We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. Einrichtung eines FT-IR-Mikroskop und Erwerb Tissue Bilder <ol><li> Abschnitt ein Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeblock bei 4 &amp; mgr; m Dicke auf, um einen IR-kompatibel Rutsche mit einem Mikrotom. Alternativ Abschnitt ein mit flüssigem Stickstoff gefrorenen Gewebe bei 4 &amp; mgr; m Dicke auf einem IR-kompatiblen Objektträger unter Verwendung eines Kryostaten. HINWEIS: In der Regel wird eine serielle Abschnitt ebenfalls auf einem Glasträger erworben und angefärbt mit einem speziellen (wie Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)) oder immunhistochemische Färbung kommen. Zusätzlich können kultivierte Zelllinien auf IR kompatibel Trägern gezüchtet werden. IR kompatibel Dias IR reflektierenden Folien für Reflexionsmodus Bildgebung (zB mirrir Rutsche, Gold) oder IR-transparente Folien für den Transmissionsmodus Bildgebung (zB BaF 2, CaF 2). </li><li> Spülen Sie die FT-IR-Mikroskop und Spektrometer entweder mit trockener Luft oder trockenem Stickstoff auf atmosphärischen Wasser aus dem System zu entfernen. Warten Sie mindestens 45 Minuten vor der Belichtung, um eine gründliche PURG gewährleistene. </li><li> Kühle sowohl die FPA-Detektor (bis 79 K) und der Innen MCT-Detektor in der FT-IR-Mikroskop unter Verwendung von flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Detektoren etwa alle 6 Stunden. VORSICHT! Flüssiger Stickstoff ist ein Tieftemperaturfluid und kann Kaltverbrennungen, Erfrierungen und in geschlossenen Räumen Ersticken verursachen. </li><li> Befestigen Sie den Probenobjektträger auf dem Mikroskoptisch für FT-IR-Bildgebung. </li><li> Stellen Sie sicher, das sichtbare Licht ist &quot;ON&quot; und dann entweder mit dem Fernglas oder die Probe-Capture-Programm (die eine Echtzeit-sichtbares Bild des Gewebes bietet), den Schwerpunkt auf die Probe. </li><li> Öffnen Sie das Bundle Software-Paket wie Entschließungen Pro und klicken Sie auf &quot;Collect&quot; und klicken Sie auf &quot;Diagnose&quot; und wählen Sie &quot;Ausrichten Spectrometer&quot;. Sicherzustellen, dass der Strahlengang des Spektrometers internen Detektor nicht behindert wird. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Bildeinstellungen&quot;. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Electronics&quot;, wählen Sie die entsprechende &quot;Speed&quot;, &quot;Unter Sampling Ratio (UDR) &quot;und&quot; Filter &quot;Einstellungen je nach System. HINWEIS: In diesem Beispiel ist die Einstellung Geschwindigkeit = 2,5 KHz, UDR = 4 und Filter = Keine. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Optics&quot; sicherzustellen, dass &quot;Mid-IR-Quelle&quot;, &quot;Offene Blende&quot; und &quot;100% Strahlabschwächer &#39;ausgewählt sind. </li><li> Um an der &quot;Optics&quot; Registerkarte, wählen Sie &quot;Detector&quot; als &quot;Masse&quot; Kalibrierung des Systems, &quot;Microscope Detector&quot; als &quot;links&quot;, und wählen Sie entweder &quot;Durchlässigkeit&quot; oder &quot;Reflexion&quot; unter &quot;Optik-Modus &#39;, je nach Art von schieben verwendet. </li><li> Klicken Sie auf Setup, die das Fenster &#39;Lancer Control&#39; eröffnen wird. HINWEIS: Bei Reflexion folgen Sie den Anweisungen in 1,12 und 1,13 und für Übertragungsmodus folgen Sie den Anweisungen in 1,14-1,16. Weiter von 1,17 sowohl für Reflexion und Transmission. </li><li> Für Reflexionsmodus in &amp;# 8216; &#39;auf&#39; Raw &#39;Lancer Control. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich auf der Folie. </li><li> Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Anschließend bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes. Ändern &quot;Wärme&quot; und &quot;Kontrast&quot; Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren, wird dies keinen Einfluss auf die IR-Daten haben. Weiter 1,18. </li><li> Für Übertragungsmodus, in klicken Sie auf &#39;Lancer Control&#39; auf &#39;Raw&#39;. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), gehen Sie zu einem sauberen Bereich des Objektträgers. </li><li> Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. </li><li> Stellen Sie die untere Schwerpunkt / Kondensator Ziel, die Anzahl der Zählungen seiner Maximu erhöhenMeter Sehen Sie sich die Form der unteren rechten Bild in Lancer Kontrolle, um sicherzustellen, dass es Gauß in Aussehen und relativ einheitlich ist. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte. HINWEIS: Wenn eine der Bildpunkte in der FT-IR-Bild Interferogramm weiß werden, reduzieren Sie die Integrationszeit. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden und perfekt den Fokus des Bildes. Optional können Sie die Wärme und Kontrast Optionen, um ein Bild zu verbessern konzentriert, aber keine Auswirkungen auf den IR-Daten haben. </li><li> Mit der Bühnensteuerung Joystick bewegen, um einen reinen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Kalibrieren&quot;. Stellen Sie sicher, die &quot;Out Of Range (OOR)&quot; Wert unter 50 und der Unterschied zwischen der &#39;High Flux &quot;und&quot; Low Flux &quot;zählt mindestens 4000 zählt. </li><li> Wählen Sie zweimal auf &quot;OK&quot;. In der Optik Registerkarten auszuwählen; &quot;Detector&quot; = &quot;MCT&quot;, &quot;Microsbewältigen Detector &#39;=&#39; Rechts &#39;und klicken Sie auf &quot;Setup&quot;. An diesem Punkt wird es eine FT-IR-Interferogramm auf dem Bildschirm sein. Klicken Sie auf &#39;Suchen Center&#39;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Optics&quot;, wählen Sie erneut &quot;Detector &#39;=&#39; Masse &#39;,&#39; Mikroskop Detector &#39;=&#39; Links &#39;und wählen Sie&quot; Setup &quot;. </li><li> In Lancer Steuerung - sicher, das Bild immer noch auf eine saubere Fläche und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot; erneut. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Als nächstes sammelt ein Hintergrundbild FT-IR zur Absorption aus der Atmosphäre, und Einschub korrigieren. Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Electronics&quot; und wählen Sie eine geeignete spektrale Auflösung, in der Regel von 4 cm -1 oder 8 cm -1 für Gewebe. </li><li> Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Hintergrund&quot; und geben Sie 128 in &#39;Scans zusammen hinzufügen&#39;. Wählen Sie die &quot;New File ... &#39;Taste und legen Sie die Hintergrunddatei in entsprechende Falteäh. Registerkarte &quot;Imaging&quot;, um sicherzustellen, Mosaik 1 durch 1. Klicken Sie auf &quot;Hintergrund&quot; Überprüfen Sie, warten Sie, bis der Scanvorgang beenden und bestätigen Sie, wo die Datei gespeichert werden. Klicken Sie auf eine Region auf dem Hintergrund FT-IR-Bild und überprüfen Sie das Spektrum. </li><li> Um eine große Mosaikbild der Probe zu nehmen, wählen Sie die Registerkarte &quot;Imaging&quot; und die Anzahl der X- und Y-Rahmen-Einsatz für das Mosaik Größe, die Sie erwerben möchten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Setup&quot; und im Lancer Steuerung verwenden Sie die Live-IR im Hinblick auf den Bereich von Interesse zu finden. Wenn die ein Mosaik, zentriert den Live-Feed in der Mitte der Bereich von Interesse. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Öffnen Sie die Registerkarte &quot;Electronics&quot; und geben Sie die Anzahl der Scans zusammen hinzufügen (typischerweise einen Wert zwischen 2 und 16 Scans für Gewebe). Klicken Sie auf Durchsuchen. </li><li> Überprüfen Sie die gesammelten Bild FT-IR auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass es fokussierter aussieht. Klicken Sie auf das Bild nach oben von diesem Standort zu bringen, ein IR-Spektrum und überprüfen Sie, dass es aussieht, um ein akzeptables Signal-Rausch haben. AcquiRe ein sichtbares Bild der Probe. </li><li> Speichern Sie das Bild und exportieren Sie auf das gewünschte Format, wie ENVI-IDL. </li></ol> 2. Die Anpassung eines FT-IR-Mikroskop für HD-Fähigkeiten HINWEIS: Die meisten FT-IR-Systeme sind mit einer Objektiv etwa 15-facher Vergrößerung und 0,5 numerische Apertur (NA) versehen. Um das Bild in High-Definition-Modus kann ein IR-kompatibel 36X oder 74X Ziel verwendet werden, um Beugungs geben begrenzte Imaging-Funktionen werden. <ol><li> Entfernen 15X Zielsetzung dieses Systems durch Herausdrehen gegen den Uhrzeigersinn. </li><li> Schrauben Sie entweder in der 36X oder 74X Ziel an seinem Platz. Richten Sie das Ziel vor dem Gebrauch. Verwenden Sie Objektivverlängerungsrohre das Ziel nahe genug, um die Probe zu bringen. </li><li> Zeigen Gewebe unter dem neuen Ziel und Fokus mit sichtbarem Licht entweder das Fernglas oder Proben Capture-Programm. Hinweis: Neben einem HD-Imaging muss in Übertragungsmodus durchgeführt werden. Die sehr enge Arbeitsabstand von derse Ziele (1-2 mm) und sehr flache Schärfentiefe erfordert langsam und vorsichtig konzentrieren, die Zeit nehmen, um das Ziel, ohne die Probe zu berühren zu senken. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen von 1,6 bis 1,11. HINWEIS: Aufgrund signifikant schwieriger zu konzentrieren und weniger Licht den Detektor erreicht, wird das folgende Protokoll basierend auf 1,14 eingestellt. </li><li> Im Übertragungsmodus, klicken Sie auf &quot;Raw&quot;. Mit der Bühnensteuerung Joystick und gerade die Live-Ansicht der FT-IR-Bild Interferogramm (Bild oben rechts), um das Gewebe zu bewegen und sich (im Idealfall auf einer Kante). Hinweis: Dies kann schwierig sein, daher die &quot;Wärme&quot; und &quot;Kontrast&quot; Optionen einstellen, um ein Bild zu verbessern konzentrieren (diese Optionen nicht auf der IR-Daten betreffen). </li><li> Einmal ausgerichtet, mit dem Bühnensteuerung Joystick und die Live-Ansicht IR Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Stellen Sie die Integrationszeit auf rund 8000 Punkte. Stellen Sie die untere Fokussierobjektiv zuErhöhung der Anzahl von Zählungen auf seinen Maximal. Stellen Sie die Integrationszeit wieder auf rund 8000 Punkte. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, um ein Stück Gewebe mit Struktur, vorzugsweise den Rand eines Gewebes zu finden, und die perfekte Ausrichtung des Bildes. </li><li> Wenn Mosaikieren ein Bild mit einer hohen Auflösung, passen Sie die Bühne, um die korrekte Bewegung über Entfernungen für genaue Mosaik erforderlich ermöglichen. Um die Bühne Abstand Einstellungen zu ändern, gehen Sie auf &quot;Setup-Phase&quot; in Lancer Steuerung und stellen Sie die horizontale und vertikale Ausrichtung Einstellungen zur korrekten Mosaik ermöglichen. </li><li> Mit der Bühnensteuerung Joystick Umzug in einem sauberen Bereich des Objektträgers. Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Kalibrieren&quot;. Stellen Sie sicher, die außerhalb des Bereichs (OOR) Wert kleiner als 50 für beide 36X und 74X Ziele. Achten Sie darauf, die Differenz zwischen dem Hochfluss und Low Flux-Werte mindestens 1000 zählt für die 74X Objektiv und 2000 zählt für die 36X Ziel. </li><li> Weiter 1,19-1,27. Die Anzahl der Abfragen in 1.23 und1.25 müssen aufgrund der reduzierten Signal auf ca. 256 Scans für das Hintergrundbild und 16 bis 128 Scans für das Gewebebild eingestellt werden. </li></ol> 3. Visualisieren und Klassifizieren IR Spectral Datensätze HINWEIS: In diesem Abschnitt werden wir besprechen, wie die Visualisierung und Extrahieren von Daten aus spektrale Bilder mit Geo-Bildverarbeitung und Analyse-Software wie ENVI + IDL, aber der Prozess ist für jede alternative Software wie MATLAB, freie Software wie CytoSpec sehr ähnlich oder des Instruments Entwickler eigene Software. Es gibt einige unterschiedliche spektrale Verarbeitungstechniken, die auf der IR-Daten durchgeführt werden kann. <ol><li> Open Geospatial Bildverarbeitung und Analyse-Software und laden Sie die IR-Datendatei. </li><li> Tragen Sie eine Basislinienkorrektur-Algorithmus auf die IR-Daten, indem Sie &quot;Spectral-Tools&quot; und blättern Sie nach unten und klicken Sie auf &quot;Absorptionsspektren&quot;. Ein Pop-up-Menü Beobachten und wählen Sie &quot;Baseline correction &quot; HINWEIS: Basislinienkorrektur wird eine Baseline Offset Steigung aus den Daten durch Streuung entfernen </li><li> Führen Spectral Normalisierung durch Verhältnisbildung der Daten zu einer bestimmten spektralen Spitze (typischerweise Amid I (1650 cm -1) oder Amid II (1550 cm -1)) bzw. Fläche unter einem definierten Bereich des Spektrums. Wählen Sie dazu &quot;Normalspektren&quot; unter den &quot;Absorptionsspektren&quot; Menüoptionen. HINWEIS: Spectral Normalisierung so durchgeführt, daß die Unterschiede in den Spektren sind real biochemischen Unterschiede und nicht in Folge der Dicke und Dichte der Unterschiede zwischen den Proben. </li><li> Verwenden Sie ein Geräuschreduktionsalgorithmus, um Lärm von der Spektren falls 28 zu entfernen. HINWEIS: Es gibt mehrere Ansätze zur Verfügung, mit dem Basislinienkorrektur, spektrale Normalisierung und Rauschunterdrückung erreicht werden kann, wobei die meisten Software, die automatisierte Algorithmen eingebaut Darüber hinaus gibt es ein