The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

ملاحظة: جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول تتم وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها المملكة المتحدة وزارة الداخلية وجامعة أدنبرة الخدمات البيطرية. 1. العدوى من الفئران بواسطة التغذية الأنبوبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر Heligmosomoides polygyrus L3 اليرقات في الماء المقطر لمدة تصل إلى ستة أشهر في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستخدام، وغسل L3 اليرقات ثلاث مرات في الماء المقطر: أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل)، إزالة كافة ولكن 500 ميكرولتر من الماء (لتجنب مقلقة مكعبات اليرقات L3) و resuspend بيليه في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الثالث، إضافة الماء إلى وحدة تخزين المحدد (عادة 40 مل)، ونضح 20 ميكرولتر مع خفض غيض 200 ميكرولتر لتوسيع الفتحة التي. مكان اثنين 20 عينة ميكرولتر على سطح صحن الثقافة 60 مم وعدد اليرقات L3 (عادة المحمول، وأفضل ينظر تحت 50X التكبير مع مجهر تشريح). resuspend الكرية النهائي في الماء المقطر إلى concentratioن من 2،000 L3 اليرقات لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج دورة الحياة، وتصيب القديم أسابيع 8 F1 (C57BL / 6xCBA) الفئران مع 400 H. polygyrus L3 اليرقات في 200 ميكرولتر من الماء المقطر عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم (كبح الفئران في وضع مستقيم من القفا من الرقبة وتمر بلطف الإبرة أنبوب تغذية حادة عن طريق الفم والمريء إلى المعدة). تستنهض الهمم قبل شامل لكل العدوى (اليرقات تستقر بسرعة في الماء) ونضح 200 ميكرولتر في حقنة 1 مل. استخدام إبرة التغذية الأنبوبية مخصصة مع نهاية مدورة. للعدوى التجريبية من الفئران الشابة (6-8 أسابيع من العمر)، أو السلالات الفطرية الأخرى (مثل C57BL / 6 أو BALBc)، تصيب الفئران مع 200 L3 اليرقات. </li></ol> 2. الانتشار وصيانة H. polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفحم في وسط حوض بلاستيكية كبيرة وتسمح للماء الصنبور البارد لتشغيل أكثر من ذلك لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (غير مغسولة الفحم المنشط هو سامة للL3 اليرقات). استنزاف المياه من الحوض ووضع الفحم على رالتعليم الجامعي طبقات من الورق ماصة، وتركها معرضة للهواء الغرفة حتى تجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هناك حاجة البيض، كشط البراز أول من خرج من القولون مع ملقط (ومقص إذا لزم الأمر). إذا كان هناك حاجة لعدد كبير من L3 اليرقات، ووضع الفئران على شبكة الأسلاك وجمع الكريات البرازية على مدى عدة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج البراز مع الفحم حبيبات في نسبة ما لا يقل عن 1: 1، لتحقيق الاتساق فقط رطبة بما يكفي لتنضم لتصفية الورق. تشويه طبقة رقيقة في وسط بعض ورق الترشيح مبللة في طبق بتري ووضع هذا في مربع رطب (إضافة بعض منشفة ورقية رطبة وطبق من الماء) في الظلام لمدة 12-14 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة L3 اليرقات من يوم 7 وما بعده، وجمع لهم على مناسبتين على الأقل قبل أن يتم التخلص منها ورقة. اليرقات تشكل حلقة حول حافة ورقة الترشيح. رفع ورقة الترشيح للخروج من طبق بتري وشطف اليرقات التي تم تركها من لوحة (باستخدام ماصة و 5 مل من الماء المعقم لكل لوحة) في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفعمن ورقة الترشيح وحصاد اليرقات المتبقية تركت على لوحة مع الماء المقطر في أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في حل النفايات