We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

The authors have nothing to disclose.

FT-IR является новым модальность для знака без биохимического визуализации срезов тканей, с потенциалом, чтобы играть важную роль в улучшении текущий стандарт диагностики при патологии. В настоящее время золотым стандартом патологии требует ткани для биопсии, фиксировали в формалине, заливали в парафин, разрезали несколько раз, и окрашивали с несколькими пятнами. Высококвалифицированные патологоанатом имеет субъективно визуально оценить структуру ткани и клеточной морфологии для определения диагноза. Здесь мы показываем, как собирать ИК-изображений с высоким разрешением и того же типа секций и обсудить некоторые из вычислительных методов для изучения химических различий между типами клеток и болезненных состояний. Критические шаги в рамках этого протокола для того, чтобы ткани очень тщательно предметными и система хорошо откалиброван для обеспечения спектроскопические данные очень высокого качества. Осторожность при настройке системы, в частности, criti<html> кал при работе с высокими целями увеличения. Чтобы помочь в устранении неполадок, следующий список охватывает некоторые из потенциальных трудностях; Проблема: Низкая интенсивность ИК при визуализации при отражении. Решение: Проверьте ориентацию ИК слайдов как отражающее покрытие может быть на той стороне слайда. Проблема: Низкий уровень сигнала / красный предупреждающий знак в Lancer контроля. Решение: Классные детекторы с LN2. Жидкий азот необходим для детекторов FPA функционировать и требует периодически их пополнять. Ошибки Ошибка / движения Скорость: проблема. Решение: Сброс спектрометр и уменьшить вибрации. Вибрации вызовет перемещение зеркала в интерферометре, чтобы его беспокоили. Проблема: шипы водяного пара в данных. Решение: Увеличьте чистку по системе и защитить образец из воздуха. Проблема: Неверный centerburst. Решение: Найти centerburst снова. e_content &quot;&gt; Проблема:. Низкая разница в поток передачи, даже если направлены Решение. Установите нижнюю конденсатор Это будет происходить, как ИК свет не сфокусирован в точке на образце. В этой статье мы сосредоточились на том, как получить высокой четкости ИК-изображений тканей в любом передачи или в режиме отражени. Характер ИК-изображений, в том, что существует несколько модификаций, которые могут быть сделаны с приобретением данных, такие как, типа подложки, способа фиксации, толщины образца, спектральным разрешением, интерферометр скорости зеркала и т.д. Влияние этих параметров имеет В последнее время 4,5,17,51 обсуждается в обширной подробно. Есть целый ряд модификаций, которые могут быть сделаны в системе формирования изображения в том числе изображений в режиме ATR 10,24,26 и с использованием наноразмерных тепловые подходы 52,53, чтобы обеспечить ИК изображений с высоким разрешением. Основным ограничением с ИК-изображений высокого разрешения является то, что TiОПРОСЫ должны быть тщательно подготовлены и достаточно тонкий для ИК пройти через (обычно 4 толщины мкм). Кроме того, передачи и отражения изображения ИК-требует образцы быть сухой из-за поглощения ИК водой. Тем не менее, ИК-изображений имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами, в том, что она может очень быстро изображения большие площади ткани, а возникающие богатую и подробную информацию биохимический. Другие аналогичные методы, которые получают биохимический информацию в этикетки без моды включают спектроскопии комбинационного рассеяния света, однако время сбора данных намного медленнее, позволяющих получать изображения. Новый комбинационного подходы изображений появляются в том числе вынужденного комбинационного рассеяния (ВКР) и когерентные антистоксовом комбинационного рассеяния (КАРС); Однако, они имеют ряд доступ ограничен спектральный или изображений одной частоте. Достижения в скорости сбора данных, пространственное разрешение и доступности вычислительных подходов были огромное значение в создании FT-IR Imagчисле более реальным подход к переводу в качестве нового инструмента визуализации при патологии. Последние достижения в пространственным разрешением были особенно важны для тканевой патологии, вызванной ключевых типов клеток, не являющихся разрешимыми с помощью обычных систем визуализации FT-IR. Недавняя статья Редди и др. показал, как смоделировать идеальную систему для получения оптимальной пространственной разрешающей способности системы ИК-изображений 5. Пример ткани почки представлены в этой статье, свидетельствуют о важности высоких пространственных разрешений для того, чтобы извлечь биохимический информацию из клубочков структур (рис 3 и рис 5). В будущем, новые достижения в квантовой каскадных лазеров очень ярких ИК источников света 54-57, 3D спектральных изображений 58 и прорывы в области наноразмерных ИК технологий 52,53,59,60 провести новые захватывающие направления исследований, которые могут иметь огромные последствия в будущем визуализации ткани. <p clосел = &quot;jove_content&quot;&gt; Мы представили примеры применения в печени и почек, где есть потребность в дополнительных биохимических информации, которая может иметь диагностическое значение. Спектральный лаборатории патологии в отделении патологии в университете штата Иллинойс в Чикаго ориентирована на перевод технологий тепловизионных к улучшению диагностики заболеваний и улучшения прогнозирования исхода пациента. FT-IR изображения может преодолеть некоторые из существующих ограничений в патологии практике, где требуется количественная и объективная информация. В частности, будущая работа направлена ​​на выявление областей в современной практике патологии, где современные методы не обеспечивают адекватной диагностическую чувствительность или предоставить ограниченную информацию. Ясно, существует потребность в улучшении существующей практики патологии и к предоставлению более подробную информацию в патологоанатомом о состоянии болезни пациента, которая может быть достижимо с помощью высокой четкости FT-IR изображений.

