We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. Mise en place d&#39;un microscope à FT-IR et acquisition tissus Images <ol><li> Section un bloc de tissu fixé au formol et inclus en paraffine à 4 um d&#39;épaisseur sur une diapositive compatible IR en utilisant un microtome. Alternativement, la section a de tissu congelé de l&#39;azote liquide à 4 um d&#39;épaisseur sur une diapositive compatible IR en utilisant un cryostat. NOTE: En règle générale, une section de série sera également acquis sur une lame de verre et colorées avec une spéciale (comme l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E)) ou de teinture immunohistochimique. En outre, les lignées de cellules cultivées peuvent être cultivées sur des lames compatibles IR. Diapositives compatibles IR peuvent être IR diapositives réfléchissantes pour le mode imagerie de réflexion (par exemple, mirrir diapositive, or) ou IR diapositives transparentes pour le mode transmission imagerie (par exemple, BaF 2, CaF 2). </li><li> Purger le microscope FT-IR et le spectromètre utilisant l&#39;air sec ou de l&#39;azote gazeux sec pour enlever l&#39;eau atmosphérique du système. Attendez au moins 45 minutes avant l&#39;imagerie pour assurer un Purg approfondiee. </li><li> Refroidir à la fois le détecteur FPA (79 K) et le détecteur MCT interne dans le microscope FT-IR en utilisant de l&#39;azote liquide. Refroidir les détecteurs environ tous les 6 heures. ATTENTION! L&#39;azote liquide est un fluide cryogénique et peut causer des brûlures par le froid, des engelures et dans des espaces clos asphyxie. </li><li> Montez la lame de l&#39;échantillon sur la platine du microscope pour l&#39;imagerie FT-IR. </li><li> Assurer la lumière visible est &quot;ON&quot; et ensuite, soit en utilisant les jumelles ou le programme de capture d&#39;échantillon (qui fournit en temps réel d&#39;image visible du tissu), se concentrer sur l&#39;échantillon. </li><li> Ouvrez le logiciel de paquet tels que des résolutions pro et cliquez sur «Collect», puis cliquez sur &quot;Diagnostics&quot;, puis sélectionnez &quot;Aligner spectromètre. Vérifiez que le trajet de faisceau vers le détecteur spectromètre interne ne est pas obstrué. </li><li> Cliquez sur &#39;Configuration d&#39;imagerie. </li><li> Dans l&#39;onglet &#39;Electronique&#39;, sélectionnez le «Speed» appropriée, &#39;Sous SaRatio de mpling (UDR) »et« paramètres »Filtres en fonction du système. NOTE: Dans cet exemple, le réglage est Vitesse = 2,5 KHz, UDR = 4 et Filtres = Aucune. </li><li> Dans l&#39;onglet &#39;Optique&#39; assurer que «source Mid-IR», «Ouvrir l&#39;ouverture» et «100% atténuateur de faisceau» sont sélectionnés. </li><li> Pour calibrer le système, dans l&#39;onglet &#39;Optique&#39;, sélectionnez &#39;détecteur&#39; que &#39;Ground »,« Microscope Detector »comme de« gauche », puis sélectionnez« Transmission »ou« réflexion »sous« mode Optique »selon le type de glisser utilisé. </li><li> Cliquez sur Configuration, qui ouvrira la fenêtre «Control Lancer &#39;. NOTE: Pour le mode de réflexion suivez les instructions dans 1,12 et 1,13 et pour le mode de transmission de suivre les instructions à 01.14 à 01.16. Continuer à partir de 1,17 pour la réflexion et la transmission. </li><li> Pour le mode de réflexion, dans &amp;# 8216; »cliquez sur« Control Lancer Raw. Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l&#39;affichage en direct de l&#39;image interférogramme FT-IR (l&#39;image en haut à droite), se déplacer vers une zone propre sur la diapositive. </li><li> Réglez le temps d&#39;intégration à environ 8000 chefs d&#39;accusation. Ensuite, déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d&#39;un tissu, et de parfaire la mise au point de l&#39;image. Change &#39;Chaleur&#39; ​​et les options &#39;Contraste&#39; pour aider à former une image pour améliorer la focalisation, cela ne aura aucun effet sur les données IR. Continuer à partir de 1,18. </li><li> Pour le mode de transmission, cliquez sur «Lancer de contrôle» sur «brut». Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l&#39;affichage en direct de l&#39;image interférogramme FT-IR (l&#39;image en haut à droite), se déplacer vers une zone propre de la diapositive. </li><li> Réglez le temps d&#39;intégration à environ 8000 chefs d&#39;accusation. </li><li> Réglez la focalisation basse / objectif de condenseur pour augmenter le nombre de chefs d&#39;accusation à son Maximum. Regardez la forme de l&#39;image en bas à droite dans le contrôle Lancer pour se assurer qu&#39;il est en apparence gaussien et relativement uniforme. Ajustez à nouveau le temps d&#39;intégration à environ 8000 chefs d&#39;accusation. NOTE: Si l&#39;un des pixels de l&#39;image d&#39;interférogramme FT-IR tourner blanc, réduire le temps d&#39;intégration. </li><li> Déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d&#39;un tissu et de parfaire la mise au point de l&#39;image. Vous pouvez également modifier les options de chaleur et de contraste pour aider à former une image pour améliorer la focalisation, mais ne aura aucun effet sur les données d&#39;IR. </li><li> Aide de la manette de commande de l&#39;étage, se déplacer vers une zone propre de la diapositive. Appuyez sur le bouton «Calibrer». Assurer la &#39;Out Of Range (BR)&#39; valeur est inférieure à 50 et la différence entre le &#39;haut flux&#39; et compte &#39;faible flux&#39; est au moins 4000 points. </li><li> Sélectionnez deux fois &#39;OK&#39;. Dans les onglets de sélectionner optique; «MCT» &#39;détecteur&#39; =, &#39;Microsface Detector &#39;= «droit» puis cliquez sur «Setup». À ce stade, il y aura un interférogramme FT-IR sur l&#39;écran. Cliquez sur &quot;Trouver Centerburst &#39;. Cliquez sur &#39;Ok&#39;. </li><li> Dans l&#39;onglet &#39;Optique&#39;, sélectionnez de nouveau &#39;détecteur&#39; = &#39;Ground&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; = &#39;gauche&#39; et sélectionnez &#39;Configuration&#39;. </li><li> In Control Lancer - assurer l&#39;image est toujours sur une surface propre et cliquez sur «Calibrer» à nouveau. Cliquez sur &#39;Ok&#39;. </li><li> Ensuite, recueillir une image FT-IR fond pour corriger absorbance de l&#39;atmosphère, le système et un toboggan. Allez à l&#39;onglet &#39;Electronique&#39; et sélectionnez une résolution spectrale appropriée, typiquement de 4 cm -1 ou 8 cm -1 pour le tissu. </li><li> Allez à l&#39;onglet «Contexte» et tapez 128 dans les «scans de co-add». Sélectionnez le &#39;Nouveau fichier ... &quot;bouton et placer le fichier dans le pli de fond appropriéeer. Vérifiez l&#39;onglet «Imaging» pour assurer une mosaïquage est de 1. Cliquez sur «Contexte», attendez pour le balayage à la fin et confirmer où enregistrer le fichier. Cliquez sur une région sur l&#39;image FT-IR fond et vérifier le spectre. </li><li> Pour prendre une grande image en mosaïque de l&#39;échantillon, sélectionnez l&#39;onglet &#39;imagerie&#39; et insérez le nombre de X et Y cadres pour la taille de la mosaïque que vous souhaitez acquérir. </li><li> Cliquez sur &#39;Setup&#39; et dans le contrôle Lancer utiliser la vue en direct IR pour trouver la zone d&#39;intérêt. Si vous prenez une mosaïque, centrer le flux en direct dans le milieu de la zone d&#39;intérêt. Cliquez sur &#39;Ok&#39;. Allez à l&#39;onglet &#39;Electronique&#39; et tapez le nombre de balayages de co-ajouter (généralement une valeur comprise entre 2 et 16 balayages pour le tissu). Cliquez sur «Scan». </li><li> Vérifiez l&#39;image FT-IR recueillies sur l&#39;écran pour se assurer qu&#39;il regarde ciblée. Cliquez sur l&#39;image pour faire apparaître un spectre IR partir de cet emplacement et vérifier qu&#39;il semble avoir un signal acceptable au bruit. Acquire une image visible de l&#39;échantillon. </li><li> Enregistrez l&#39;image et de l&#39;exporter au format requis, tels que ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adapter un microscope à FT-IR pour les capacités haute définition REMARQUE: La plupart des systèmes FT-IR sont équipés d&#39;un objectif d&#39;environ un grossissement 15X et 0,5 ouverture numérique (NA). Pour l&#39;image en mode haute définition, un IR compatible 36X ou 74X objectif peut être utilisé pour donner des capacités d&#39;imagerie de diffraction limitées. <ol><li> Retirer 15X L&#39;objectif du système en dévissant dans le sens antihoraire. </li><li> Visser soit l&#39;objectif 36X ou 74X à sa place. Alignez l&#39;objectif avant de l&#39;utiliser. Utilisation des tubes d&#39;extension de la lentille pour amener l&#39;objectif suffisamment proche de l&#39;échantillon. </li><li> Placez le tissu sous le nouvel objectif et de se concentrer en utilisant la lumière visible en utilisant soit les jumelles ou programme Capture échantillon. NOTE: imagerie haute définition doit être effectuée en mode de transmission. La distance de travail très proche de laobjectifs soi (1-2 mm) et très faible profondeur de focalisation exige concentrant lentement et avec précaution, en prenant le temps d&#39;abaisser l&#39;objectif sans toucher l&#39;échantillon. </li><li> Suivez les