السائلة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل اليرقات ثلاث مرات بالماء المقطر ثم تخزين عند 4 درجات مئوية في ما يصل الى 50 مل من الماء المقطر حتى المطلوبة. ملاحظة: يرقات تبقى قابلة للحياة والمعدية لمدة 6 أشهر على الأقل. </li></ol> 3. جمع الكبار H. polygyrus الديدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز بيرمان تعديل مقدما كما هو مبين في الشكل (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران الذبح بعد أربعة عشر يوما من العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البطن مع الايثانول 70٪. قطع الجلد على البطن وسحب الكشف عن جدار البطن الأمامي. جعل شق خط الوسط لدخول التجويف البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأمعاء الصغيرة والكبيرة بأكمله (من الاثني عشر الداني إلى القاصي المستقيم). ضع في طبق بتري الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصويب القناة الهضمية على طوله بأكمله؛ استئصال القولون براز التي تحتوي على. وضع هذا في طبق منفصل للتحضير البيض في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال 20 سم الداني من الأمعاء الدقيقة التي تحتوي على الديدان البالغة -identified من قبل جدار سميك نسبيا من العفج وغالبا ما يكون ظهور الأحمر بسبب الديدان داخل اللمعية. المكان الى (100 مم) طبق بيتري مع 5 مل من محلول هانكس &quot;، تحسنت إلى 37 درجة مئوية (عينتين لكل طبق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الداني الأمعاء جزء مليئة دودة طوليا مع مقص (مقص ذهابا وانتهت هي الأفضل لهذا)، وكشط أسفل داخل القناة الهضمية بطانة مع اثنين من الشرائح الزجاجية لإزالة الديدان. ثم تجاهل جدار الأمعاء نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان معلومات سرية إلى أكياس صغيرة الشاش، التيلة مغلق وآمن مع الدبابيس الورقية حول حافة القمع الزجاج (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء قمع مع الحل هانكس &quot;وإضافة ما يقرب من 4 أطباق بتري من الديدان في كل القمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الجهاز في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة، اثارة بلطف في منتصف الطريق من خلال لإزاحةالحطام من إعداد القناة الهضمية التي قد تسد مرشح الشاش. الحرص على تجنب تسرب الحطام خارج كيس الشاش - وهذا سوف يسبب تلوث إعداد HES النهائي. الديدان البالغة يجب أن هاجر ببطء من خلال قطعة قماش الشاش واستقروا في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار الزجاج. فصل بعناية أنبوب الاختبار من ربط خرطوم مطاطي خلال بالوعة (مع الحرص على تجنب فقدان الديدان عند هذه النقطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل الديدان في أنبوب 50 مل وغسل ست مرات مع هانكس &quot;الحل (السماح الديدان ليستقر مع الجاذبية، وإزالة وسائل الاعلام مع stripette، إضافة 40 مل من هانكس&quot; الحل وكرر خمس مرات). يجب أن تبقى الثقافة دودة عقيمة من هذه النقطة فصاعدا: ملاحظة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى غطاء تدفق الصفحي وغسل ست مرات أخرى في محلول معقم هانكس &quot;تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل، وعلى استعداد للثقافة في المختبر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدالديدان البالغة تعافى من خلال اتخاذ عينتين من 20 ميكرولتر تناولها مع خفض غيض الأصفر لتوسيع فتحة فيه؛ نتوقع ما يقرب من 50٪ من كمية اليرقات الملقحة. </li></ol> 4. إعداد الثقافات لHES: متوسطة إعداد وغسل الديدان الكبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الديدان من 3.11 في حوالي 10 مل من RPMI تستكمل مع 10٪ جنتاميسين