-IR pode superar algumas das limitações atuais na prática patologia onde a informação quantitativa e objetiva é necessária. Em particular, o trabalho futuro está focada na identificação de áreas em prática patologia atual em que as técnicas atuais não fornecem sensibilidade diagnóstica adequada ou fornecer informações limitadas. Existe uma clara necessidade em melhorar a prática atual de patologia e no sentido de dar mais informações para o patologista sobre o estado de doença de um paciente, que pode ser obtida através de alta definição de imagem FT-IR.

Espectroscopia no infravermelho tem sido uma ferramenta analítica disponível de alguma forma desde a década de 1930; no entanto, é apenas sido na última década que a área da imagiologia tecido com FT-IR explodiu. Os avanços na FT-IR para imagens de tecidos têm sido impulsionado em grande parte por três desenvolvimentos principais: 1) aumento da velocidade de aquisição de dados, devido à disponibilidade de grande matriz de plano focal (FPA) detectores que tipicamente têm milhares de detectores sensíveis IR 1 , 2, 2) desenvolvimento de algoritmos de processamento avançados e poder computacional para lidar com grandes volumes de dados hiperespectrais define 3, e 3) a modelagem de sistemas de imagens FT-IR para maximizar a resolução espacial de 4,5. Houve inúmeros alta qualidade e muito extensos artigos de revisão no campo da espectroscopia FT-IR recentemente 6-16, além de um artigo da Nature Protocols que detalha as etapas para a obtenção de espectros de ponto ou mapas a partir de tecidos 17. Neste artigo, vamos nos concentrar no protOCOL a obtenção de imagens de tecidos, utilizando um detector de 128 x 128 FPA num sistema de FT-IR modificado com capacidades de alta definição. Imagiologia de FT-IV tem sido sugerida como um instrumento potencialmente desejável para a célula e imagiologia do tecido devido à capacidade de obtenção de imagens, em que cada pixel tem uma riqueza de informação bioquímica. FT-IR de imagem baseia-se no princípio de que em diferentes biomoléculas de uma amostra irá absorver quantitativamente diferentes regiões do infravermelho médio; isto permite a derivação de uma &quot;impressão digital bioquímica &#39;. Esta impressão digital tinha sido demonstrado em vários estudos para alterar entre diferentes tipos de células e estados de doença. Ao contrário da prática convencional, em que a patologia manchas de imuno-histoquímica e marcadores necessitam de ser utilizada para visualizar e identificar os tipos de células e estruturas de tecidos que são utilizados para guiar as possibilidades de diagnóstico e tratamento, as imagens de FT-IR são formados com base na bioquímica inerente do tecido. O techniq atualue de tecido de coloração para o diagnóstico é demorado, destrutivo, trabalhoso e requer experiência subjetiva do patologista, enquanto FT-IR oferece o potencial para tornar esse processo rápido, não destrutivo, altamente automatizado, e mais objetiva. Além disso, FT-IR proporciona uma nova via para a obtenção de informação bioquímica adicional que pode não estar prontamente acessíveis usando técnicas de coloração convencionais. Um dos avanços mais excitantes nos últimos anos tem sido a disponibilidade de métodos de imagem de alta resolução que podem agora permitem a visualização e caracterização dos tipos de células e estruturas de tecidos que são críticos para o diagnóstico de doença global. Uma dessas técnicas é a reflectância total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora uma lente de imersão em sólido (SIL) de um índice