ИК-спектроскопия была аналитический инструмент доступен в той или иной форме с 1930-х годов; Однако, это только было в последнее десятилетие, что площадь ткани изображений с FT-IR имеет разобранном. Достижения в области ИК-Фурье для визуализации тканей были вынуждены в значительной части на три ключевых событий: 1) увеличение скорости получения данных из-за наличия большого фокальной плоскости (FPA) детекторов, которые, как правило, имеют тысячи ИК детекторов 1 , 2, 2) развитие передовых алгоритмов обработки и вычислительной мощности, чтобы обрабатывать большие гиперспектральные наборов данных 3, и 3) моделирование систем ИК-изображений, чтобы максимизировать пространственное разрешение 4,5. Там были многочисленные высокое качество и очень обширные статьи с анализом того, поле ИК-Фурье спектроскопии недавно 6-16, в дополнение к работе Природа протоколы, которые подробно описываются действия, чтобы получить спектры точки или карты из тканей 17. В этой статье мы сосредоточимся на протocol для получения изображения тканей с использованием 128 х 128 FPA детектора в модифицированной системе FT-IR с возможностями высокой четкости. FT-IR изображений уже давно предложил, чтобы быть потенциально желательно инструмент для клетки и визуализации тканей из-за способности для получения изображений, в которой каждый пиксель имеет богатый биохимический информации. FT-IR томография основана на принципе, что различные биомолекулы в образце будет количественно поглощать различные регионы средней инфракрасной; это позволяет при выводе в «биохимической отпечаткам пальцев». Это отпечатков пальцев был показан во многих исследованиях для изменения между различными типами клеток и болезненных состояний. В отличие от обычной патологии практике, когда пятна и иммуногистохимических маркеров должны быть использованы для визуализации и идентификации типов клеток и тканевых структур, которые используются для диагностирования и лечения варианты, изображения из ИК-Фурье формируются на основе присущего биохимии ткани. Ток Techniqие окрашивания ткани для диагностики занимает много времени, разрушительное, кропотливая и требует субъективной экспертизы патологоанатома, в то время как FT-IR предлагает потенциал, чтобы сделать этот процесс быстрым, неразрушающим, высокой степенью автоматизации и более объективным. Кроме того, FT-IR обеспечивает новый маршрут для получения дополнительной биохимической информации, которая не может быть легко доступны с помощью обычных методов окрашивания. Один из самых интересных достижений в последние годы наличие широких подходов изображений разрешением, которые теперь могут позволить для визуализации и характеризации типов клеток и тканевых структур, которые важны для комплексной диагностики заболеваний. Один из этих методов является нарушенного полного отражения (ATR) FT-IR, который включает в себя твердый иммерсионного объектива (SIL) по высоким показателем преломления, который позволяет с высоким разрешением изображения 18, и многие очень интересные исследования, показывающие свои приложения 19-25. Кроме того, шкак недавно показали, что увеличилось пространственное разрешение связано с изображениями ATR может позволить для визуализации и классификации эндотелиальных и миоэпителиальных клеток в