لمدة 20 دقيقة، وترك يستريح أنبوب في زاوية لضمان وتغطي الديدان بشكل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ هذا في غطاء تدفق الصفحي: يغسل مرة أخرى ستة مرات مع الحل هانكس &quot;(تستكمل مع 5 U / البنسلين مل و 5 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد H. وسائل الإعلام polygrus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على عقم في الصفحي تدفق غطاء محرك السيارة، إلى 500 مل من RPMI1640، إضافة 11.1 مل من 45٪ جلوكوز (تركيز النهائي 1.2٪ كما RPMI1640 يحتوي على 0.2٪ الجلوكوز)، 5 مل من 100X Peniclllin، الستربتوميسين (تركيز النهائي 5 U / البنسلين مل، 5 ميكروغرام / الستربتومايسين مل)، و 5 مل من L-الجلوتامين (تركيز النهائي 2 مم)، و5 مل من جنتاميسين (تركيز النهائي 1٪). لا تقم بإضافة FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان قسامة في قوارير T25 تنفيس، تقريبا. 1،000 الديدان في 15 مل H. polygyrus وسائل الإعلام في قارورة، ومكان تستقيم في الحاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) لمدة 3 أسابيع. </li></ol> 5. إعداد HES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع HES التي تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة من الثقافات على فترات لا تزيد عن مرتين في الأسبوع، ووضع جانبا الأول جمع بعد 24 ساعة من ثقافة (بسبب ارتفاع مستويات التلوث LPS والبروتينات المضيفة - يمكن معالجتها أو التخلص منها بشكل منفصل). إبقاء كل مجموعة منفصلة وصفت بشكل واضح مع تاريخ ورقم الدفعة. استبدال مع حجم مساو من H. وسائل الإعلام polygyrus في كل مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي HES التي تحتوي على وسائل الإعلام في 400 ز س لمدة 5 دقائق. ثم تصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون مرشحات منخفضة البروتين ملزم إلى 50 مل أنابيب. متجر في الثلاجة -20 درجة مئوية وصفت بشكل واضح مع تاريخ الحصاد دودة وتاريخ HES جollection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 21 يوما من جمع HES من الثقافة، وتجاهل الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع 500-1،000 مل من HES طاف (عادة من الأسهم المجمدة، وليس بما في ذلك جمع ساعة الأولى 24) والتركيز على مرشح 3،000 MWCO في جهاز الترشيح الفائق تحت ضغط النيتروجين. ملاحظة: كن حريصا جدا على ألا تدع على المدى مرشح الجافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد جهاز مرشح، وغسل أول الجانب اللامع 3 كيلو دالتون غشاء أسفل في كوب 1 لتر بالماء المقطر لمدة 3 × 20 دقيقة في حين اثارة. تجميع جهاز الترشيح الفائق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع غشاء فلتر الجانب اللامع فوق. مكان في مجلس الوزراء في 4 درجات مئوية وتمرير 50 ​​مل من الماء المقطر من خلال قبل البدء في التركيز HES المجمعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كل أنبوب من HES في جهاز الترشيح على النحو المطلوب (100-140 مل في اليوم الواحد)، حتى يتركز خفض مستوى الصوت إلى 2-5 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إزالة الملوثات من وسائل الإعلام الثقافة HES التي تحتوي على، إضافة 50 مل من فندق Pyrمجانا ogen-PBS إلى الجهاز الترشيح وثم التركيز وصولا الى ما يقرب من 2 مل. كرر هذه الخطوة مرتين (150 مل من برنامج تلفزيوني في المجموع). نقل HES في أنبوب 15 مل، تعقيم فلتر (مع 0.2 ميكرون فلتر) في غطاء تدفق الصفحي وقياس تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي (E 280 = 10) أو عن طريق الفحص برادفورد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة، والتسمية مع رقم