aufstrebendes Reihe von Ansätzen, die für die Korrektur wird.spektrale Abweichungen, die im Detail 29-42 diskutiert wurden; Allerdings hat die Gemeinschaft noch nicht einigen, welche von diesen benötigt werden. </li><li> Beobachten einer Liste aller IR-Frequenzen innerhalb des Bildes (typischerweise von einem Spektralbereich von 900 bis 4000 cm -1) gesammelt. Klicken auf den Frequenzen, die auf bestimmte Biomoleküle entsprechen, um ein Bild des Gewebes bei der ausgewählten Frequenz zu beobachten. <ol><li> Klicken Sie beispielsweise auf 1650 cm -1 Band um die Verteilung der Proteine ​​in der Probe zu beobachten. Alternativ klicken Sie auf 1080 cm -1 Band um die Verteilung der Nukleinsäuren in der Probe zu beobachten. Verwenden Wellenzahl 1650 cm -1. </li></ol></li><li> Erstellen Sie zusätzliche Bilder durch die Berechnung Spektralspitze Höhenverhältnisse, Peakflächenverhältnisse usw., die für die Visualisierung verschiedener biomolekularer Komponenten ermöglicht. Klicken Sie auf &quot;Spectral Extras&quot; und wählen Sie dann entweder &quot;Peakhöhe Verhältnisse&quot; oder &quot;Berechnen Bildbereich &#39;um Bilder zu erstellen. </li><li> Scannen Sie den entsprechenden benachbarten Gewebeschnitt, die befleckt mit einem separaten gesamte Dia-Imager-System, das Hellfeld Bilder erfasst wird. Neben dem Infrarotbild, um das digitale Bild des gefärbten Gewebe mit einer sichtbaren Bildprogramm. </li><li> Rechtsklicken Sie auf das Bild, um einen interessierenden Bereich und wählen Sie &quot;Z-Profil&quot;. Dies gibt die spektrale Information zu dem ausgewählten Pixel. </li><li> Schauen Sie sich die IR-Spektren von mehreren Pixeln aus mehreren Klassen, wie zum Beispiel den Vergleich Zelltypen, Krankheitszuständen. Mark spezifischen Pixel auf dem Bild mit dem &quot;Regions Of Interest&quot; (ROI) Tool. Um dies durchzuführen, klicken Sie rechts auf das Bild und wählen Sie &quot;ROI-Tool &#39;. Erstellen Sie die Klassen, die gekennzeichnet sind, zum Beispiel normal, Dysplasie und Krebs-Klassen. Wählen Sie dann &quot;ROI-Typ&quot; - &quot;Point&quot;. Wählen Sie dann die Klasse, um Pixel zu wählen und stützen sich auf die entsprechenden Pixel auf dem IR-Bild. Leiten Sie die durchschnittlichen Spektren foder jede der Klassen mit dem &quot;Durchschnitts ROI &#39;Werkzeug. </li><li> Vergleichen abgeleiteten Spektren durch Auftragen in Grafik-Software. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR ist ein aufstrebendes Modalität für markierungsfreie biochemischen Bildgebung von Gewebeschnitten, mit dem Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der aktuellen Standard der Diagnose in der Pathologie haben. Der aktuelle Gold-Standard für Pathologie erfordert Gewebe biopsiert werden, in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mehrfach geschnitten und mit mehreren Färbemitteln angefärbt. Eine gut ausgebildete Pathologen muss subjektiv visuell beurteilen die Gewebestruktur und Zellmorphologie, um eine Diagnose zu bestimmen. Hier zeigen wir, wie man hochauflösende IR-Bilder zu sammeln aus der gleichen Art von Teilen und diskutieren einige der computergestützten Ansätzen zur chemischen Unterschiede zwischen Zelltypen und Krankheitszuständen zu untersuchen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind, um sicherzustellen, dass das Gewebe sehr sorgfältig ausgerichtet, und dass das System gut kalibriert ist, um eine sehr hohe Qualität spektroskopischen Daten zu gewährleisten. Die Sorgfalt bei der Einrichtung des Systems ist besonders kri<html> cal beim Arbeiten mit stark vergrößernden Objektiven. Um bei der Fehlersuche, die folgende Liste deckt einige der potenziellen Schwierigkeiten; Problem: Niedrige IR-Intensität bei der Abbildung in der Reflexion. Lösung: Überprüfen Sie IR-Folie-Ausrichtung wie die reflektierende Beschichtung kann auf der falschen Seite der Folie ist. Problem: Low-Signal / rot Warnzeichen in Lancer Control. Lösung: Kühle Detektoren mit LN2. Flüssiger Stickstoff wird für die FPA Melder funktionieren erforderlich und erfordert regelmäßig nachgefüllt wird. Problem: Geschwindigkeit Fehler / Bewegungsfehler. Lösung: Setzen Sie Spektrometer und Vibrationen zu reduzieren. Vibrationen bewirkt, dass der bewegliche Spiegel in dem Interferometer gestört werden. Problem: Die Wasserdampfspitzen Daten. Lösung: Erhöhen Sie auf