We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. La creazione di un FT-IR Microscopio e Acquisizione tessuto Images <ol><li> Sezione di un blocco di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un microtomo. In alternativa, la sezione azoto tessuto congelato liquido a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un criostato. NOTA: In genere, una sezione di serie sarà anche acquisito su un vetrino e tinto con un speciale (ad esempio ematossilina e eosina (H &amp; E)) o macchia immunoistochimica. Inoltre, linee cellulari in coltura possono essere coltivate su vetrini compatibili IR. Diapositive compatibili IR possono essere diapositive riflettenti IR per la modalità di riflessione per immagini (ad esempio, mirrir scivolo, oro) o IR vetrini trasparenti per la modalità di trasmissione delle immagini (ad esempio, BaF 2, CaF 2). </li><li> Eliminare il microscopio FT-IR e spettrometro utilizzando aria secca o gas azoto secco per rimuovere l&#39;acqua dal sistema atmosferica. Attendere almeno 45 minuti prima di imaging per garantire un Purg completae. </li><li> Raffreddare sia il rivelatore FPA (a 79 K) e il rilevatore MCT interna al microscopio FT-IR usando azoto liquido. Raffreddare i rivelatori circa ogni 6 ore. ATTENZIONE! L&#39;azoto liquido è un fluido criogenico e può causare ustioni, congelamento e in spazi chiusi asfissia. </li><li> Montare il vetrino del campione sul palco microscopio per l&#39;imaging FT-IR. </li><li> Assicurarsi che la luce visibile è &quot;ON&quot; e poi o con il binocolo o il programma di cattura del campione (che fornisce una immagine visibile del tessuto in tempo reale), si concentrano sul campione. </li><li> Aprire il pacchetto software pacchetto quali risoluzioni pro e fare clic su &#39;Collect&#39;, quindi su &#39;Diagnostica&#39; e selezionare &#39;Allinea Spectrometer&#39;. Verificare che il percorso del fascio per il rilevatore interno spettrometro non sia ostruita. </li><li> Clicca su &#39;Imaging Setup&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Elettronica&#39;, selezionare l&#39;appropriata &#39;Speed&#39;, &#39;Under SaRapporto mpling (UDR) &#39;e&#39; Impostazioni Filtri &quot;a seconda del sistema. NOTA: In questo esempio, l&#39;impostazione è di velocità = 2,5 KHz, UDR = 4 e filtri = nessuno. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39; verificare che siano selezionate &#39;fonte Mid-IR&#39;, &#39;Open di apertura&#39; e &#39;al 100% fascio attenuatore&#39;. </li><li> Per calibrare il sistema, nella scheda &#39;Ottica&#39;, selezionare &#39;Detector&#39; come &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; come &#39;sinistra&#39;, e quindi selezionare &#39;trasmittanza&#39; o &#39;Riflessione&#39; sotto &#39;mode Optics&#39; a seconda del tipo di scivolare in uso. </li><li> Fare clic su Imposta, che aprirà la finestra &#39;Lancer Control&#39;. NOTA: Per la modalità di riflessione seguire le istruzioni in 1.12 e 1.13 e per la modalità di trasmissione seguire le istruzioni a 1,14-1,16. Continuare a 1.17 sia per riflessione e trasmissione. </li><li> Per la modalità di riflessione, in &amp;# 8216; &#39;cliccare su&#39; Lancer controllo Raw &#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Successivamente, spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Change &#39;Calore&#39; e opzioni &#39;di contrasto &quot;per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco, questo non avrà alcun effetto sui dati IR. Continuare dal 1.18. </li><li> Per la modalità di trasmissione, in clic &#39;Lancer controllo&#39; su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Regolare il fondo focalizzazione / condensatore obiettivo di aumentare il numero di conteggi al suo maximum. Vedere la forma dell&#39;immagine in basso a destra in Lancer controllo per assicurarsi che sia gaussiana aspetto e relativamente uniforme. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. NOTA: Se uno dei pixel dell&#39;immagine interferogramma FT-IR, a sua volta bianco, ridurre il tempo di integrazione. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Facoltativamente, modificare le opzioni di calore e di contrasto per contribuire a formare l&#39;immagine per migliorare la messa a fuoco, ma non avrà alcun effetto sui dati IR. </li><li> Utilizzando il joystick di controllo fase, spostarsi in una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la &#39;Out Of Range (OOR)&#39; valore è inferiore a 50 e la differenza tra il &#39;High Flux&#39; e conta &#39;basso flusso&#39; è di almeno 4.000 conteggi. </li><li> Seleziona &#39;OK&#39; due volte. Nelle schede ottiche selezionare; &#39;MCT&#39; &#39;rivelatore&#39; =, &#39;Microsfar fronte Detector &#39;=&#39; right &#39;e quindi su&#39; Setup &#39;. A questo punto ci sarà un interferogramma FT-IR sullo schermo. Clicca su &#39;Trova Centerburst&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39;, riselezionare &#39;rivelatore&#39; = &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; = &#39;sinistra&#39; e selezionare &#39;Setup&#39;. </li><li> In Lancer controllo - garantisce che l&#39;immagine è ancora in una zona pulita e fare clic su &#39;Calibra&#39; di nuovo. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Successivamente, il ritiro immagine di sfondo FT-IR per correggere assorbanza dall&#39;atmosfera, sistema e scivolo. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e selezionare una risoluzione spettrale opportuno, tipicamente di 4 cm -1 o 8 cm -1 per tessuti. </li><li> Vai alla scheda &#39;sfondo&#39; e digitare 128 in &quot;Scansioni di co-add &#39;. Selezionare il &#39;Nuovo file ...&#39; pulsante e inserire il file di sfondo in appropriate volteer. Controllare scheda &#39;Imaging&#39; per garantire mosaicatura è 1 di 1. Fare clic su &#39;Contesto&#39;, attendere che la scansione per terminare e confermare dove salvare il file. Fare clic su una regione lo sfondo dell&#39;immagine FT-IR e controllare lo spettro. </li><li> Per fare una grande immagine mosaico del campione, selezionare la scheda &#39;Imaging&#39; e inserire il numero di X e Y cornici per le dimensioni del mosaico che si desidera acquistare. </li><li> Fare clic su &#39;Setup&#39; e in Lancer controllo utilizzare la vista a infrarossi dal vivo per trovare l&#39;area di interesse. Se prendere un mosaico, centrare il feed dal vivo nel centro della zona di interesse. Fare clic su &#39;OK&#39;. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e digitare il numero di scansioni di co-aggiungere (in genere un valore compreso tra 2 e 16 scansioni per il tessuto). Fare clic su &#39;Scan&#39;. </li><li> Controllare l&#39;immagine FT-IR raccolti sullo schermo per assicurarsi che sembra mirato. Clicca sull&#39;immagine per visualizzare uno spettro IR da quella posizione e controllare che sembra avere un segnale accettabile per il rumore. Acquire un&#39;immagine visibile del campione. </li><li> Salvare l&#39;immagine e esportarlo nel formato richiesto, come ad esempio ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adattare un FT-IR Microscopio per capacità ad alta definizione NOTA: La maggior parte dei sistemi FT-IR sono dotati di un obiettivo di circa 15x e 0,5 apertura numerica (NA). Per l&#39;immagine in modalità ad alta definizione, un IR compatibile 36X o 74x obiettivo può essere usato per dare la diffrazione capacità di imaging limitate. <ol><li> Rimuovere obiettivo 15X del sistema svitando in senso antiorario. </li><li> Avvitare la obiettivo 36X o 74x al suo posto. Allineate l&#39;obiettivo prima dell&#39;uso. Utilizzare tubi di prolunga lente di portare l&#39;obiettivo abbastanza vicino al campione. </li><li> Collocare il tessuto sotto il nuovo obiettivo e mettere a fuoco utilizzando la luce visibile utilizzando i binocoli o programma Capture Sample. NOTA: per immagini ad alta definizione deve essere fatto in modo di trasmissione. La distanza molto ravvicinata funzionamento delObiettivi SE (1-2 mm) e molto poca profondità di fuoco richiede fuoco lentamente e con attenzione, prendendo tempo per abbassare l&#39;obiettivo senza toccare il campione. </li><li> Seguire le istruzioni 1,6-1,11. NOTA: A causa di essere molto più difficile mettere a fuoco e molto meno luce che raggiunge il sensore, il seguente protocollo è regolata sulla base di 1,14. </li><li> In modalità di trasmissione, clicca su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), passare al tessuto e concentrarsi (idealmente su un bordo). NOTA: Questo può essere difficile, quindi regolare il &#39;calore&#39; e le opzioni di &quot;contrasto&quot; per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco (queste opzioni non hanno effetto sui dati IR). </li><li> Una volta messo a fuoco, utilizzando il joystick di controllo fase e il live view IR recarsi in una zona pulita della diapositiva. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Regolare il fondo di messa a fuoco dell&#39;obiettivo diaumentare il numero di conteggi al massimo. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. </li><li> Se mosaicatura un&#39;immagine ad alta risoluzione, regolare la fase per consentire il movimento corretto richiesto su distanze per mosaicatura precisa. Per modificare le impostazioni della distanza di scena, andare a &#39;fase Setup&#39; in Lancer controllo e regolare le impostazioni di allineamento orizzontale e verticale per consentire il corretto mosaicatura. </li><li> Utilizzando il joystick passaggio di controllo fase verso una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la Out Of Range (OOR) il valore è inferiore al 50 per entrambi 36X e 74x obiettivi. Assicurarsi che la differenza tra l&#39;alto flusso e bassi valori di flusso è almeno 1000 conteggi per l&#39;obiettivo 74x e 2.000 conteggi per l&#39;obiettivo 36X. </li><li> Continuare 1,19-1,27. Il numero di scansioni in 1.23 e1.25 dovranno essere rettificato per segnale ridotto a circa 256 scansioni per l&#39;immagine di sfondo e 16-128 scansioni per l&#39;immagine del tessuto. </li></ol> 3. visualizzare e classificare IR Datasets Spectral NOTA: In questa sezione, parleremo di come visualizzare ed estrarre i dati da immagini spettrali utilizzando l&#39;elaborazione delle immagini geospaziali e analisi software quali ENVI + IDL, ma il processo