de refracção elevado, que permite a alta resolução de imagem 18, com os diversos estudos muito interessantes mostrando as suas aplicações 19-25. Além disso, wcomo recentemente demonstrado que o aumento da resolução espacial associado com ATR imagem pode permitir a visualização e classificação de células endoteliais e mioepiteliais no tecido mamário que formam um componente-chave do diagnóstico de câncer de mama 26. Enquanto ATR imagem é muito útil, esta técnica requer o SIL para fazer contato com o tecido para formar imagens FT-IR; portanto, seu uso é um pouco limitado para a patologia do tecido onde grandes regiões de tecidos devem ser rapidamente trabalhada. Uma segunda abordagem foi demonstrada por acoplamento de um objectivo de grande ampliação de um sistema de FT-IR existente que usa um sincrotrão como uma fonte luminosa de infravermelhos, é possível iluminar completamente FPA e uma imagem com um tamanho efectivo de pixels de 0,54 x 0,54 mm. Isto permitiu-nos visualizar estruturas-chave em tecidos da mama e da próstata que não foram resolvido utilizando sistemas de 4 FT-IR convencionais. Embora estes aumentos dramáticos na imagem IR resolutio espacialn foram emocionantes, a sua utilização permaneceu limitada devido à necessidade de um síncrotron. Posteriormente, um sistema ótimo foi projetado que poderia permitir também a capacidade de imagem de alta definição com um tamanho de pixel de 1,1 x 1,1 mm, sem a exigência de uma fonte síncrotron, mas sim através de uma fonte IR globar tradicional 5. Neste artigo, vamos mostrar como modificar um sistema de imagem existente comercial FT-IR para permitir a difração de IR limitada imagem de tecidos com um sinal aceitável para ruído utilizando múltiplos objetivos IR (15X, 36X, e 74x). O tamanho efectivo de pixels com os três objectivos é de 5,5 x 5,5 mm (15X), 2.2 x 2.2 mm (36X) e 1,1 x 1,1 mm (74x). Nós, então, dar alguns exemplos da importância dos ganhos de resolução espacial para a detecção de doenças no fígado e rins 27 biópsias.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) imagens espectroscópicas é uma abordagem emergente para obter imagens detalhadas que associou informação bioquímica. Imagiologia de FT-IR de tecido é baseado no princípio de que as diferentes regiões do infravermelho médio são absorvidos por ligações químicas diferentes (por exemplo, C = O, CH, NH) no interior das células ou tecidos, que pode então ser relacionados com a presença e composição de biomoléculas (por exemplo, lípidos, ADN, glicogénio, a proteína, o colagénio). Em uma imagem de FT-IR, cada pixel na imagem compreende todo um espectro de infravermelhos (IV) que pode dar informação sobre o estado bioquímico das células que podem então ser exploradas para o tipo de célula ou tipo-classificação da doença. Neste artigo, vamos mostrar: como obter imagens IR a partir de tecidos humanos, por meio de um sistema de FT-IR, como modificar a instrumentação existente para permitir capacidades de imagem de alta definição, e como visualizar imagens FT-IR. Em seguida, apresentamos algumas aplicações de FT-IRpara patologia usando o fígado e rim como exemplos. Imaging FT-IR detém aplicações interessantes em proporcionar uma nova rota para obter informações bioquímica das células e tecidos em uma rota não perturbando inteiramente livre-label no sentido de dar uma nova visão sobre mudanças biomoleculares como parte de processos de doença. Além disso, esta informação bioquímica pode potencialmente permitir a análise objectiva e automatizada de certos aspectos de diagnóstico da doença.

Imaging FT-IR permite a derivação de imagens IR de tecido que podem dar diferentes contrastes, dependendo da freqüência IR de interesse. Além disso, uma imagem em infravermelhos, a cada pixel compreende todo o espectro de IV, com diferentes picos correspondentes aos diferentes biomoléculas que pode dar informação sobre as propriedades bioquímicas dos tipos de células ou em estados de doença (Figura 1). Aqui, nós mostramos como comparar assinaturas espectrais entre as classes, classificação automática no entanto mais avançada é possível usando algoritmos adicionais 3,43-50, como a classificação bayesiana, aleatórios Florestas, Redes Neurais Artificiais, e Hierarchal Análise Cluster pode ser realizada no dados. Abordagens de classificação supervisionada permitirá a construção de um classificador que pode ser formado para permitir o reconhecimento automático dos tipos de células ou em estados de doença. Abordagens classificação não-supervisionada pode ser usado para procurar dif que ocorre naturalmenteconferências em tecido ou células, devido à variação bioquímicos. Instrumentação FT-IR tem evoluído ao longo das últimas décadas, a partir da medição de um modo único ponto / mapeamento usando IR aberturas opacas para o modo de imagem usando objetivos Cassegrain, usando um objetivo iluminando juntamente com um objetivo coletar em modo de transmissão ou de um único objetivo que tanto ilumina e recolhe-em modo de reflexão (Figura 2). Recentemente, foi demonstrado que o objetivo coletar em modo de transmissão poderia ser transferido para uma maior ampliação e objetiva de abertura numérica para permitir a difração limitada imagem IR, que leva a um aumento substancial na resolução espacial de imagens IR recolhidos 4,5. Os avanços na resolução espacial para a imagem latente de tecidos têm sido de fundamental importância, pois agora podemos identificar tipos de células e estruturas de tecidos, por exemplo, as unidades funcionais do rim, os glomérulos, usando adaptado in-houseSistemas de FT-IR (Figura 3). De alta definição de imagem FT-IR permite imagens detalhadas dos tecidos a serem examinados para identificar regiões anormais e identificar diferenças bioquímicas entre os diferentes tipos de células. Em um núcleo de tecido hepático, é possível visualizar os hepatócitos e as regiões de fibrose infiltrantes que divide duas áreas distintas de displasia e cirrose não-displásicas (Figura 4). Estamos trabalhando para explorar esta no sentido de tornar as ferramentas de diagnóstico automatizadas para uso em casos difíceis de doença hepática. É importante ressaltar que o aumento da resolução espacial pode agora nos permitem isolar características estruturais específicas que podem ser modificados pela doença antes que as alterações histológicas são aparentes. Por exemplo, estamos focados em identificar alterações bioquímicas nas estruturas glomerular renal, como a cápsula de Bowman, mesangium, membrana basal glomerular e membrana basal tubular, antes<html> alterações identificadas pelo patologista pode ser observado (Figura 5). Em particular, estamos interessados ​​na identificação de alterações associadas à progressão da nefropatia diabética e rejeição crônica em pacientes transplantados, onde as técnicas atuais não conseguem identificar as mudanças de uma forma bastante cedo para a intervenção bem-sucedida. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figura 1. imagens FT-IR e espectro de um núcleo de fígado. Imagem de (A), coradas com H &amp; E de núcleo a partir de biópsia e imagens de absorvância IR de secção em série do mesmo núcleo em fígado (B) 3,286 cm-1 e (C) 2603 cm -1, que destacou diferentes características estruturais. (D) o espectro IR típico de tecidos, com picos importantes marcados. Barra de escala = 100 pm.&quot;target =&quot; _ fig1large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figura 2. Optics detalhando modos esquemáticos operação microscópio FT-IR. (A) no modo de transmissão, a amostra é iluminada através do objectivo de fundo, e a luz que passa através da amostra é coletada pelo objectivo superior. (B) No modo de reflexão, o objectivo topo serve tanto para iluminar a amostra e para recolher a luz reflectida. O objetivo final não é usado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figura 3. Comparação de diferent objectivos microscópio sobre imagens FT-IR de um glomérulo renal em 2925 centímetros -1. (A) 15X coleta objetivas com NA = 0,5 (tamanho 5,5 x 5,5 mm pixel). (B) O objectivo 36X coleta com NA = 0,5 (tamanho 2,2 x 2,2 mm pixel). (C) 74x coleta objetiva com NA = 0,65 (tamanho 1,1 x 1,1 mm pixel). Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figura 4. diferenças espectrais entre fibrose e hepatócitos no fígado de um núcleo. (A) H &amp; E manchado núcleo de biópsia hepática. (B) A imagem de um núcleo de seção de série digitalizado no FT-IR (36X configuração objetiva). (C) RepOs espectros tante de hepatócitos e fibrose, tomada a partir de regiões de tecido indicadas pelas setas em (A) e (B). Scale bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figura 5. Diferenciação das características de biópsia de tecido renal através da utilização de imagiologia de alta definição de FT-IR. (A) Secção ácido periódico de Schiff corados com as características para ser extraído marcado. (B) de alta definição de imagem de FT-IR de 2 assimétrica região de estiramento CH (36X configuração objectivo) de uma secção em série do mesmo tecido. (C) Características rotulada em (A), extraiu-se usando a imagem de FT-IR em (B) para ser capaz de dif quimicamenteferentiate as quatro características do tecido. Barra de escala = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) espectroscópica por imagem das secções de tecidos humanos para a melhoria da Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.1K visualizações.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Imagem Domínio óptico Freqüência de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonares espécimes de ressecção: Obtenção de One to One Imagem para Histopatologia Correlação

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Bioengenharia

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Medicina

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Pesquisa do câncer

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

Protocolo de imagem e caracterização de terahertz para tumores de câncer de mama recém-excisados

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Engenharia

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo Abrangente para Identificação Celular e Análise Metabólica Usando OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: OPTIR-FISH integrado para análise metabólica e de identidade de célula única em ambientes complexos

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) espectroscópica por imagem das secções de tecidos humanos para a melhoria da Patologia

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