ткани молочной железы, которые образуют ключевой компонент диагностики 26 рака молочной железы. В то время как изображения ATR является очень полезным, этот метод требует SIL вступить в контакт с тканью, чтобы сформировать FT-ИК-изображений; поэтому ее использование несколько ограничена для ткани патологии, где большие участки ткани должны быть быстро изображаемого. Второй подход был продемонстрирован путем связывания с большим увеличением цели к существующей FT-IR системе, которая использует синхротрон как яркий источник ИК, можно полностью освещать FPA и изображение с эффективным размером пикселя 0,54 х 0,54 мкм. Это позволило нам визуализировать ключевые структуры в груди и простаты ткани, которые не были разрешимых с помощью обычных ИК-систем 4. В то время как эти драматические увеличивается в ИК изображения пространственного Resolutioн были захватывающими, его использование по-прежнему ограничено из-за требуя синхротрона. Впоследствии, оптимальная система была разработана, которые также могут обеспечить высокой четкости возможности визуализации с размером 1,1 х 1,1 мкм пикселей без необходимости в источнике синхротронного а скорее с использованием традиционного GLOBAR источник ИК-5. В этой статье мы покажем, как изменить существующий коммерческую систему визуализации FT-IR, чтобы для дифракционного предела тепловидения тканей с приемлемым отношением сигнала к шуму с использованием нескольких ИК целей (15x, 36x, и 74X). Эффективный размер пикселя с тремя целями составляет 5,5 х 5,5 мкм (15X), 2,2 х 2,2 мкм (36X) и 1,1 х 1,1 мкм (74X). Затем мы приведем несколько примеров важности достижения в пространственным разрешением для выявления заболевания печени и почек биопсии 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектроскопического изображения является Новый подход для получения детальных изображений, которые связанные биохимический информацию. FT-IR визуализации ткани на основе принципа, что различные регионы в средней инфракрасной области поглощаются различными химическими связями (например, C = O, CH, NH) в клетках или ткани, которые затем могут быть связаны с наличием и составом биомолекул (например, липиды, ДНК, гликоген, белок, коллаген). В ИК-изображения, каждый пиксель в изображении содержит всю Инфракрасный (ИК) спектра, который может дать информацию о биохимического статуса клеток, которые затем могут быть использован для развития клеток типа или болезнь типа классификации. В этой статье мы покажем,: как получить ИК-изображения из человеческих тканей с использованием системы FT-IR, как изменить существующий инструментарий для обеспечения возможности получения изображений с высоким разрешением, и как визуализировать FT-ИК-изображений. Затем мы представим некоторые приложения FT-IRПри патологии с помощью печени и почек в качестве примеров. FT-IR изображений держит интересные приложения в обеспечении новый маршрут, чтобы получить в совершенно без наклеек невозмущающие маршруту биохимический информацию от клеток и тканей к предоставлению новому взглянуть на молекулярно-биологических изменений как часть болезненных процессов. Кроме того, это биохимический информация может потенциально позволяют объективно и автоматизированного анализа некоторых аспектов диагностики заболеваний.