è molto simile per qualsiasi software alternativo come MATLAB, software libero come CytoSpec , o il software stesso dello sviluppatore strumento. Ci sono un paio di diverse tecniche di lavorazione spettrale che possono essere eseguite sui dati IR. <ol><li> Aprire elaborazione delle immagini geospaziali e software di analisi e caricare il file di dati a infrarossi. </li><li> Applicare un algoritmo di correzione al basale ai dati IR selezionando &quot;strumenti spettrale&quot; e scorrere verso il basso e fare clic su &quot;spettri di assorbimento&quot;. Osservare un menu pop-up e selezionare &quot;Baseline correction &quot; NOTA: la correzione della linea di base rimuoverà una pendenza spostamento della linea di base dai dati a causa di dispersione </li><li> Eseguire normalizzazione spettrale, da ratioing i dati ad un certo picco spettrale (tipicamente Amide I (1650 centimetri -1) o Amide II (1550 centimetri -1)) o area sotto una regione definita degli spettri. Fare questo selezionando &quot;Normal spettri&quot; sotto i &quot;assorbanza Spectra&quot; Opzioni del menu. NOTA: Spectral normalizzazione viene eseguita in modo che eventuali differenze di spettri sono differenze reali biochimiche e non a causa di spessore o di differenze di densità tra i campioni. </li><li> Utilizzare un algoritmo di riduzione del rumore per rimuovere il rumore dagli spettri, se necessario 28. NOTA: Ci sono diversi approcci disponibili per cui correzione al basale, la normalizzazione spettrale e riduzione del rumore possono essere raggiunti, con la maggior parte dei software con algoritmi automatizzati costruito nel In aggiunta, ci sono un numero emergente di approcci che correggerà per.aberrazioni spettrali, che sono state discusse in dettaglio 29-42; tuttavia, la comunità non è ancora d&#39;accordo su quale di questi sono necessari. </li><li> Osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolti all&#39;interno dell&#39;immagine (tipicamente di una gamma spettrale da 900 a 4.000 cm- 1). Istruzioni sulle frequenze corrispondenti alle specifiche biomolecole osservare un&#39;immagine del tessuto alla frequenza selezionata. <ol><li> Per esempio, cliccare su banda 1650 centimetri -1 osservare la distribuzione delle proteine ​​nel campione. Alternativamente cliccare sulla banda 1080 centimetri -1 osservare la distribuzione degli acidi nucleici nel campione. Utilizzare wavenumber 1.650 centimetri -1. </li></ol></li><li> Crea immagini aggiuntive calcolando rapporti spettrali picco di altezza, rapporti zona di punta, ecc che permetteranno per la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Clicca su &quot;Strumenti spettrali &#39;e quindi selezionare&#39; Rapporti di altezza di picco &#39;o&#39; Calcola Area Immagine &#39;per creare immagini. </li><li> Scansione la sezione corrispondente tessuto adiacente che è macchiato utilizza un intero sistema di scorrimento imager separato che cattura immagini brightfield. L&#39;immagine IR Accanto, visualizzare l&#39;immagine digitale del tessuto macchiato con un programma di immagine visibile. </li><li> Fare clic destro sull&#39;immagine in una regione di interesse e selezionare &#39;profilo Z&#39;. Questo darà le informazioni spettrali al pixel selezionato. </li><li> Guardate gli spettri IR di più pixel di più classi, come ad esempio il confronto tipi di cellule, stati di malattia. Segna i pixel specifici sull&#39;immagine utilizzando il &#39;regioni di interesse&#39; (ROI) strumento. Per eseguire questa operazione, fate clic destro sull&#39;immagine e selezionare &#39;strumento ROI&#39;. Creare le classi che devono essere etichettati, ad esempio normale, displasia, e le classi di cancro. Selezionare quindi, &#39;tipo ROI&#39; - &#39;Point&#39;. Quindi selezionare la classe di selezionare pixel per e disegnare sui pixel appropriate nell&#39;immagine IR via. Ricavare la media spettri fo ciascuna delle classi con lo strumento &#39;ROI medio&#39;. </li><li> Confronta spettri derivata riportando in software grafici. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR è una modalità emergente gratis-label di imaging biochimica di sezioni di tessuto, con la possibilità di avere un ruolo importante nel migliorare l&#39;attuale standard di diagnosi in patologia. Il gold standard attuale per la patologia richiede tessuti essere sottoposte a biopsia, fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati più volte, e colorati con diversi macchie. Un patologo altamente qualificato deve valutare soggettivamente visivamente la struttura del tessuto e la morfologia cellulare per stabilire una diagnosi. Qui vi mostriamo come raccogliere immagini a infrarossi ad alta risoluzione dello stesso tipo di sezioni e discutere alcuni degli approcci computazionali per esaminare le differenze chimiche tra i tipi di cellule e stati di malattia. I passaggi critici all&#39;interno di questo protocollo sono di assicurare che i tessuti sono molto attentamente concentrati e che il sistema è ben calibrato per garantire dati spettroscopici di altissima qualità. La cura durante l&#39;installazione del sistema è particolarmente Criti<html> cal quando