الدفعة وتاريخ، وتجميد في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص LAL مولد اللون وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة على كل دفعة من HES قبل استخدامها. إذا كانت مستويات LPS أكبر من 1 U LPS لكل 1 ميكروغرام من البروتين، والنظر في عدم استخدام هذه الدفعة لفي التجارب المجراة أو في الثقافات المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة HES جمعها في 24 ساعة على حدة بنفس الطريقة. وسوف تحتوي LPS وبعض البروتينات المضيفة و، في حين لا تصلح للتجارب وظيفية، بل هو مصدر مفيد للجزيئات الفردية التي قد تكون معزولة التي كتبها وحيدة النسيلة تنقية الجسم المضاد التقارب. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

دورة حياة H. عائدات polygyrus بطريقة متسقة بشكل موثوق. بعد تناولها طبيعي أو أنبوب تغذية عن طريق الفم من L3 اليرقات في اليوم 0، الخراجات تبدأ في تشكيل تحت المصلية الاثني عشر بعد يوم 5، تتقدم إلى التبديلات اليرقات ثم الناشئة مثل الديدان البالغة في تجويف الأمعاء من يوم 10، ويمكن رؤية البيض في البراز من اليوم 14 وأورام حبيبية مرئية على سطح المصلي الاثني عشر من يوم 21. البروتوكول هو موضح أعلاه (وتلخيصها في الشكل 6) يسمح لإنتاج عالية الإنتاجية من H. polygyrus-مطرح إفرازية المنتجات (HES)، بالإضافة إلى الانتعاش يمكن الاعتماد عليها اليرقات L3 قابلة للالتهابات دورة التجريبية والحياة في المستقبل. وقد تبين H. العدوى polygyrus إلى حماية في نماذج من الربو تعتمد على OVA أو دير ص 1 (بيت سوس الغبار الحساسية) 14. وعلاوة على ذلك، يمكن نقل قمع التهاب الشعب الهوائية مع CD4 + CD25 + </suP&gt; خلايا T التنظيمية 14 أو CD19 + CD23 مرحبا خلايا B التنظيمية 24 من غير توعية، H. -infected polygyrus الفئران. في نماذج من المناعة الذاتية، H. وقد تبين إصابة polygyrus أن تكون قمعية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) نموذج تجريبي من التصلب المتعدد 9، ويمكن نقل قمع إما خلايا CD4 + T أو خلايا CD19 + B من الفئران المصابة 24. Heligmosomoides polygyrus المنتجات مطرح-إفرازية (HES) تعدل الاستجابة المناعية المضيفة وقمع التهاب TH2 بوساطة من قبل عدد من الآليات (المبين في الشكل 7)، بما في ذلك: أ) تثبيط الاستجابة الخلايا الجذعية لتحفيز 25، ب) تحريض CD4 + Foxp3 + خلايا T التنظيمية 18. وج) الحصار من IL-33 إنتاج 20. وقد تبين HES إلى حماية عندما تدار لر توعية أو تحديا في النموذج OVA-الشب من الربو 19 وأيضا عندما تدار الأنف مع استخراج النوباء حساسية 20، من خلال قمع أوائل IL-33 الإصدار. تجنب التلوث LPS من HES غالبا ما يكون حاسما لنجاح التجارب المناعية في المستقبل. في البروتوكول المذكورة هنا، والخطوات الحاسمة في تحقيق هذه هي لضمان أن الحطام الواردة ضمن أكياس الشاش لجهاز بيرمان لا يدخل إعداد HES النهائي (انظر 2.10) وتوضع جانبا حل ES من ساعة 24 الأولى للثقافة (انظر 5.1). خلال السنوات الأخيرة، تم HES تتميز بدقة على مستوى بروتيوميك مع أكثر من 370 البروتينات متميزة حددت 26،27. وبالإضافة إلى ذلك، ES من مرحلة اليرقات 4 قد تعرض للتحليل البروتين 28. ويشمل العمل الجاري تميز مكونات غليكان الرئيسية للHES، من المعروف أن مناعة بقوة 3، ويفرز الصغرى RNكما أن يتم تغليف في الحويصلات 50-100 نانومتر أو exosomes (باك وآخرون، المقدمة للنشر). مع إنشاء بروتوكولات استنساخه لجمع ES من هذا الطفيلي المناعية للغاية، والذي يتضمن بيانات البروتين واسعة تحديد المكونات الجزيئية للHES، يتم تعيين الآن مرحلة لتحديد واختبار العلاجي من الجزيئات الفردية من H. polygyrus التي يمكن التوسط آثار رئيسية على الجهاز المناعي المضيف.