Purge-System und Probe aus der Luft zu schützen. Problem: Ungültige Center. Lösung: Suchen Center erneut. e_content &quot;&gt; Problem. Niedrige Flussdifferenz Übertragung, obwohl fokussiert. Lösung: Anpassen Sumpfkondensator Dies wird auftreten, wenn das IR-Licht wird nicht bis zu einem Punkt auf der Probe fokussiert. In dieser Arbeit haben wir, wie hochauflösenden IR-Bilder von Gewebe entweder in Transmission oder Transflektanzbetriebsweise erwerben konzentriert. Die Natur des FT-IR-Bildgebung besteht darin, dass es mehrere Modifikationen, die an der Datenerfassungs gemacht werden können, wie zum Beispiel, die Art des Substrats, Fixiertechnik, Probendicke, Spektralauflösung Interferometerspiegel Geschwindigkeit etc. Die Wirkung dieser Parameter aufweist kürzlich 4,5,17,51 in umfangreichen ausführlich diskutiert. Es gibt eine Reihe von Modifikationen, die an dem Bilderzeugungssystem mit Bilderzeugungs in ATR Modus 10,24,26 und nanoskalige thermische Ansätze 52,53 für hochauflösende IR Imaging ermöglichen gemacht werden können. Die wichtigste Einschränkung mit hoher Auflösung IR-Bildgebung ist, dass der tiHEMEN muss sorgfältig vorbereitet werden und dünn genug für IR durch (typischerweise 4 &amp; mgr; m Dicke) bestehen. Zusätzlich Transmission und Reflexion FT-IR-Abbildungs ​​erfordert die Proben trocken sein aufgrund der Absorption des IR von Wasser. Jedoch weist FT-IR-Abbildungs ​​signifikante Vorteile gegenüber anderen Techniken, da sie sehr schnell große Flächen von Gewebe bei der Ableitung reichen und detaillierten biochemischen Informationen. Andere ähnliche Techniken, die in einer markierungsfreien Mode biochemische Information abzuleiten schließen Raman-Spektroskopie, wird jedoch die Zeit der Datenaufnahme ist viel langsamer, um Bilder zu erfassen. New Raman Imaging Ansätze entstehen, einschließlich stimulierter Raman-Streuung (SRS) und Coherent Antistokes Raman-Streuung (CARS); sie haben jedoch Zugang begrenzten Spektralbereich oder Einzelfrequenz-Bildgebung. Die Fortschritte in der Geschwindigkeit der Datenerfassung, räumliche Auflösung, und die Verfügbarkeit von Rechen Ansätze von unschätzbarem Wert bei der Herstellung von FT-IR imag gewesening ein praktikabler Ansatz für die Übersetzung als neuen Imaging-Tool in der Pathologie. Die jüngsten Fortschritte in der räumlichen Auflösung, besonders wichtig für die Gewebepathologie wurde durch Tastenzelltypen nicht in der auflösbaren Verwendung herkömmlicher FT-IR-Abbildungssystemen. Die jüngste Veröffentlichung von Reddy et al. gezeigt, wie ein ideales System die optimale räumliche Auflösung eines FT-IR-Abbildungssystem 5 erhalten modellieren. Das Nierengewebe beispielsweise in diesem Papier zeigt, wie wichtig eine höhere räumliche Auflösung, um die biochemischen Informationen aus glomeruläre Strukturen (Abbildung 3 und Abbildung 5) zu extrahieren. In der Zukunft, neue Fortschritte in der Quantenkaskadenlaser, wie sehr helle IR-Lichtquellen 54 bis 57, 3D Spectral Imaging 58 und Durchbrüche im Bereich der nanoskaligen IR Technologien 52,53,59,60 halten spannende neue Wege der Forschung, die möglicherweise enorme Auswirkungen in der Zukunft von Gewebe-Bildgebung. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Wir haben Beispiele für Anwendungen, in Leber- und Nierenerkrankungen vorgestellt, wo es einen Bedarf an zusätzlichen biochemischen Informationen, von diagnostischem Wert sein kann. Der Spectral Pathology Lab in der Abteilung für Pathologie an der Universität von Illinois in Chicago ist auf die Übersetzung von IR-Imaging-Technologien zur Verbesserung der Diagnose von Krankheiten konzentriert und verbesserte Vorhersage der Behandlungserfolg. FT-IR-Bildgebung können einige der derzeitigen Beschränkungen in der Pathologie der Praxis, wo quantitative und objektive Information ist erforderlich, zu überwinden. Insbesondere wird die künftige Arbeit auf die Ermittlung von Bereichen in der aktuellen Praxis für Pathologie in dem aktuellen Techniken keine ausreichende diagnostische Sensitivität liefern oder einen begrenzten Aufschluss konzentriert. A ergibt sich die Notwendigkeit der Verbesserung der derzeitigen Praxis für Pathologie und Richtung geben weitere Informationen zu den Pathologen zu Krankheitsstatus des Patienten, die erreichbar sein kann mit High-Definition-FT-IR-Bildgebung.

IR-Spektroskopie ist ein Analyseinstrument seit den 1930er Jahren in irgendeiner Form; es ist jedoch nur innerhalb der letzten zehn Jahre, dass der Bereich der Gewebebildgebung mit FT-IR explodiert gewesen. 1) erhöhte Geschwindigkeit der Datenerfassung durch die Verfügbarkeit großer Focal Plane Array (FPA) Detektoren, die haben in der Regel Tausende von IR-empfindliche Detektoren 1: Die Fortschritte in der FT-IR für Tissue Imaging haben in einem großen Teil durch drei wesentliche Entwicklungen getrieben , 2, 2) Entwicklung fortschrittlicher Verarbeitungsalgorithmen und Rechenleistung, große hyperspektralen Daten verarbeiten Sätze 3 und 3) Modellierung der FT-IR-Bildgebungssysteme, um die räumliche Auflösung 4,5 maximieren. Es gab zahlreiche qualitativ hochwertige und sehr umfangreiche Artikel Überprüfung der Bereich der FT-IR-Spektroskopie kürzlich 6-16, neben einem Natur Protokolle Papier, das die Schritte zum Punkt Spektren oder Karten aus dem Gewebe 17 zu erhalten Details. In dieser Arbeit werden wir uns auf die prot konzentrierenocol um Bilder von Geweben mit einem 128 x 128 FPA-Detektor in einer modifizierten FT-IR-System mit High-Definition-Fähigkeiten zu erhalten. FT-IR-Bildgebung ist seit langem vorgeschlagen worden, auf Grund der Möglichkeit, Bilder, in denen jedes Pixel hat eine Fülle von biochemischen Informationen zu erhalten, um ein möglicherweise wünschenswert für Zell- und Gewebebildgebung ist. FT-IR-Bildgebung beruht auf dem Prinzip, daß verschiedene Biomoleküle in der Probe quantitativ zu absorbieren unterschiedliche Regionen des mittleren Infrarot; Dies ermöglicht die Ableitung eines &quot;biochemischen Fingerprint. Dieser Fingerabdruck war in vielen Studien gezeigt, dass zwischen den verschiedenen Zelltypen und Krankheitszustände zu verändern. Anders als bei herkömmlichen Praxis für Pathologie, wo Flecken und immunhistochemischen Marker müssen verwendet werden, um sichtbar zu machen und zu identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, die verwendet werden, um die Diagnose und Behandlungsmöglichkeiten zu führen, werden die Bilder von FT-IR basierend auf der inhärenten Biochemie des Gewebes gebildet. Die aktuelle technique der Färbung Gewebe für die Diagnose ist zeitaufwändig, zerstörerisch, mühsam und erfordert subjektive Expertise des Pathologen, während FT-IR bietet das Potenzial dieser Prozess schnell, zerstörungsfrei, hochautomatisierten und objektiver zu gestalten. Zusätzlich stellt FT-IR einen neuen Weg zur Erlangung zusätzlicher biochemischer Informationen, die nicht leicht zugänglich sein können mit herkömmlichen Färbetechniken. Eine der aufregendsten Entwicklungen in den letzten Jahren war die Verfügbarkeit von hochauflösenden bildgebenden Methoden, die jetzt für die Visualisierung und Charakterisierung von Zelltypen und Gewebestrukturen, die für die umfassende Diagnose von Krankheiten sind erlauben können. Eine dieser Techniken ist für abgeschwächte Totalreflexion (ATR), FT-IR, die eine feste Immersionslinse (SIL) mit einem hohen Brechungsindex, der für eine hochauflösende Abbildung 18 ermöglicht, wobei viele sehr aufregende Studien zeigen ihre Anwendungen 19-25 enthält. Darüber hinaus ist es wwie kürzlich gezeigt, dass die erhöhte räumliche Auflösung mit ATR-Bildgebung verbunden sind, können für die Visualisierung und Klassifizierung von endothelialen und Myoepithelzellen im Brustgewebe, die eine Schlüsselkomponente der Brustkrebsdiagnose 26 bilden können. Während ATR-Bildgebung ist sehr nützlich, erfordert diese Technik die SIL den Kontakt mit dem Gewebe, um FT-IR-Bilder zu bilden zu machen; daher ist ihre Verwendung etwas für Gewebepathologie denen große Bereiche der Gewebe müssen schnell abgebildet werden begrenzt. Ein zweiter Ansatz wurde durch Kuppeln einer hohen linearen Ziels an eine vorhandene FT-IR-System, das eine Synchrotronstrahlung als helle Quelle von IR verwendet gezeigt, ist es möglich, vollständig zu beleuchten eine FPA und Bild mit einer effektiven Pixelgröße von 0,54 x 0,54 um. Dies ermöglichte es uns, Schlüsselstrukturen in Brust- und Prostatagewebe, die nicht auflösbar mit herkömmlichen FT-IR-Systeme 4 wurden zu visualisieren. Während dieser dramatischen Anstieg der IR-Bild räumliche resolution waren aufregend, seine Verwendung blieb aufgrund eines Synchrotron erfordern begrenzt. Anschließend wurde ein optimales System entwickelt, die auch für High-Definition-Imaging-Funktionen mit einem 1,1 x 1,1 um Pixelgröße, ohne das Erfordernis einer Synchrotronquelle, sondern mit einem herkömmlichen Globar IR-Quelle 5 ermöglichen kann. In diesem Artikel zeigen wir, wie Sie ein bestehendes Handels FT-IR-Bildgebungssystem für beugungsbegrenzte IR Bildgebung von Gewebe mit einem akzeptablen Signal-Rauschverhältnis mit mehreren IR-Ziele (15X, 36X und 74X) erlauben zu ändern. Die effektive Pixelgröße mit den drei Zielen ist 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) und 1,1 x 1,1 um (74X). Wir geben dann einige Beispiele für die Bedeutung der Gewinne in der räumlichen Auflösung für die Erkennung von Krankheiten in Leber- und Nierenbiopsien 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) spektroskopischen Bildgebung ist eine neue Herangehensweise, um detaillierte Bilder, die biochemische Information verbundenen erhalten. FT-IR-Bildgebung von Gewebe beruht auf dem Prinzip, daß unterschiedliche Bereiche der mittleren Infrarot durch unterschiedliche chemische Bindungen (z, C = O, CH, NH) innerhalb von Zellen oder Gewebe, die dann auf die Anwesenheit und Zusammensetzung beziehen absorbiert basierend von Biomolekülen (zB Lipide, DNA, Glycogen, Protein, Kollagen). In einem FT-IR-Bild jedes Pixel in dem Bild umfasst eine gesamte Infrarot (IR) -Spektrum, das Informationen über die biochemische Status der Zellen, die anschließend zur Zelltyp oder krankheits Typisierung genutzt werden können geben. In diesem Beitrag zeigen wir: wie man IR Bilder von menschlichen Geweben mit einem FT-IR-System zu erhalten, wie Sie vorhandene Instrumente zu modifizieren, um für hochauflösendes Imaging-Funktionen zu ermöglichen, und wie die FT-IR-Bilder zu visualisieren. Wir stellen dann einige Anwendungen der FT-IRfür Pathologie mit der Leber und Niere als Beispiele. FT-IR-Bildgebung hält spannende Anwendungen bei der Bereitstellung einer neuartigen Zugang zu biochemischen Informationen aus Zellen und Gewebe in einem völlig markierungsfreie störungsfreie Weg zu geben neue Einblicke in biomolekulare Änderungen im Rahmen von Krankheitsprozessen zu erhalten. Darüber hinaus kann diese biochemische Information potenziell ermöglichen objektive und automatisierte Analyse bestimmter Aspekte des Krankheitsdiagnose.

FT-IR-Bildgebung ermöglicht die Ableitung der IR-Bilder von Gewebe, das Kontraststufen in Abhängigkeit von der IR-Frequenz von Interesse geben. Zusätzlich ist in einem IR-Bild, nimmt die gesamte IR-Spektrum für jedes Pixel, mit unterschiedlichen Peaks, die den verschiedenen Biomolekülen, die Informationen über die biochemischen Eigenschaften von Zelltypen oder Krankheitszuständen (Abbildung 1) geben kann. Hier haben wir gezeigt, wie man spektralen Signaturen zwischen den Klassen zu vergleichen, jedoch erweiterte automatisierte Klassifizierung ist möglich durch zusätzliche Algorithmen 3,43-50 wie Bayes-Klassifizierung, Random Forests, Künstliche Neuronale Netze und Hierarchische Clusteranalyse kann auf die durchgeführt werden, haben Daten. Wachte Klassifizierung Ansätze für die Konstruktion eines Klassifizierers, die ausgebildet ist, um für die automatische Erkennung von Zelltypen oder Krankheitszustände zu ermöglichen ermöglichen. Unüberwachten Klassifizierung Ansätze können verwendet werden, um natürlich vorkommende dif suchenKonferenzen in Gewebe oder Zellen durch biochemische Varianz. FT-IR-Messtechnik hat sich in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt, aus der Messung in einem einzigen Punkt / Abbildungsmodus mittels IR undurchsichtig Öffnungen Abbildungsmodus mit Cassegrain Ziele, wobei entweder eine Beleuchtungsobjektiv gekoppelt mit einem Sammelziel der Übertragungsmode oder einer einzigen Objektiv daß beide optisch und sammelt sich in Reflexionsmodus (Abbildung 2). Kürzlich wurde gezeigt, daß das Sammelziel im Transmissionsmodus kann für eine höhere Vergrßerung und numerische Apertur Ziel geschaltet werden, um für die Beugung begrenzten IR-Bildgebung, die zu einer beträchtlichen Erhöhung der räumlichen Auflösung des gesammelten IR-Bilder 4,5 führt zu ermöglichen. Die Fortschritte in der räumlichen Auflösung für eine Gewebe Bildgebung von entscheidender Bedeutung gewesen, da wir nun die Funktionseinheiten der Niere Glomeruli identifizieren Zelltypen und Gewebestrukturen, beispielsweise unter Verwendung von in-house angepaßtFT-IR-Systeme (Figur 3). Neben einem HD-FT-IR-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Bilder von Gewebe untersucht, um anomale Regionen zu identifizieren und biochemischen Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen zu identifizieren. Bei einer Lebergewebe Kern ist es möglich, Hepatozyten und Regionen infiltrierenden Fibrose, die zwei verschiedene Bereiche von Dysplasie und nicht-dysplastischen Zirrhose (Figur 4) trennt visualisieren. Wir arbeiten daran, diese dazu bei, automatisierte Diagnose-Tools für den Einsatz in schwierigen Fällen von Lebererkrankungen zu nutzen. Wichtig ist, dass die erhöhte räumliche Auflösung nun ermöglicht es uns, bestimmte strukturelle Merkmale, die durch Krankheit chemisch modifiziert werden kann, bevor histologischen Veränderungen erkennbar sind, zu isolieren. Zum Beispiel haben wir die Identifizierung biochemischen Veränderungen in der Niere Glomeruli wie die Bowman-Kapsel, mesangium, glomerulären Basalmembran und Rohr Basalmembran fokussiert werden, bevor<html> Änderungen durch den Pathologen identifiziert beobachtet werden (Abbildung 5). Insbesondere interessieren wir uns bei der Identifizierung von Änderungen mit dem Fortschreiten der diabetischen Nephropathie und chronischer Abstoßung bei Transplantationspatienten, in denen aktuelle Techniken nicht zu Änderungen in einem ausreichend frühen Mode für erfolgreiche Intervention zu identifizieren verbunden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Abbildung 1: FT-IR-Spektrum von Bildern und von einer Leberkern. Bild von (A) H &amp; E gefärbten Kern von Leberbiopsie und Bilder der IR-Absorption der Serienschnitt der gleichen Kern an (B) 3286 cm -1 und (C) 2603 cm -1, die unterschiedliche Strukturmerkmale hervorgehoben. (D) Typische IR-Spektrum von Gewebe, mit bedeutenden Peaks markiert. Balken = 100 um.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Abbildung 2 schema Optics Detaillierung FT-IR-Mikroskop Betriebsarten. (A) In-Übertragungsmodus wird die Probe durch den Boden Ziel beleuchtet, und das Licht durch die Probe durch die obere Objektiv gesammelt. (B) Im Reflexionsmodus dient das vorrangige Ziel, sowohl die Probe zu beleuchten und das reflektierte Licht zu sammeln. Die untere Ziel nicht verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vergleich der different Mikroskopobjektive auf FT-IR-Bild einer Niere Glomeruli bei 2925 cm -1. (A) 15X Sammeln Objektiv mit NA = 0,5 (5,5 x 5,5 um Pixelgröße). (B) 36X Sammelobjektiv mit NA = 0,5 (2,2 x 2,2 um Pixelgröße). (C) 74X Sammeln Objektiv mit NA = 0,65 (1,1 x 1,1 um Pixelgröße). Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Abbildung 4. Spektrale Unterschiede zwischen Fibrose und Leberzellen in der Leber Kern. (A) H &amp; E gefärbten Kern von Leberbiopsie. (B) Bild einer Serienteil Kern in FT-IR gescannt (36X Ziel Setup). (C) Repsentativ Spektren von Hepatozyten und Fibrose, aus Regionen von Gewebe durch die Pfeile in (A) angegeben entnommen und (B). Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Abbildung 5. Differenzierung der Nierengewebebiopsie Funktionen durch den Einsatz von High-Definition-FT-IR-Bildgebung. (A) Periodic-Acid-Schiff gefärbt Abschnitt mit den Merkmalen extrahiert gekennzeichnet werden. (B) einen HD-FT-IR-Bild der CH 2 asymmetrische Streckbereich (36X Ziel Setup) eines Serienschnitt des gleichen Gewebes. (C) Eigenschaften in (A) unter Verwendung des FT-IR-Bild (B) in der Lage, chemisch dif sein extrahiertes markierteszieren die vier Merkmale des Gewebes. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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SCIENTISTS IN ACTION

33.1K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Serie: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Optical Frequency Domain Imaging der<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonary Resektionsproben: Beziehen One to One Image to Histopathologie Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Medizin

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal-Hand Dreidimensionale Optoakustische Bildgebung Sonde für Deep Tissue Menschen Angiographie und Funktions präklinischen Studien in Echtzeit

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Krebsforschung

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Ingenieurwesen

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

Dreidimensionale Bildgebung von tumortragendem Gewebe mit dem iterativen Bleaching erweitert den Multiplexitätsansatz

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>Umfassendes Protokoll zur Zellidentifikation und Stoffwechselanalyse mit OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Integriertes OPTIR-FISH für die Einzelzell-Stoffwechsel- und Identitätsanalyse in komplexen Umgebungen

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

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