si lavora con gli obiettivi ad alto ingrandimento. Per facilitare la risoluzione dei problemi, il seguente elenco descrive alcuni dei potenziali difficoltà incontrate; Problema: bassa intensità IR quando l&#39;imaging in riflessione. Soluzione: Verificare l&#39;orientamento diapositiva IR come il rivestimento riflettente può essere dalla parte sbagliata della diapositiva. Problema: segnale basso / rosso segnale di avvertimento in Lancer controllo. Soluzione: rilevatori raffreddare con LN2. È richiesto azoto liquido per i rivelatori FPA per funzionare e richiede periodicamente di essere ricaricato. Problema: Velocity errori errore / movimento. Soluzione: reimpostare spettrometro e ridurre le vibrazioni. Vibrazioni causeranno lo specchio in movimento nel interferometro essere disturbato. Problema: picchi vapore acqueo in dati. Soluzione: Aumentare spurgo sul sistema e proteggere campione d&#39;aria. Problema: centerburst valido. Soluzione: Trova centerburst di nuovo. e_content &quot;&gt; Problema:. bassa differenza di flusso nella trasmissione, anche se concentrato. Soluzione Regolare condensatore basso Ciò si verifica quando la luce IR non viene focalizzato in un punto sul campione. In questo lavoro, ci siamo concentrati su come acquisire immagini ad alta definizione a infrarossi dei tessuti sia in trasmissione o in modalità trasflettanza. La natura dell&#39;imaging FT-IR, è che ci sono molteplici modifiche che possono essere fatte per l&#39;acquisizione dati, ad esempio, il tipo di substrato, tecniche di fissazione, spessore del campione, risoluzione spettrale, interferometro velocità specchio ecc L&#39;effetto di questi parametri ha stato discusso in ampi dettagli recentemente 4,5,17,51. Ci sono un certo numero di modifiche che possono essere apportate al sistema di imaging compreso l&#39;imaging in modalità ATR 10,24,26 e utilizzando approcci termici nanoscala 52,53 per consentire imaging ad alta risoluzione IR. La limitazione principale con alta risoluzione di imaging IR è che la TIUESTIONI devono essere accuratamente preparati e abbastanza sottili per IR per passare (in genere 4 di spessore micron). Inoltre, la trasmissione e riflettanza FT-IR di imaging richiede i campioni ad essere asciutta a causa della assorbanza IR dall&#39;acqua. Tuttavia, imaging FT-IR ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche, in quanto può immagine molto rapidamente grandi aree di tessuto mentre derivanti ricca e dettagliata informazioni biochimiche. Altre tecniche simili che derivano informazioni biochimiche in un modo libero-label includono la spettroscopia Raman, ma il tempo di acquisizione dei dati è molto più lento di acquisire immagini. Approcci di imaging Nuovo Raman stanno emergendo tra cui diffusione stimolata Raman (SRS) e Coherent Antistokes Raman (CARS); Tuttavia, essi hanno accesso gamma spettrale limitato o di imaging singola frequenza. I progressi nella velocità di acquisizione dei dati, risoluzione spaziale, e la disponibilità di approcci computazionali sono stati di enorme valore nel fare FT-IR imagzione un approccio più fattibile per la traduzione come un nuovo strumento di imaging in patologia. I recenti progressi nella risoluzione spaziale sono stati particolarmente importanti per la patologia dei tessuti a causa di tipi di cellule non siano risolvibili con sistemi di imaging FT-IR convenzionali. Il recente articolo di Reddy et al. mostrato come modellare un sistema ideale per ottenere la risoluzione spaziale ottimale di un sistema di imaging FT-IR 5. L&#39;esempio tessuto renale presentato in questo documento dimostra l&#39;importanza di risoluzioni spaziali elevate per estrarre informazioni biochimiche dalle strutture glomerulari (Figura 3 e Figura 5). In futuro, nuovi progressi in Quantum Cascade Laser come molto luminose sorgenti di luce IR 54-57, 3D immagini spettrali 58, e innovazioni nel campo delle tecnologie su scala nanometrica IR 52,53,59,60 detengono nuovi entusiasmanti percorsi di ricerca che possono avere enormi implicazioni per il futuro di imaging dei tessuti. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abbiamo presentato esempi di applicazioni in fegato e malattie renali in cui vi è la necessità di informazioni biochimiche aggiuntivo che può essere di valore diagnostico. La Spectral Patologia Lab presso il Dipartimento di Patologia presso la University of Illinois a Chicago si concentra sulla traduzione delle tecnologie di imaging IR per migliorare la diagnosi della malattia e migliorare la previsione della prognosi del paziente. Imaging FT-IR può superare alcuni dei limiti attuali di pratica patologia che richiedono informazioni quantitative e obiettiva. In particolare, il lavoro futuro si concentra sull&#39;identificazione aree in pratica patologia attuale, in cui le tecniche attuali non riescono a fornire un adeguato sensibilità diagnostica o fornire informazioni limitate. Esiste una chiara necessità di migliorare la pratica attuale di patologia e verso dare più informazioni al patologo sullo stato di malattia del paziente, che può essere realizzabile utilizzando ad alta definizione di immagini FT-IR.