Heligmosomoides polygyrus هي الديدان الطفيلية المعوية الفئران الطبيعية التي ترتبط ارتباطا وثيقا عالية السائدة الطفيليات الخيطية البشرية 1. وعلى النقيض من نماذج الخيطية أخرى مثل النيبونية البرازيلية، H. polygyrus يضع باستمرار عدوى مزمنة في الفئران كنتيجة مباشرة الآليات المناعية قوية متعددة توظف لقمع المضيف الاستجابة المناعية 2. H. polygyrus لديها دورة الحياة المباشرة: يتم تناولها المعدية اليرقات L3 التي كتبها انتقال FECO الفم (أو عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم في إعداد مختبر تدار)، وعندها تهاجر إلى طبقة subserosal من العفج والموسوعي قبل أن يعود إلى لمعة الأمعاء كما الديدان البالغة بعد حوالي ثمانية أيام الإصابة الأولى. يحدث التزاوج وإنتاج البيض بعد يوم 10 وأنه من الممكن لحصاد الديدان البالغة للثقافة وجمع من المنتجات مطرح-إفرازية من داص 14 وما بعدها 3. H. يتفاعل polygyrus أيضا مع الدقيقة المتعايشة مع زيادة البكتريا المكونة موجودة في الفئران المصابة عرضة 4-6، وزيادة مستويات H. عدوى polygyrus التالية تعرض الفئران لالبكتريا المكونة 6. عدوى نشطة مع H. وقد تبين polygyrus للحماية ضد الباثولوجيا المناعية في العديد من النماذج الحيوانية المناعة الذاتية 7-10، والتهاب القولون والحساسية 11،12 13-16. وقد كانت هناك بالتالي اهتماما كبيرا في إمكانات جزيئات إبرازي-إفرازية من هذا الطفيلي (&quot;HES&quot;) إلى أسفل تعدل علم الأمراض في الجسم الحي 17،18. في الواقع، وينظر إلى آثار وقائية بعد العلاج من الفئران مع منتجات HES 19 من خلال مسارات التي يجري حاليا التعرف 18،20. نحن هنا وصف بروتوكول لإنتاج موثوق لHeligmosomoides polygyrus واستعادة منتجاتها يفرزالتي يمكن استخدامها كذلك على مجموعة من التحقيقات البيوكيميائية والمناعية وظيفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (المعروف سابقا باسم Nematospiroides dubius، وأشار أيضا إلى بعض كما H. المخابز) هي الديدان الطفيلية المعوية المناعية التي توظف آليات متعددة لإنشاء عدوى مزمنة في الفئران وعن كثب تشبه السائدة العدوى بالديدان الإنسان. H. وقد درست polygyrus نطاق واسع في مجال تنظيم المناعة المستمدة من الديدان الطفيلية وتم العثور على قمع أكثر قدرة النماذج التجريبية للحساسية والمناعة الذاتية (على حد سواء مع عدوى نشطة والمنتجات يفرز معزولة). بروتوكول صفها في هذه الورقة يحدد إدارة H. polygyrus دورة الحياة لإنتاج ثابت من L3 اليرقات، والانتعاش من الطفيليات الكبار، ومجموعة من المنتجات مطرح إفرازية الخاصة بهم (HES).