instructions de 1,6 à 1,11. NOTE: En raison d&#39;être beaucoup plus difficile de se concentrer et beaucoup moins de lumière atteignant le détecteur, le protocole suivant est ajusté en fonction de 1,14. </li><li> En mode de transmission, cliquez sur «brut». Aide de la manette de contrôle de scène et regarder l&#39;affichage en direct de l&#39;image interférogramme FT-IR (l&#39;image en haut à droite), se déplacer vers le tissu et se concentrer (idéalement sur un bord). REMARQUE: Cela peut être difficile, donc ajuster la «chaleur» et les options «Contraste» pour aider à former une image pour améliorer la focalisation (ces options ne ont aucun effet sur les données d&#39;IR). </li><li> Une fois la mise, en utilisant la manette de contrôle de scène et le Live View IR passage à un endroit propre de la diapositive. Réglez le temps d&#39;intégration à environ 8000 chefs d&#39;accusation. Ajuster le bas pour objectif de focalisationaugmenter le nombre de coups au maximum. Ajustez à nouveau le temps d&#39;intégration à environ 8000 chefs d&#39;accusation. </li><li> Déplacez la scène pour trouver un morceau de tissu avec la structure, de préférence le bord d&#39;un tissu, et de parfaire la mise au point de l&#39;image. </li><li> Si mosaïquage une image à haute résolution, régler le stade pour permettre le mouvement correcte exigée sur de longues distances pour mosaïquage précis. Pour modifier les réglages de la distance de la scène, allez à &#39;étape de configuration &quot;dans le contrôle Lancer et régler les paramètres d&#39;alignement horizontal et vertical pour permettre correcte mosaïquage. </li><li> En utilisant le joystick mouvement de commande de scène à un endroit propre de la diapositive. Appuyez sur le bouton «Calibrer». Assurer la hors de portée (BR) valeur est inférieure à 50 pour les deux 36X et 74X objectifs. Assurez-vous la différence entre le haut flux et les valeurs faible flux est au moins 1 000 chefs d&#39;accusation pour l&#39;objectif 74X et 2000 compte pour l&#39;objectif 36X. </li><li> Continuer de 1,19 à 1,27. Le nombre de balayages à 1,23 et1,25 devront être ajustées en raison de signal réduit à environ 256 scans pour l&#39;image de fond et de 16 à 128 analyses pour l&#39;image de tissu. </li></ol> 3. Visualisation et de classer les ensembles de données spectrales IR NOTE: Dans cette section, nous allons discuter de la façon de visualiser et extraire des données à partir d&#39;images spectrales en utilisant le traitement d&#39;image géospatiales et l&#39;analyse des logiciels tels que ENVI + IDL, mais le processus est très similaire pour tout logiciel alternatif tels que MATLAB, logiciels libres tels que CytoSpec ou propre logiciel de l&#39;instrument développeur. Il ya quelques différentes techniques de traitement spectrale qui peuvent être effectuées sur les données IR. <ol><li> Ouvrir traitement d&#39;images géospatiales et des logiciels d&#39;analyse et de charger le fichier de données IR. </li><li> Appliquer un algorithme de correction de base pour les données IR en sélectionnant «Outils spectrales» et faire défiler vers le bas et cliquez sur &quot;spectres d&#39;absorbance&quot;. Observer un menu pop-up et sélectionnez &quot;Baseline Correction &quot; REMARQUE: correction de base va supprimer une pente décalage de base à partir des données due à la diffusion </li><li> Effectuer une normalisation spectrale, en faisant le rapport des données à un certain pic spectral (typiquement d&#39;amide I (1650 cm -1) ou un amide II (1550 cm -1)) ou de la zone sous une région définie du spectre. Pour cela, sélectionnez &quot;spectres normale&quot; dans les &quot;spectres d&#39;absorption&quot; des options de menu. REMARQUE: Spectral normalisation est effectuée de sorte que les différences dans les spectres sont de véritables différences biochimiques et non en raison de l&#39;épaisseur ou les différences de densité entre les échantillons. </li><li> Utilisez un algorithme de réduction du bruit pour supprimer le bruit à partir des spectres si nécessaire 28. NOTE: Il ya plusieurs approches disponibles par lequel la correction de base, la normalisation spectrale et la réduction du bruit peuvent être atteints, avec la plupart des logiciels ayant algorithmes automatisés construits dans En outre, il ya un nombre d&#39;approches nouvelles qui permettront de corriger pour.aberrations spectrales, qui ont été examinées en détail 29-42; Toutefois, la communauté ne pas encore d&#39;accord sur lequel d&#39;entre eux sont nécessaires. </li><li> Observez une liste