Spettroscopia IR è stato uno strumento di analisi disponibili in qualche forma dal 1930; tuttavia, è stato solo nell&#39;ultimo decennio che l&#39;area di imaging dei tessuti con FT-IR è esploso. I progressi nella FT-IR per l&#39;imaging dei tessuti sono stati guidati in gran parte da tre sviluppi fondamentali: 1) aumento della velocità di acquisizione dei dati a causa della disponibilità di grandi Focal Plane Array (FPA) rilevatori che in genere hanno migliaia di IR rivelatori sensibili 1 , 2, 2) lo sviluppo di algoritmi di elaborazione avanzate e la potenza di calcolo per gestire grandi quantità di dati iperspettrali set 3, e 3) la modellazione di sistemi di imaging FT-IR per massimizzare la risoluzione spaziale di 4,5. Ci sono stati numerosi di alta qualità e molto ampi articoli rivedere il campo della spettroscopia FT-IR recentemente 6-16, oltre a un documento di natura protocolli che illustra le fasi per ottenere punto spettri o le mappe da tessuti 17. In questo articolo, ci concentreremo sulla protocol di ottenere immagini di tessuti utilizzando un rivelatore FPA 128 x 128 in un sistema FT-IR modificato con capacità ad alta definizione. Imaging FT-IR è stato a lungo suggerito uno strumento potenzialmente auspicabile per l&#39;imaging cellulare e tissutale dovuta alla capacità di ottenere immagini in cui ogni pixel ha una ricchezza di informazioni biochimiche. Imaging FT-IR si basa sul principio che diverse biomolecole in un campione saranno quantitativamente assorbire diverse regioni del medio infrarosso; questo consente la derivazione di un &#39;impronta digitale biochimico&#39;. Questa impronta digitale era stato dimostrato in molti studi di modificare tra i diversi tipi di cellule e stati di malattia. Diversamente pratica patologia convenzionale quando macchie e marcatori immunoistochimici devono essere utilizzati per la visualizzazione e identificare i tipi cellulari e strutture tissutali che vengono utilizzati per guidare opzioni diagnosi e trattamento, le immagini da FT-IR sono formate sulla base biochimica intrinseca del tessuto. Il techniq attualeue di tessuto colorazione per la diagnosi è in termini di tempo, distruttivo, laborioso, e richiede competenze personale di patologo, mentre FT-IR offre la possibilità di rendere questo processo rapido, non distruttivo, altamente automatizzato, e più obiettivo. Inoltre, FT-IR fornisce un nuovo percorso per ottenere ulteriori informazioni biochimiche che potrebbe non essere prontamente accessibili usando tecniche di colorazione convenzionali. Uno dei progressi più interessanti degli ultimi anni è stata la disponibilità di approcci di imaging ad alta risoluzione che può ora permettere per la visualizzazione e la caratterizzazione di tipi di cellule e strutture del tessuto che sono fondamentali per una completa diagnosi della malattia. Una di queste tecniche è Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR che incorpora un obiettivo a immersione solido (SIL) di un alto indice di rifrazione, che consente per imaging ad alta risoluzione 18, con molti studi molto interessanti che mostra le sue applicazioni 19-25. Inoltre, wcome ha recentemente dimostrato che la risoluzione spaziale maggiore associato a immagini ATR può permettere per la visualizzazione e la classificazione delle cellule endoteliali e mioepiteliali nel tessuto mammario che costituiscono una componente chiave della diagnosi di cancro al seno 26. Mentre l&#39;imaging ATR è molto utile, questa tecnica richiede la SIL di entrare in contatto con il tessuto per formare immagini FT-IR; Pertanto, il suo uso è un po &#39;limitato per patologia dei tessuti in cui le grandi regioni di tessuti devono essere rapidamente ripreso. Un secondo approccio è stata dimostrata accoppiando un obiettivo ad alto ingrandimento un sistema FT-IR esistente che utilizza un sincrotrone come fonte luminosa di IR, è possibile illuminare completamente un FPA e l&#39;immagine con una dimensione di pixel effettiva di 0,54 x 0,54 micron. Questo ha permesso a noi di visualizzare strutture chiave in seno e della prostata tessuti che non erano risolvibili con sistemi convenzionali FT-IR 4. Mentre questi aumenti drammatici in immagine IR resolutio spazialen fosse emozionante, il suo uso è rimasto limitato a causa di richiedere un sincrotrone. Successivamente, un sistema ottimale creata che potrebbe anche consentire funzionalità di imaging ad alta definizione con una dimensione di pixel 1,1 x 1,1 micron, senza il requisito di una sorgente di sincrotrone bensì utilizzando una sorgente IR Globar tradizionale 5. In questo articolo, vi mostriamo come modificare un sistema di imaging esistente commerciale FT-IR per consentire la diffrazione IR limitato l&#39;imaging dei tessuti con un segnale accettabile per rumore con obiettivi multipli IR (15X, 36X, e 74x). Il formato di pixel effettivi con i tre obiettivi è 5.5 x 5.5 micron (15X), 2,2 x 2,2 micron (36X) e 1.1 x 1.1 micron (74x). Abbiamo poi diamo alcuni esempi dell&#39;importanza dei guadagni in risoluzione spaziale per la rilevazione della malattia in fegato e reni biopsie 27.