القابلية للإصابة مع H. يتم التحكم polygyrus إلى درجة كبيرة من الخلفية الوراثية للسلالة الماوس (الجدول 1)؛ C57BL / 6 و CBA الفئران هي عرضة 21،22. لصيانة دورة حياة الطفيل، وقد تم اختيار هجين F1 بين هذه السلالات اثنين لقدرته على تحمل أعباء دودة أعلى من ذلك بكثير دون الاعتلال (المفرط الضرر الظهارية في الأمعاء) مقارنة إما سلالة الأبوية. يستخدم أنبوب تغذية عن طريق الفم من 400 L3 اليرقات للحفاظ على دورة الحياة في الفئران F1 (مما يؤدي إلى أعباء دودة الكبار هو مبين في الشكل 2)، في حين جرعة من 200 L3 اليرقات يستخدم عادة للتجارب في سلالات الفطرية متماثلة اللواقح (على سبيل المثال، C57BL / 6 أو BALBc). ومع ذلك، قد تحتاج هذه الجرعة إلى أن تخفض اعتمادا على العوامل البيئية المشتركة التي قد تختلف بين مرافق الحيوانات، مثل الاختلافات في النباتات الأمعاء. وقد أثبتت دفعات من HES ايفي استنساخهcacy في المقايسات الفنية وتكوين البروتين. وعلاوة على ذلك، وعندما تم تحليل supernatants من كل أسبوع على التوالي من الثقافة، وتصل إلى ما مجموعه 4 أسابيع، وعثر على ملامح البروتين لتكون مشابهة جدا (الشكل 3). وعندما يتم قياس تركيز HES التي كتبها برادفورد فحص (انظر 5.5)، والمجموع البروتين هو عادة حوالي 1 ملغم / لتر (الشكل 4). طريقة بديلة من التركيز HES هو مع المكثف الطرد المركزي (على سبيل المثال Vivaspin 3 كيلو دالتون قطع غشاء)، حيث يتم نسج عينات على ما يصل إلى 4،000 غرام في الدوار الطرد المركزي سوينغ التدريجي، وإزالة الأملاح العازلة وانخفاض مكونات الوزن الجزيئي. هو الانسب تركيز الطرد المركزي في أحجام معالجة صغيرة (1-10 مل)، وتقتصر على عامل تركيز أقصى ما يقرب من 30X. عند جمع HES، وتجنب التلوث أمر بالغ الأهمية. لتجنب التلوث مع جزيئات المضيف، نحن تجاهل HES-تابعaining سائل الإعلام والثقافة من ساعة 24 الأولى بعد الحصاد دودة البالغين من الأمعاء الماوس. نحن أيضا قياس مستوى التلوث LPS في كل دفعة من HES مع مقايسة اللونية LAL (انظر 5.7). 1 U من LPS يعادل ~ 100 خريج LPS وتعتبر مستويات أقل من هذا لا تذكر 23. في أيدينا، فإن معظم دفعات من HES هي أقل بكثير من الحد المسموح به، متوسط ​​تركيز LPS في HES كونها 0.23 U / ميكروغرام (الشكل 5). آثار LPS في نماذج في الجسم الحي علم الأمراض (على سبيل المثال قمع الردود الربو) يتطلب لا يقل عن 10 نانوغرام من LPS 23. وبالتالي في إدارة الجسم الحي من 5 ميكروغرام HES من دفعة مع 100 خريج LPS / ميكروغرام HES ستشمل 500 LPS خريج، أقل بكثير من التركيز الفعال حيث يصبح LPS مشكلة. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> الشكل 1: بيرمان جهاز بايرمان الإعداد جهاز لجمع H. الكبار polygyrus (كما هو موضح في القسم 2). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> الشكل 2: يعني دودة عبء 14 أيام بعد الإصابة مع 400 L3 اليرقات متوسط ​​دودة الأعباء بعد 14 أيام من العدوى مع 400 L3 اليرقات. نقاط البيانات المبينة لمن 19 جولات منفصلة من إصابة الفئران C57BL / 6xCBA. يعني ± SEM هو مبين. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> الرقم 3: لمحات من البروتين HES من أسابيع متتالية في الثقافة الشخصية SDS-PAGE من البروتينات HES جمعها في الأسابيع المتتالية للثقافة. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> الشكل (4): </s<html> ترونج&gt; الكمية النهائية من HES من 500 مل وسائل الإعلام العائد من البروتين HES من 11 دفعات مختلفة مشتقة من حوالي 500 مل من ثقافة طاف يحتوي على ES-. يعني ± SEM هو مبين. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> الشكل 5: LPS تلوث مستويات HES التلوث LPS في 41 دفعات من HES يقاس ameobocyte فحص الليمول. متوسط ​​تركيز LPS = 86 U في ملغ من HES. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> الشكل 6: الرسوم المتحركة تخطيطي لH. ملخص polygyrus دورة الحياة من رئيسية من مراحل دورة حياة من أنبوب تغذية عن طريق الفم من L3 اليرقات، من خلال استرداد من اليرقات والديدان الكبار لعزل HES. -together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" /> الرقم 7: الرسوم المتحركة تخطيطي لHES وظائفها الآثار المناعية الرئيسية للوساطة القابلة للذوبان وexosomes الواردة في HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> النمط الجيني (وسلالة الخلفية) </td><td> النمط الظاهري العدوى الأولية </td><td> إشارة </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> سلالات الفطرية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J، CBA، C3H </td><td> عرضة للغاية </td><td> 22،29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 و C57BL / 10 </td><td> عرضة </td><td> 22،30 </td></tr><tr><td> BALB / ج، DBA / 2، 129 / J </td><td> متوسط </td><td> 22،31 </td></tr><tr><td> NIH، SJL، SWR </td&gt; <td> انخفاض القابلية </td><td> 22،32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> المعدلة وراثيا لالسيتوكينات أو مستقبلات خلوى </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> أكثر عرضة </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> أقل عرضة (أ)؛ أي تغيير في حساسية ولكن زيادة حبيبية (ب) </td><td> (أ) 33 </td></tr><tr><td> (ب) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ المعدلة وراثيا (C57BL / 6) </td><td> مقاوم </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> الخصوبة أعلى </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 أو BALB / ج) </td><td> عرضة للغاية </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / ج أو C57BL / 6) </td><td> مقاومة عالية </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 المعدلة وراثيا(FVB) </td><td> مقاوم </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> نقص TH2، وانخفضت الحبيبي gormation </td><td> 39،40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / ج) </td><td> أكثر عرضة </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ج) </td><td> أي تغيير في حساسية </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> ارتفاع TH1، زيادة الميل </td><td> 41،42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> المعدلة وراثيا لعلامات خلية T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / ج) </td><td> أعلى هامشيا الخصوبة </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / ج) </td><td> الخصوبة أعلى </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / ج) </td><td> الخصوبة المرتفعة و# 160؛ </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> المعدلة وراثيا لمواضع المناعي الفطري </td><td></td></tr><tr><td> نوع 1 الانترفيرون مستقبلات (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> الخصوبة أعلى، والمزيد من أورام حبيبية </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> أكثر مقاومة، والمزيد من أورام حبيبية </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / ببخار الماء (WBB6) </td><td> أكثر عرضة </td><td> 46،47 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: العدوى الأولية مع H. polygyrus في سلالات مختلفة الماوس وراثيا والجينات مستهدفة.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus هي الخيطية الفئران مع قدرات المناعية القوية التي تشبه تلك التي عالية انتشارا عدوى الديدان الطفيلية البشري. نحن هنا وصف بروتوكول لصيانة طويلة الأجل للH. polygyrus دورة الحياة.

زراعة<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; إن المناعية نيماتودا الطفيلي ومنتجاتها يفرز

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.0K Views.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus هي الخيطية الفئران مع قدرات المناعية القوية التي تشبه تلك التي عالية انتشارا عدوى الديدان الطفيلية البشري. نحن هنا وصف بروتوكول لصيانة طويلة الأجل للH. polygyrus دورة الحياة. 

Video: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A الفحص الإنقاذ والتحول لفحص مضاد الليشمانيات الطفيلي داخل الخلايا ضد<em&gt; الليشمانيا الدونوفانية</em&gt; Amastigotes في THP1 الحادة اللوكيميا الإنسان الوحيدات الخط الخليوي

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل &quot;Acufection&quot; وتطبيقه لبحوث الجلد

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...