FT-IR изображений позволяет при выводе ИК изображений ткани, которые могут дать разные контрасты в зависимости от ИК интересующей частоте. Кроме того, в ИК-изображения, каждый пиксель состоит из всей ИК-спектре, при различных пиков, соответствующих различных биомолекул, которые могут дать информацию о биохимических свойств типов клеток или болезненных состояний (рисунок 1). Здесь мы показали, как сравнивать спектральные подписи между классами, однако, более усовершенствованной автоматизированной классификации можно с помощью дополнительных алгоритмов 3,43-50, например, байесовский классификации, Случайные леса, искусственных нейронных сетей, и Архиерейский кластерного анализа могут быть выполнены на Данные. Руководил подходы классификации позволит на строительство классификатора, который может быть обучен позволяют для автоматизированного распознавания типов клеток или болезненных состояний. Неконтролируемые подходы классификации могут быть использованы для поиска в природе DIFконференциях в ткани или клетки из-за биохимического дисперсии. FT-IR-измерительные приборы развивалась на протяжении последних нескольких десятилетий, от измерения в точке / однопользовательском режиме отображения с помощью ИК непрозрачные отверстия в режим визуализации с использованием целей Кассегрена, используя либо освещая цель сочетании с сборный цели в передаче режиме или в режиме единой цели что оба загорается и собирает в отражения режиме (рисунок 2). Это было недавно показано, что сбор цель в режиме передачи может быть остановлена ​​на более высоком увеличении и численного апертура объектива, чтобы дифракционного ограниченной тепловидения, что приводит к существенному увеличению пространственного разрешения, собранных ИК изображений 4,5. Достижения в области пространственного разрешения для работы с изображениями тканей были критически важное значение, как и сейчас, мы можем идентифицировать типы клеток и тканевых структур, например функциональные единицы почки, почечных клубочков, используя адаптированы в домеИК-Фурье системы (Рисунок 3). Высокой четкости ИК-изображений позволяет детальные изображения тканей, которые будут рассмотрены, чтобы определить аномальные участки и определить биохимические различия между разными типами клеток. В ядре ткани печени, можно визуализировать гепатоциты и регионы проникновения фиброз, который делит два различных областях дисплазии и без дисплазии печени (рис 4). Мы работаем, чтобы воспользоваться этим в направлении обеспечения автоматизированных диагностических инструментов для использования в сложных случаях заболеваний печени. Важно отметить, что увеличилось пространственное разрешение может теперь позволяют нам выделить конкретные структурные особенности, которые могут быть химически модифицированы заболевания, прежде чем гистологические изменения очевидны. Например, мы сосредоточены на выявлении биохимические изменения в почках клубочков структур, таких, как капсула Боумена, мезангиум, гломерулярной базальной мембраны и трубчатой ​​базальной мембраны, до<html> Изменения, выявленные патологоанатом может наблюдаться (рис 5). В частности, мы заинтересованы в выявлении изменений, связанных с прогрессированием диабетической нефропатии и хронического отторжения в трансплантации пациентов, где современные методы не в состоянии определить изменения в достаточно раннем моды для успешного вмешательства. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Рисунок 1. ИК-Фурье изображения и спектр с сердечником печени. Изображение (а) Н &amp; Е окрашивали сердцевину из биопсии печени и изображений ИК поглощение последовательного сечения той же ядра в точке (В) 3286 см -1 и (C) 2603 см -1, в котором подчеркивается различные структурные особенности. (D) Типичный ИК-спектр ткани, с важными пиками меченых. Шкала бар = 100 мкм.fig1large.jpg &quot;TARGET =&quot; _ пустое &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. <img alt="Фиг.2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Рисунок 2. Оптическая схематические подробным режима эксплуатации ИК-микроскопом. (A) в режиме передачи, образец облучается через нижнюю цели, и свет, проходящий через образец собирают верхней цели. (В) В режиме отражения, верхняя цель служит как для освещения образца и сбора отраженного света. Нижняя цель не используется. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Рисунок 3. Сравнение дифферет микрообъективов на ИК-Фурье образов клубочка почки в 2925 см -1. () 15X сбора объективных с NA = 0,5 (размер 5,5 х 5,5 мкм пикселей). (B) 36X сбор объектив с NA = 0,5 (размер 2,2 х 2,2 мкм пикселей). (C) 74X сбора цели с NA = 0,65 (размер 1,1 х 1,1 мкм пикселей). Масштабная линейка = 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Рисунок 4. Спектральные различия между фиброзом и гепатоцитов в ядре печени. () H &amp; E окрашенных ядро от биопсии печени. (B) Изображение серийного сечения сердечника проверяемых в FT-IR (36X цель установки). (С) Группаставитель спектры гепатоцитов и фиброза, взяты из областей ткани, указанных стрелками на (А) и (В). Масштабная линейка = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Рисунок 5. Дифференцирование почечной ткани биопсии функций за счет использования высокой четкости ИК-изображений. (А) периодическое кислотно-Шифф окрашенных раздела с характеристиками должны быть извлечены помечены. (Б) высокой четкости ИК-изображение CH 2 асимметричного растяжения области (36X Цель установки) серийного части одной и той же ткани. (С) Характеристики маркировку (А) экстрагируют, используя изображение FT-IR в (б), чтобы иметь возможность химически DIFсовыми четыре функции ткани. Масштабная линейка = 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology at JoVE.com