<table><tbody><tr><td>Cary 600 Series FT-IR system</td><td>Agilent</td><td>Multiple configurations&amp;nbsp;</td><td>Alternate FT-IR imaging systems exist</td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR</td><td>Edmund Optics</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIR slide</td><td>Kevley Technologies</td><td>CFR</td><td>For FT-IR reflection-mode measurements</td></tr><tr><td>Barium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Calcium Fluoride slides</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>Multiple sizes</td><td>For FT-IR transmission-mode measurements</td></tr><tr><td>Dry Nitrogen/Dry Air gas</td><td>Multiple gas suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Multiple sizes</td><td>For deparafinizing tissue</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Multiple cryogenic liquid suppliers</td><td>Multiple sizes</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDL software</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>Other software packages available</td></tr><tr><td>Whole slide Imager</td><td>Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td><td></td><td>To image stained slides</td></tr></tbody></table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) di imaging spettroscopico è un approccio emergente per ottenere immagini dettagliate che sono associate informazioni biochimiche. Imaging FT-IR di tessuto si basa sul principio che diverse regioni del medio infrarosso sono assorbiti dai diversi legami chimici (ad esempio, C = O, CH, NH) all&#39;interno delle cellule o tessuti che possono poi essere legati alla presenza e alla composizione di biomolecole (ad esempio, lipidi, DNA, glicogeno, proteine, collagene). In un&#39;immagine FT-IR, ogni pixel all&#39;interno dell&#39;immagine comprende un intero infrarossi (IR) dello spettro che può dare informazioni sullo stato biochimico delle cellule che possono essere sfruttati per tipo cellulare o malattia tipo di classificazione. In questo articolo, vi mostriamo: come ottenere immagini a infrarossi da tessuti umani mediante un sistema di FT-IR, come modificare la strumentazione esistente per consentire la funzionalità di imaging ad alta definizione, e come visualizzare le immagini FT-IR. Abbiamo poi presentiamo alcune applicazioni di FT-IRper patologia utilizzando il fegato ei reni come esempi. Imaging FT-IR detiene applicazioni interessanti nel fornire un percorso romanzo di ottenere informazioni biochimiche dalle cellule e tessuti in un percorso che non generi completamente libero-label verso dando nuova visione cambiamenti biomolecolari come parte di processi di malattia. Inoltre, queste informazioni biochimiche può potenzialmente consentire un&#39;analisi obiettiva e automatizzato di alcuni aspetti della diagnosi della malattia.

Imaging FT-IR consente la derivazione di immagini IR di tessuto che possono dare diversi contrasti seconda della frequenza IR di interesse. Inoltre, in un&#39;immagine IR, ogni pixel comprende l&#39;intero spettro IR, con differenti picchi corrispondenti a differenti biomolecole che possono dare informazioni sulle proprietà biochimiche di tipi cellulari o stati di malattia (Figura 1). Qui, abbiamo dimostrato come confrontare le firme spettrali tra le classi, ma più avanzato classificazione automatica è possibile utilizzando algoritmi aggiuntivi 3,43-50, quali la classificazione bayesiana, foreste casuali, reti neurali artificiali e gerarchiche Cluster Analysis è possibile eseguire sul dati. Approcci classificazione supervisionata consentiranno per la costruzione di un classificatore che può essere addestrato per consentire il riconoscimento automatico di tipi cellulari o stati di malattia. Approcci classificazione non supervisionata possono essere utilizzati per cercare naturale difrenze nei tessuti o cellule a causa della varianza biochimica. Strumentazione FT-IR si è evoluta nel corso degli ultimi decenni, dalla misurazione in un unico punto modalità / mapping tramite IR aperture opachi alla modalità di imaging con obiettivi Cassegrain, utilizzando un obiettivo illuminante accoppiato con un obiettivo di raccolta nella trasmissione-mode o un unico obiettivo che entrambi illumina e raccoglie in riflessione-mode (Figura 2). È stato recentemente dimostrato che l&#39;obiettivo di raccolta in trasmissione potrebbe essere commutata per un ingrandimento maggiore e oggettivo apertura numerica per consentire diffrazione limitata immagini IR, che porta a sostanziali aumenti la risoluzione spaziale delle immagini IR raccolti 4,5. I progressi nella risoluzione spaziale per l&#39;imaging dei tessuti sono stati di fondamentale importanza come ora siamo in grado di identificare i tipi di cellule e strutture del tessuto, per esempio, le unità funzionali del rene, i glomeruli, utilizzando adattato in-houseSistemi FT-IR (Figura 3). Ad alta definizione di immagini FT-IR consente di ottenere immagini dettagliate di tessuti da esaminare per identificare le regioni anormali e di identificare le differenze biochimiche tra diversi tipi di cellule. In un nucleo tessuto epatico, è possibile visualizzare epatociti e regioni di infiltrazione fibrosi che divide due distinte aree di displasia e cirrosi non displastiche (Figura 4). Stiamo lavorando per sfruttare questo per rendere gli strumenti diagnostici automatizzati per l&#39;utilizzo in casi difficili di malattia del fegato. È importante sottolineare che la maggiore risoluzione spaziale può ora permettere di isolare specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificati chimicamente dalla malattia prima alterazioni istologiche sono evidenti. Ad esempio, siamo concentrati sull&#39;identificazione cambiamenti biochimici nelle strutture glomerulari renali come capsula di Bowman, mesangio, membrana basale glomerulare e membrana tubolare seminterrato, prima<html> modifiche individuate dal patologo può essere osservato (Figura 5). In particolare, siamo interessati a individuare cambiamenti associati con la progressione della nefropatia diabetica e rigetto cronico nei pazienti sottoposti a trapianto, dove le tecniche attuali non riescono a identificare i cambiamenti in modo abbastanza presto per un intervento di successo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figura 1. immagini FT-IR e spettro di un nucleo fegato. Immagine di (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica e immagini di assorbanza IR della sezione di serie della stessa core a (B) 3.286 centimetri -1 e (C) 2.603 cm -1, che ha evidenziato diverse caratteristiche strutturali. (D) tipico spettro IR del tessuto, con picchi importanti etichettati. Bar Scala = 100 micron.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figura 2. Ottica dettaglio i modi di funzionamento microscopio FT-IR schematici. (A) in modalità di trasmissione, il campione è illuminato attraverso l&#39;obiettivo di fondo, e la luce che passa attraverso il campione viene raccolto dall&#39;obiettivo top. (B) In modalità di riflessione, l&#39;obiettivo prioritario serve sia per illuminare il campione e per raccogliere la luce riflessa. L&#39;obiettivo di fondo non viene utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figura 3. Confronto di different obiettivi del microscopio sulle immagini FT-IR di un glomerulo renale a 2.925 centimetri -1. (A) 15X oggettivi raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 5.5 x 5.5 micron pixel). (B) 36X obiettivo di raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 2,2 x 2,2 micron pixel). (C) 74x raccolta obiettivo con NA = 0,65 (dimensioni 1,1 x 1,1 micron pixel). Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figura 4. differenze spettrali tra fibrosi e epatociti in un nucleo del fegato. (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica. (B) L&#39;immagine di un nucleo sezione seriale digitalizzata in FT-IR (36X impostazione oggettiva). (C) Repspettri rappresentativi della epatociti e fibrosi, presi dalle regioni di tessuto indicati dalle frecce in (A) e (B). Scala bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figura 5. La differenziazione delle caratteristiche biopsia del tessuto renale attraverso l&#39;uso di imaging ad alta definizione FT-IR. (A) periodica sezione colorata acido Schiff con le caratteristiche da estrarre etichettato. (B) ad alta definizione FT-IR immagine della regione che si estende CH 2 asimmetrica (36X configurazione oggettiva) di una sezione di serie del tessuto stesso. (C) Caratteristiche etichettato (A) estratto utilizzando l&#39;immagine FT-IR in (B) per poter chimicamente differentiate le quattro caratteristiche del tessuto. Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.1K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Optical Frequency Domain Imaging di<em&gt; Ex vivo</em&gt; I campioni polmonari Resezione: Ottenere One to One immagine per Istopatologia Correlazione

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Ricerca

Bioingegneria

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Medicina

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universale Mano libera tridimensionale optoacustica Imaging Probe per Deep Tissue angiografia umana e funzionali studi preclinici in tempo reale

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Ricerca sul cancro

Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy techniques. The protocol involves terahertz transmission mode at normal incidence and terahertz reflection mode at an oblique angle of 30&#176;. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. The terahertz electric field signal transmitted through a fixed point on the excised tissue is processed, through an analytical model, to extract the refractive index and absorption coefficient of the tissue. Utilizing a stepper motor scanner, the terahertz emitted pulse is reflected from each pixel on the tumor providing a planar image of different tissue regions. The image can be presented in time or frequency domain. Furthermore, the extracted data of the refractive index and absorption coefficient at each pixel are utilized to provide a tomographic terahertz image of the tumor. The protocol demonstrates clear differentiation between cancerous and healthy tissues. On the other hand, not adhering to the protocol can result in noisy or inaccurate images due to the presence of air bubbles and fluid remains on the tumor surface. The protocol provides a method for surgical margins assessment of breast tumors.

Freshly excised human breast cancer tumors are characterized with terahertz spectroscopy and imaging following fresh tissue handling protocols. Tissue positioning is taken into consideration to enable effective characterization while providing analysis in a timely manner for future intraoperative applications.

This manuscript presents a protocol to handle, characterize, and image freshly excised human breast tumors using pulsed terahertz imaging and spectroscopy ...

Ingegneria

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Imaging Multimodale e la piattaforma Microendoscopy Spettroscopia Fiber-fascio per non invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Analisi dei tessuti

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

L'imaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende l'approccio alla multiplexità

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo completo per l'identificazione cellulare e l'analisi metabolica con OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: OPTIR-FISH integrato per l'analisi metabolica e dell'identità a singola cellula in ambienti complessi

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

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