de toutes les fréquences IR recueillies dans l&#39;image (généralement d&#39;une gamme spectrale de 900 à 4000 cm -1). Cliquer sur les fréquences qui correspondent à des biomolécules spécifiques d&#39;observer une image du tissu à la fréquence sélectionnée. <ol><li> Par exemple, cliquez sur la bande de 1,650 cm d&#39;observer la distribution des protéines dans l&#39;échantillon. Vous pouvez également cliquer sur la bande de 1,080 cm d&#39;observer la distribution des acides nucléiques dans l&#39;échantillon. Utilisez nombre d&#39;onde 1650 cm -1. </li></ol></li><li> Créez des images supplémentaires en calculant rapports spectraux de pointe de hauteur, les ratios de surface de pic etc. qui permettront pour la visualisation des différents composants biomoléculaires. Cliquez sur &#39;Outils&#39; spectrales puis sélectionnez «Ratios de la hauteur du pic» ou «Calculer Zone de l&#39;image &#39;pour créer des images. </li><li> Scannez la coupe de tissu adjacent correspondant qui est colorées en utilisant un système coulissant imageur tout distinct qui capture des images en fond clair. Parallèlement à l&#39;image IR, faire apparaître l&#39;image numérique du tissu coloré avec un programme d&#39;image visible. </li><li> Faites un clic droit sur l&#39;image à une région d&#39;intérêt et sélectionnez le profil de Z &#39;. Cela donnera l&#39;information spectrale au pixel sélectionné. </li><li> Regardez les spectres IR de plusieurs pixels de plusieurs classes, telles que la comparaison des types de cellules, états pathologiques. Marquer les pixels spécifiques sur l&#39;image à l&#39;aide du «zones d&#39;intérêt» (ROI) outil. Pour effectuer cela, cliquez droit sur l&#39;image et sélectionnez &quot;outil de ROI. Créez les classes qui doivent être étiquetés, par exemple normale, la dysplasie, et les classes de cancer. Sélectionnez ensuite, «type de ROI &#39;-&#39; Point &#39;. Ensuite, sélectionnez la classe à sélectionner des pixels pour et se appuyer sur les pixels appropriés sur l&#39;image IR. Dériver les spectres moyens fou chacune des classes en utilisant l&#39;outil «ROI moyen &#39;. </li><li> Comparer spectres dérivés en traçant dans le logiciel graphique. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR est une modalité émergente pour sans étiquette biochimique imagerie des coupes de tissus, avec le potentiel d&#39;avoir un rôle important dans l&#39;amélioration de la norme actuelle de diagnostic en pathologie. La norme de référence actuelle pour la pathologie nécessite tissus à biopsie, fixe dans le formol, inclus en paraffine, sectionnés à plusieurs reprises, et colorés avec plusieurs taches. Un pathologiste hautement qualifié doit évaluer subjectivement visuellement la structure de tissu et de la morphologie cellulaire pour déterminer un diagnostic. Ici, nous montrons comment recueillir les images infrarouges haute résolution à partir du même type de sections et de discuter de certaines des approches informatiques pour examiner les différences chimiques entre les types de cellules et états pathologiques. Les étapes critiques au sein de ce protocole doivent se assurer que les tissus sont très soigneusement ciblées et que le système est bien calibrés pour assurer que les données spectroscopiques de très haute qualité. La prise en charge lors de la configuration du système est particulièrement Criti<html> cal lorsque vous travaillez avec des objectifs à fort grossissement. Pour faciliter le dépannage, la liste suivante couvre certaines des difficultés rencontrées potentiels; Problème: Faible intensité IR lors de l&#39;imagerie en réflexion. Solution: Vérifiez IR diaporama orientation que le revêtement réfléchissant peut être du mauvais côté de la glissière. Problème: Signal faible / Rouge panneau d&#39;avertissement dans le contrôle Lancer. Solution: détecteurs Refroidir les LN2. L&#39;azote liquide est nécessaire pour les détecteurs FPA pour fonctionner et nécessite d&#39;être régulièrement complété. Problème: Velocity erreurs erreur / de mouvement. Solution: Réinitialiser spectromètre et réduire les vibrations. Vibrations causeront le miroir se déplaçant dans l&#39;interféromètre être dérangé. Problème: les pointes de vapeur d&#39;eau dans les données. Solution: Augmentez purge sur le système et protéger l&#39;échantillon de l&#39;air. Problème: centerburst valide. Solution: Trouver centerburst nouveau. e_content &quot;&gt; Problème:. Faible différence de flux de transmission, même si concentré. Solution: Ajustez condenseur fond Cela se produira comme la lumière infrarouge ne est pas focalisé sur un point de l&#39;échantillon. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur la façon d&#39;acquérir des images haute définition IR de tissus de transmission ou de mode de transflectance. La nature de l&#39;imagerie FT-IR, est qu&#39;il existe de multiples modifications qui peuvent être apportées à l&#39;acquisition de données, tels que, type de substrat, technique de fixation, l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon, la résolution spectrale, interféromètre vitesse au miroir etc. L&#39;effet de ces paramètres a été discuté de façon très détaillée récemment 4,5,17,51. Il ya un certain nombre de modifications qui peuvent être apportées au système d&#39;imagerie y compris l&#39;imagerie en mode ATR 10,24,26 et thermiques utilisant des approches à l&#39;échelle nanométrique 52,53 pour permettre l&#39;imagerie infrarouge haute résolution. La principale limitation à l&#39;imagerie infrarouge haute résolution est que le tiProblèmes et doivent être soigneusement préparés et assez mince pour IR pour passer à travers (généralement 4 um d&#39;épaisseur). En outre, la transmission et la réflexion FT-IR imagerie exige que les échantillons à être sec en raison de l&#39;absorption de IR par l&#39;eau. Cependant, l&#39;imagerie FT-IR a des avantages significatifs par rapport aux autres techniques, en ce qu&#39;elle peut très rapidement l&#39;image de grandes zones de tissu tout en découlant informations biochimiques riche et détaillé. D&#39;autres techniques similaires qui dérivent informations biochimiques dans un mode sans marquage comprennent la spectroscopie Raman, mais le moment de l&#39;acquisition des données est beaucoup plus lente pour acquérir des images. Approches d&#39;imagerie Raman New émergent y compris la diffusion Raman stimulée (SRS) et cohérente antistokes diffusion Raman (CARS); cependant, ils ont une portée un accès limité ou imagerie spectrale à fréquence unique. Les progrès de la vitesse d&#39;acquisition de données, la résolution spatiale, et la disponibilité des approches computationnelles ont été d&#39;une valeur inestimable dans la prise imag FT-IRment une approche plus réalisable pour la traduction comme un nouvel outil d&#39;imagerie dans la pathologie. Les progrès récents de la résolution spatiale ont été particulièrement importantes pour la pathologie tissulaire due à des types de cellules clés ne étant pas résolu en utilisant des systèmes classiques d&#39;imagerie FT-IR. L&#39;étude récente de Reddy et al. a montré comment modéliser un système idéal pour obtenir la résolution spatiale optimale d&#39;un système d&#39;imagerie 5 FT-IR. L&#39;exemple de tissu rénal présentée dans cet article démontre l&#39;importance des résolutions spatiales plus élevées afin d&#39;en extraire des informations à partir de structures biochimique glomérulaire (de la figure 3 et la figure 5). Dans l&#39;avenir, de nouvelles avancées dans Quantum Cascade Lasers comme très vives sources de lumière IR 54-57, imagerie spectrale 3D 58, et des percées dans le domaine des technologies à l&#39;échelle nanométrique IR 52,53,59,60 détiennent de nouvelles avenues passionnants de la recherche qui peuvent avoir énormes implications dans l&#39;avenir de l&#39;imagerie des tissus. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nous avons présenté des exemples d&#39;applications dans le foie et les maladies rénales où il ya un besoin d&#39;information biochimique supplémentaire qui peut être de valeur diagnostique. Le laboratoire de pathologie spectrale dans le département de pathologie à l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago est axée sur la traduction des technologies d&#39;imagerie infrarouge vers l&#39;amélioration du diagnostic de la maladie et la prévision des résultats pour les patients améliorée. Imagerie FT-IR peut surmonter certaines des limitations actuelles dans la pratique de la pathologie où l&#39;information quantitative et objective est nécessaire. En particulier, les travaux futurs se concentre sur l&#39;identification des domaines dans la pratique de la pathologie actuelle, où les techniques actuelles ne parviennent pas à fournir une sensibilité diagnostiques adéquates ou de fournir des informations limitées. Un besoin évident existe dans l&#39;amélioration de la pratique actuelle de la pathologie et en vue de donner plus d&#39;informations au médecin sur l&#39;état de la maladie d&#39;un patient, qui peut être obtenue en utilisant l&#39;imagerie haute définition FT-IR.

spectroscopie IR a été un outil d&#39;analyse disponibles dans une certaine forme depuis les années 1930; cependant, il ne est fait à l&#39;intérieur de la dernière décennie que le domaine de l&#39;imagerie des tissus avec FT-IR a explosé. Les progrès de la FT-IR pour l&#39;imagerie des tissus ont été entraînée en grande partie par trois développements clés: 1) augmentation de la vitesse d&#39;acquisition de données en raison de la disponibilité de grande matrice de plan focal (FPA) détecteurs qui ont généralement des milliers de détecteurs IR sensibles 1 , 2, 2) le développement d&#39;algorithmes de traitement avancés et puissance de calcul pour gérer de grandes données hyperspectrales fixe 3, et 3) la modélisation de systèmes d&#39;imagerie FT-IR pour maximiser résolution spatiale 4,5. Il ya eu de nombreux haute qualité et très étendues des articles examinant le domaine de la spectroscopie FT-IR récemment 6-16, en plus d&#39;un article de Nature protocoles qui détaille les étapes pour obtenir les spectres de points ou des cartes à partir de tissus 17. Dans cet article, nous allons nous concentrer sur la protocol d&#39;obtenir des images de tissus à l&#39;aide d&#39;un détecteur 128 x 128 FPA dans un système FT-IR modifiée avec des capacités haute définition. Imagerie FT-IR a longtemps été suggéré d&#39;être un outil potentiellement souhaitable pour l&#39;imagerie cellulaire et tissulaire due à la capacité d&#39;obtenir des images où chaque pixel possède une mine d&#39;informations biochimique. Imagerie FT-IR est basé sur le principe selon lequel les différentes biomolécules dans un échantillon vont absorber quantitativement différentes régions de l&#39;infrarouge moyen; ce qui permet pour la dérivation d&#39;une «empreinte biochimique». Cette empreinte a été démontré dans de nombreuses études pour changer entre différents types de cellules et des états pathologiques. Contrairement à la pratique de la médecine conventionnelle où les taches et les marqueurs immunohistochimiques ont besoin d&#39;être utilisé pour visualiser et identifier des types de cellules et des structures de tissus qui sont utilisés pour guider le diagnostic et les options de traitement, les images de FT-IR sont formés sur la base de la biochimie inhérente du tissu. La techniq actuelleue coloration de tissu pour le diagnostic prend du temps, destructeur, laborieux et nécessite une expertise subjective du pathologiste, alors que FT-IR offre la possibilité de rendre ce processus rapide, non destructive, hautement automatisée et plus objective. En outre, FT-IR fournit une nouvelle voie d&#39;obtenir des informations supplémentaires biochimique qui peuvent ne pas être facilement accessibles en utilisant des techniques classiques de coloration. L&#39;un des progrès les plus passionnants de ces dernières années a été la disponibilité de méthodes d&#39;imagerie à haute résolution qui peut maintenant permettre pour la visualisation et la caractérisation de types de cellules et des structures tissulaires qui sont essentiels pour le diagnostic de la maladie complète. Une de ces techniques est réflectance totale atténuée (ATR) FT-IR qui comprend une lentille à immersion solide (SIL) d&#39;un indice de réfraction élevé qui permet une imagerie à haute résolution 18, avec de nombreuses études très intéressantes montrant ses applications 19-25. En outre, il wcomme démontré récemment que la résolution spatiale accrue associée à l&#39;imagerie ATR peut permettre la visualisation et la classification des cellules endothéliales et les cellules myoépithéliales dans le tissu du sein qui forment un élément clé de diagnostic du cancer du sein 26. Alors que l&#39;imagerie ATR est très utile, cette technique nécessite l&#39;SIL de prendre contact avec le tissu pour former des images FT-IR; par conséquent, son utilisation est quelque peu limitée pour la pathologie des tissus où de grandes régions de tissus doivent être rapidement imagés. Une deuxième approche a été démontrée par le couplage d&#39;un objectif à fort grossissement à un système FT-IR existant qui utilise un rayonnement synchrotron en tant que source lumineuse de IR, il est possible d&#39;illuminer complètement un FPA et image avec une taille de pixel effective de 0,54 x 0,54 um. Cela a permis de visualiser les structures clés dans les tissus du sein et de la prostate qui ne ont pas été résolu en utilisant des systèmes FT-IR conventionnels 4. Bien que ces augmentations spectaculaires en image IR resolutio spatialen était excitant, son utilisation reste limitée en raison d&#39;exiger un synchrotron. Par la suite, un système optimal a été conçu qui pourrait également permettre haute définition des capacités d&#39;imagerie avec une taille de pixel de 1,1 x 1,1 um sans l&#39;exigence d&#39;une source de rayonnement synchrotron, mais plutôt en utilisant une source infrarouge de 5 Globar traditionnel. Dans cet article, nous montrons comment modifier un système d&#39;imagerie existante commerciale FT-IR pour permettre la diffraction IR limitée imagerie des tissus avec un signal acceptable pour bruit utilisant objectifs multiples (IR 15X, 36X, 74X) et. La taille de pixels effectifs avec les trois objectifs est de 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) et 1,1 x 1,1 um (74X). Nous donnons ensuite quelques exemples de l&#39;importance des gains de la résolution spatiale pour la détection de la maladie dans le foie et les reins des biopsies 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique est une approche émergente d&#39;obtenir des images détaillées qui ont associés informations biochimiques. Imagerie FT-IR de tissu est basé sur le principe selon lequel les différentes régions de l&#39;infrarouge moyen sont absorbés par différentes liaisons chimiques (par exemple, C = O, CH, NH) à l&#39;intérieur des cellules ou des tissus qui peuvent ensuite être liées à la présence et de la composition des biomolécules (par exemple, les lipides, l&#39;ADN, le glycogène, la protéine, le collagène). Dans une image FT-IR, chaque pixel dans l&#39;image comprend l&#39;ensemble d&#39;un spectre infrarouge (IR) qui peuvent donner des informations sur l&#39;état biochimique des cellules qui peuvent ensuite être exploités pour cellule de type ou de type maladie classification. Dans cet article, nous montrons: comment obtenir des images infrarouges de tissus humains en utilisant un système FT-IR, comment modifier l&#39;instrumentation existante pour permettre haute définition des capacités d&#39;imagerie, et la façon de visualiser les images FT-IR. Nous présentons ensuite certaines applications de FT-IRpour la pathologie en utilisant le foie et les reins à titre d&#39;exemples. Imagerie FT-IR détient applications passionnantes en fournissant une nouvelle voie pour obtenir des informations biochimiques à partir de cellules et de tissus dans un non-perturbant itinéraire entièrement sans étiquette en vue de donner un nouvel éclairage sur les changements biomoléculaires dans le cadre du processus de la maladie. En outre, cette information biochimique peut potentiellement permettre une analyse objective et automatisée de certains aspects du diagnostic de la maladie.

FT-IR imagerie permet la dérivation d&#39;images infrarouges de tissus qui peuvent donner des contrastes différents en fonction de la fréquence infrarouge d&#39;intérêt. En outre, dans une image d&#39;IR, chaque pixel comprend de l&#39;ensemble du spectre IR, avec des pics correspondant aux différentes biomolécules qui peuvent donner des informations sur les propriétés biochimiques des types cellulaires ou états maladifs (figure 1). Ici, nous avons montré comment comparer les signatures spectrales entre les classes, mais plus avancé classement automatisé est possible en utilisant des algorithmes supplémentaires 3,43-50, telles que la classification bayésienne, les forêts aléatoires, réseaux de neurones artificiels, et Hiérarchique Cluster Analysis peut être effectuée sur le données. Approches de classification supervisée permettront la construction d&#39;un classificateur qui peuvent être formés pour permettre la reconnaissance automatique des types de cellules ou états pathologiques. Méthodes de classification non supervisées peuvent être utilisés pour rechercher des dif naturelleconférences dans les tissus ou cellules en raison de la variance biochimique. Instruments FT-IR a évolué au cours des dernières décennies, de la mesure dans un simple / mode de mappage de point à l&#39;aide IR ouvertures opaques en mode d&#39;imagerie utilisant objectifs Cassegrain, en utilisant soit un objectif d&#39;éclairage couplé avec un objectif de collecte dans la transmission-mode ou un seul objectif que les deux se allume et se accumule dans la réflexion en mode (Figure 2). Il a été récemment démontré que l&#39;objectif de collecte dans le mode de transmission peut être commutée pour un plus fort grossissement et l&#39;ouverture numérique de l&#39;objectif pour permettre la formation d&#39;images IR diffraction limitée, qui conduit à des augmentations substantielles de la résolution spatiale des images infrarouges collectées 4,5. Les progrès de la résolution spatiale pour l&#39;imagerie de tissus ont été d&#39;une importance critique comme on peut maintenant déterminer les types de cellules et des structures tissulaires, par exemple les unités fonctionnelles du rein, les glomérules, en utilisant adapté à l&#39;interneSystèmes FT-IR (Figure 3). Haute définition imagerie FT-IR permet des images détaillées des tissus à examiner pour identifier les régions anormales et d&#39;identifier les différences biochimiques entre les différents types de cellules. Dans une âme en tissu de foie, il est possible de visualiser les hépatocytes et les régions de l&#39;infiltration fibrose qui divise deux zones distinctes de la dysplasie et la cirrhose non dysplasique (figure 4). Nous travaillons à exploiter cette direction la fabrication d&#39;outils de diagnostic automatisés pour une utilisation dans les cas difficiles de maladie du foie. Fait important, la résolution spatiale accrue peut désormais nous permettre d&#39;isoler les caractéristiques structurelles spécifiques qui peuvent être modifiés chimiquement par la maladie avant que des changements histologiques sont apparents. Par exemple, nous nous concentrons sur l&#39;identification des changements biochimiques dans les structures rénale glomérulaire tels que la capsule de Bowman, mésangium, membrane basale glomérulaire et la membrane basale tubulaire, avant<html> changements identifiés par le pathologiste peuvent être observées (Figure 5). En particulier, nous sommes intéressés à identifier les changements associés à la progression de la néphropathie diabétique et le rejet chronique chez les patients transplantés, où les techniques actuelles ne parviennent pas à identifier les changements dans un mode assez tôt pour une intervention réussie. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figure 1. images FT-IR et le spectre d&#39;un noyau de foie. Image de (A) H &amp; E colorées base de biopsie du foie et des images d&#39;absorbance IR de l&#39;article de série du même noyau en (B) 3286 cm -1 et (C) 2603 cm -1, ce qui a mis en évidence différentes caractéristiques structurelles. (D) du spectre IR typique du tissu, avec des pics importants marqués. Barre d&#39;échelle = 100 um.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figure 2. Optique détaillant __gVirt_NP_NNS_NNPS&lt;__ modes de fonctionnement du microscope FT-IR schématiques. (A) dans le mode de transmission, l&#39;échantillon est illuminé à travers l&#39;objectif de fond, et la lumière traversant l&#39;échantillon est recueilli par l&#39;objectif prioritaire. (B) En mode de réflexion, l&#39;objectif prioritaire sert à la fois pour éclairer l&#39;échantillon et pour recueillir la lumière réfléchie. L&#39;objectif de fond ne est pas utilisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figure 3. Comparaison des différenobjectifs de microscope sur les images t FT-IR d&#39;un glomérule rénal à 2925 cm -1. (A) 15X collecte objectifs avec NA = 0,5 (taille 5,5 x 5,5 um de pixel). (B) l&#39;objectif 36X de collecte avec NA = 0,5 (taille 2,2 x 2,2 um de pixel). (C) la collecte objectif 74X avec NA = 0,65 (taille 1,1 x 1,1 um de pixel). La barre d&#39;échelle = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figure 4. différences spectrales entre fibrose et hépatocytes dans un noyau du foie. (A) H &amp; E teinté coeur de la biopsie hépatique. (B) l&#39;image d&#39;une section noyau en série numérisée dans FT-IR (configuration objectif 36X). (C) RepLes spectres représen- des hépatocytes et la fibrose, pris à partir de régions de tissus indiqués par des flèches (A) et (B). Barre d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figure 5. Différenciation des caractéristiques de biopsie de tissu rénal par l&#39;utilisation de l&#39;imagerie haute définition FT-IR. (A) section acide périodique de Schiff colorées avec les caractéristiques à extraire étiqueté. (B) à haute définition d&#39;image FT-IR de la région CH 2 asymétrique étirement (36X d&#39;installation objectif) d&#39;une section de série du même tissu. (C) Caractéristiques étiqueté (A) extrait en utilisant l&#39;image FT-IR (B) pour pouvoir chimiquement differentiate les quatre caractéristiques du tissu. La barre d&#39;échelle = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique des sections de tissus humains à l&#39;amélioration de Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.1K vues.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Vidéo: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

D&#39;imagerie optique du domaine de fréquence<em&gt; Ex vivo</em&gt; Les spécimens résection pulmonaire: Obtention One to One image à l&#39;histopathologie Corrélation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Recherche

Bio-ingénierie

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

L&#39;imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Médecine

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d&#39;imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

Élargir la compréhension du microenvironnement tumoral à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse d’échantillons de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Recherche en cancérologie

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

Protocole d’imagerie et de caractérisation de Terahertz pour les tumeurs fraîchement excisées du cancer du sein

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Ingénierie

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopie Spectroscopy Fiber-bundle pour non-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;analyse des tissus

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

L’imagerie tridimensionnelle de tissus porteurs de tumeurs à l’aide du blanchiment itératif étend l’approche de multiplexité

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocole complet pour l’identification cellulaire et l’analyse métabolique à l’aide d’OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : OPTIR-FISH intégré pour l’analyse métabolique et identitaire unicellulaire dans des environnements complexes

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Transformée de Fourier à haute définition infrarouge (FT-IR) imagerie spectroscopique des sections de tissus humains à l'amélioration de Pathologie

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