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектральные визуализации тканей человека разделах, направленные на совершенствование патологии

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

high-definition-fourier-transform-infrared-ft-ir-spectroscopic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Medicine

Unit 1

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

z-Transform

SCIENTISTS IN ACTION

33.2K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Оптических изображений домена частоты<em&gt; EX VIVO</em&gt; Образцы легочной резекции: Получение один к одному изображению, чтобы Гистопатология Корреляция

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Bioengineering

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Трехмерных изображений внутриэпидермальных ноцицептивных нервных волокон в человека биопсию кожи

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Универсальный ручной трехмерной оптико-акустической визуализации зонд для Deep Tissue человека ангиографии и функциональных доклинических исследований в режиме реального времени

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

Terahertz Imaging и протокол характеристик для свежевырезанных опухолей рака молочной железы

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Engineering

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Мультимодальные и обработки изображений Спектроскопия Волоконно-расслоение Microendoscopy Платформа для неинвазивного,<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ тканей

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating nonlinear optical signals such as stimulated Raman scattering (SRS), two-photon excited fluorescence (TPEF), and transient absorption (TA) into an imaging platform, it can be used to reveal biomolecular contrast of cellular structures and AuNPs in a multimodal manner. This article presents a multimodal nonlinear optical microscopy and applies it to perform chemically specific imaging of AuNPs in cancer cells. This imaging platform provides a novel approach for developing more efficient functionalized AuNPs and determining whether they are within vasculatures surrounding the tumor, pericellular, or cellular spaces.

This article presents the integration of a spectral-focusing module and a dual-output pulse laser, enabling rapid hyperspectral imaging of gold nanoparticles and cancer cells. This work aims to demonstrate the details of multimodal nonlinear optical techniques on a standard laser scanning microscope.

Биомолекулярная визуализация клеточного поглощения наночастиц с использованием мультимодальной нелинейной оптической микроскопии

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Immunology and Infection

<meta charset="utf8"></head><body>Комплексный протокол идентификации клеток и метаболического анализа с помощью OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>В центре внимания автора: Интегрированный OPTIR-FISH для метаболического анализа и анализа идентичности отдельных клеток в сложных средах

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Оптическая фототермическая инфракрасно-флуоресцентная гибридизация in situ (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Преобразование Фурье высокой четкости инфракрасного (ИК-Фурье) спектральные визуализации тканей человека разделах, направленные на совершенствование патологии

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST