The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. يطير الجيل الخط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد اثنين من بنيات مختلفة. في بناء أول، RpL10A كدنا] (الريباسي البروتين الوحيدات L10a) يتم استنساخ المصب من GFP إلى pUASP-PL-GFP-Nter البلازميد (نسخة معدلة من 32). استخدام المروج سلالة الجرثومية يسمح استخدام أكثر متعدد التكافؤ من خط المعدلة وراثيا. ملاحظة: الحصول على بناء الثاني عن طريق الاستنساخ التسلسل التنظيمي القيادة التعبير الأنسجة محددة من الجين ترهل المنبع من GAL4 (TF) باستخدام pPTGAL4 البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البلازميدات على حدة إلى 1118 ث الذباب وإدراج يبني في الجينوم الذبابة التي كتبها P-عنصر الإدراج (وفقا للإجراءات القياسية) 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر transformants من أجل استعادة خطوط الطيران مع يبني على اثنين من الكروموزومات مختلفة. يتم إنشاء خط TRAP النهائي من خلال الجمع بين هذين الخطين (الصلبان الوراثية) من أجل الحصول على خط واحد ثابت المزدوج المعدلة وراثيا. F0: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. MKRS / TM6Bس W-؛ CYO / المجلس الأعلى للجامعات، التهدل GAL4 / TM6B. F1: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. ترهل GAL4 / TM6B. كبير تضخيم هذا الخط، وجمع الأجنة نظموا المطلوب. </li></ol> 2. جمع الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 8 أقفاص السكان اسطوانية كبيرة تحتوي على حوالي 40 غراما من الذباب الشباب في قفص (حوالي 180،000 الذباب / القفص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في ما يسمى ما قبل الأناشيد التي تسمح الذباب لمسح الأجنة النامية من ناقلة البيضات بهم. لذلك، ووضع الذباب لمدة 1 ساعة على طبقين 11 سم القطر بتري تحتوي على خليط من طدت أجار وعصير العنب وتغطية ⅓ من السطح مع طازجة من صنع عجينة الخميرة. بعد 3 تبادل العنب لوحات عصير جمع الأجنة حقيقية على مماثلة لوحات مصنوعة حديثا. وتختلف فترة حضانة وفقا لالتنموي الوقت النافذة درس: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من أقفاص وتركهم في نفس درجة الحرارة للمدة الزمنية اللازمة للحصول على مرحلة تنموية الصحيحة (على سبيل المثال، 3 ساعة من وضع البيض + 10 ساعة من الخا<html> IONAL حضانة يعطي الأجنة من مرحلة 10-13 ساعة بعد وضع البيض (AEL)). Resuspend والمحتوى لوحة (الأجنة، معجون الخميرة، الذباب الميت) مع 50 مل من الماء باستخدام الفرشاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذهب من خلال سلسلة من المناخل (700 ميكرون، 355 ميكرون، 112 ميكرون) لفصل الأجنة من الذباب الميت وتبقى أجزاء الجسم وجمع الأجنة المتبقية على منخل قطرها أصغر، ثم تغسل لفترة وجيزة في الماء منزوع الأيونات. لا تستخدم أكثر من 18 لوحات في جمع لأنها يمكن أن تسد المناخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة Dechorionate في 4.5٪ التبييض في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة ويشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات لمدة 30-60 ثانية. احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20، 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، لمدة 5-10 دقيقة في RT في إطار التحريض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الجافة على السليلوز ورقة ماصة ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. وزن الأنابيب وفلاش تجميد الأجنة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل. في هذه المرحلة، والأجنة المجففة ويمكن تخزينها لعدة أشهر في -80 ° C. </li></ol>الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. إعداد الخرز المغناطيسي إلى جانب لGFP الضد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend بدقة بروتين G حبات مغناطيسية في زجاجة الأصلية عن طريق الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 90 ميكرولتر من الخرز لأنبوب ريبونوكلياز خالية وجمعها على المغناطيس (30-60 ثانية). 90 ميكرولتر من الخرز ضروري لأداء مناعي (IP) مع 1 مل من المحللة التي تحتوي على 60-80 ملغ / مل البروتينات. احترام نسب لمنع حبة التشبع. استخدام العديد من الأنابيب وفقا لكمية البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مع 1 × PBS 0.01٪ توين 20 (500 ميكرولتر) وجمع حبات على مغناطيس لتجاهل طاف. إضافة 30 ميكروغرام من GFP الأضداد في 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20 إلى الخرز واحتضان مع نهاية بطيئة على نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس (30-60 ثانية)، ونبذ طاف وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome (HEPES 10 مم، 150 مم بوكل، MgCl 2 5 ملم، DTT 0.5 ملم، تريتون 1٪، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل ، العلاقات العامةotease المانع 1 ×، ريبونوكلياز المانع 100 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس وإضافة 500 ميكرولتر من عرقلة العازلة (BSA 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، الحمض الريبي النووي النقال الخميرة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، جليكوجين 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر في polysome استخراج العازلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في RT وكرر هذه الخطوة مرة واحدة مع عازلة تمنع الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome، ثم يتذكر الخرز والشروع فورا في خطوة immunopurification (المادة 6). </li></ol> 4. المحللة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء، وإعداد البرنامج على حبات السرعة متعددة الاتجاهات طاحونة: 2 × 10 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، 15 ثانية وقفة. نقل الأجنة المجففة (1.5 غرام) إلى 15 مل أنابيب prechilled على الجليد التي تحتوي على استخراج العازلة polysome، والتجانس على الفور. التجانس 1.5 غرام من الأجنة في 4 مل من استخراج العازلة polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتشار المتجانس الأجنة في اثنين prechilled 2 مل أنابيب وطحن امبرينظام التشغيل عن طريق تشغيل برنامج الخالط. نقل المحللة إلى أنابيب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد وإعداد طاف خلف النواة بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 غرام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنبوب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد، إضافة 1/100 حجم العينة من 10٪ Nonidet P-40 لطاف (تركيز النهائي = 0.1٪)، وتخلط برفق بواسطة قلب الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبض الطرد المركزي العينة في minifuge لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 09/01 حجم عينة من 300 ملي 1،2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (تركيز النهائي = 30 ملم )، ومزجها بلطف بواسطة قلب الأنبوب، واحتضان الخليط على الجليد لمدة 5 دقائق (مزيج من قبل قلب عدة مرات خلال الحضانة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طاف بعد الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20000 ز. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد: يجب أن يكون التركيز في المحللة بين 60-80 ملغ / مل. تيأك طاف لجديد أنبوب microcentrifuge prechilled جديدة والشروع فورا في الخطوة ما قبل امتصاص (القسم 5). </li></ol> 5. قبل امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما resuspend والخرز المغناطيسي من قبل الإثارة لطيف ونقل 30 ميكرولتر من الخرز في أنبوب microcentrifuge في RT (30 ميكرولتر من الخرز / 1 مل المحللة الجنينية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس، ماصة قبالة طاف، و resuspend حبات في استخراج العازلة polysome (500 ميكرولتر). جمع حبات على مغناطيس، إضافة المحللة الجنينية، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على محور دوار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخرز والحفاظ على طاف على الجليد للخطوة immunopurification. قبل immunopurification، والحفاظ على 100 ميكرولتر من طاف (المدخلات) لمقارنة عينة الحمض النووي الريبي العالمية مع عينة الحمض النووي الريبي التي تم جمعها بعد immunopurification، من خلال RT-QPCR على سبيل المثال. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل (الموافق 60-80 ملغ / مل بروتين) ل-استيعابها قبل المحللة إلى أنبوب خالية من ريبونوكلياز تحتوي على 90 ميكرولتر من الخرز منعت بالإضافة إلى GFP الأضداد. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع طيف خلط نهاية الإفراط في نهاية في محور دوار أنبوب. بدلا من ذلك، نفذ حضانة O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة، وجمع حبات على مغناطيس. استخدام minifuge لتدور باستمرار الخرز، resuspend ثم لهم في 500 ميكرولتر من غسل العازلة (HEPES 10MM، بوكل 350MM، MgCl 2 5MM، Nonidet P-40 1٪، DTT 0.5 ملم، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل، ريبونوكلياز المانع 100 U ) وجمعها على المغناطيس. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير حبات لprechilled أنبوب ريبونوكلياز خالية الجديد ويغسل مرتين. جمع حبات على مغناطيس، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 مل TRiZol مباشرة إلى الخرز واتبع تعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 7. RNA التنظيف وتقييم الجودة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدة RNeasy مايكرو حسب تعليمات الشركة الصانعة. في الإنجاز، elutالبريد RNA مع (س) ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه. دافئ لمدة 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية، وتخزين العينات المجمدة الإضافية في -80 ° C. تحقق RNA الجودة باستخدام bioanalyzer (اتبع تعليمات الشركة الصانعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار خصوصية TRAPed RNA، نفذ النسخ العكسي في 3 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى (المدخلات وIP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (مرتفع III). استخدام كدنا] التي تم الحصول عليها عن QPCR باستخدام مجموعات التمهيدي الجينات المحددة. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

توضح هذه الورقة المعدلة الترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية البروتوكول (يطلق عليها اسم &quot;TRAP-الصليب الأحمر&quot;) مخصصة لدراسة السكان الخلية نادرة في الأجنة ذبابة الفاكهة. يتم توفير معلومات عن الخطوات الرئيسية لعزل ناجحة من الحمض النووي الريبي معين مع تحقيق عائد مناسب لميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها، أي 1) كمية من المواد البيولوجية المطلوبة وإجراء الأمثل للتحلل الجنين واستخراج polysome. 2) الخرز / نسب للمناعي الأمثل المحللة الأجسام المضادة ل؛ 3) خطوات السماح الحد من الخلفية بما في ذلك غسل تكوين عازلة وذلك لتشغيل تجارب TRAP RC مع خصوصية عالية وحساسية. هذا البروتوكول غلة البيانات استنساخه مما يجعل تطبيقها بسهولة إلى أي نوع من أنواع الخلايا الأخرى. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لتحليل الفرق التعبير الجيني على مستوى مرنا بنشاط-ترجمة وبالتالي تمهيد الطريق لفهم البروتين التعبير في المواصفات<html> IFIC نوع من الخلايا في إطار زمني محدد. ومع ذلك نلاحظ أن وفرة البروتين سيعتمد على معدل عمليات الترجمة والتدهور. العيوب الرئيسية للطريقة TRAP هو عدم قدرتها على قياس محتوى البروتين بطريقة كمية دقيقة أو للكشف عن تعديل آخر متعدية. يمكن تحسين الكمي عن طريق قياس كثافة الريبوسوم على طول الجسم مرنا، وعند القيام بذلك، بطريقة الخلية من نوع معين جعل TRAP جنبا إلى جنب مع الريبوسوم البصمة أداة قوية جدا. في ورقة حديثة 34، تم إجراء هذا المزيج في الجنينية الكلى 293 الخلايا البشرية. ونشرت الكتاب البصمة نوكلياز تليها تنقية تقارب من شكل المعقدة البيروكسيديز محرض من RpL10A باستخدام الخرز streptavidin. هذا هو دليل على مبدأ أنه من الممكن لأداء البصمة الريبوسوم في الحي كله في حين استهدفت نوع خلية معينة، وتقييد يجري كمية المواد البيولوجية اللازمة لهذا الغرض. &quot;&gt; إجراء التجارب TRAP بالتوازي مع التحليلات transcriptomic العالمية سوف تجعل من الممكن لتتبع النسب بين حديثا كتب وactively- ترجمة RNA، وهذا سيكون بالمعلومات عميق لآليات ما بعد النسخي المحتملة التي تجري في سياقات تنموية محددة أو السكان خلية معينة microRNAs بقلم على سبيل المثال. في الختام، TRAP يعد طريقة فعالة للغاية ومحددة وحساسة لتحديد الرنا بد أن بنشاط-ترجمة ريبوسوم بطريقة خلية محددة. هذه الطريقة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية وأنواع الأنسجة. وكان محسن بروتوكول TRAP-الصليب الأحمر الجديد هو موضح هنا للالسكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا) وكمية من المواد النهائية كافية للتحليلات لاحقة على مستوى كامل الجينوم. A الحد الممكن من هذا الأسلوب هو شرط دافعا قويا لإنتاج ريبوسوم الموسومة في كمية كافية لتراكبمؤسسة التدريب الأوروبية بأخرى لازال المحلية في نوع من الخلايا المستهدفة. في دراسة حديثة 25، قدرت الكتاب إلى 10-30٪ نسبة الموسومة مقابل ريبوسوم لازال. للتغلب على هذه المشكلة زيادة UAS-RpL10A-EGFP عدد نسخة من شأنه أن يحسن بشكل كبير هذا التوازن. بدلا من ذلك، إضافة إلى خلفية وراثية وصف التحوير UAS-GAL4 وتضخيم إنتاج البروتين GAL4 وغير مباشرة زيادة التعبير عن RpL10A-EGFP. وهذا ينبغي أن تحبذ عقد الإشغال أفضل للريبوسوم الموسومة على مرنا. لاحظ أن هذا نهج فعال بالفعل ويمكن إجراء أكثر قوة وتكييف الأساليب المكملة لجلب المزيد من الجانب الكمي أو لاكتشاف وكشف الآليات الجزيئية التي تعد ضرورية للسيطرة على التعبير الجيني.

فهم كيفية الخلايا تكتسب خصائص محددة خلال التنمية أمر بالغ الأهمية من أجل إدراك تعقيد الأجهزة وتطورها المحتمل تجاه الحالات المرضية. هناك دفعة كبيرة لبحث فك شبكات الجينات التنظيمية تشكل أساس مواصفات الخلايا والتمايز التي كتبها unrevealing ملامح التعبير الجيني العالمية، ووضع ملزمة بول الثاني، شغل النسخ عامل في تسلسل التنظيمية أو التعديلات بعد متعدية من الهستونات. لتقييم التعبير الجيني في ميكروأرس على الصعيد العالمي وتستخدم نهج RNA وما يليها. ميكروأرس تسمح للكشف عن وفرة مرنا، في حين RNA وما يليها هو أفضل موجهة لإعلام على أنواع مختلفة من الرنا بما في ذلك الترميز وغير المرمزة noncoding الموجودة الرنا مثل microRNAs، lncRNAs أو snRNAs. ومع ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا تفرق نسخه بنشاط، حالة استقرار مرنا، بنشاط-ترجمة مرنا، ومرنا دخول عملية التحلل. قياس ثابت-شارع<html> تناولوا مستويات مرنا أنه من المعروف أن تقدير ضعف تكوين بروتيوم 1-3. في العكس من ذلك، تحديد بنشاط-ترجمة مرنا يعطي صورة أكثر دقة لإنتاج البروتين. ومع ذلك، فقد تم أساسا أدت الدراسات transcriptomic على مستوى كامل الحي من خلال مقارنة بالربح أو الخسارة من وظيفة عامل محدد لمن النوع البري شرط 4-7 أو على تشريح الأنسجة، مما يجعل ملامح التعبير الجيني يصعب تفسيرها. التطورات الحديثة في أدوات استهداف الخلايا، وتنقية تقارب وتحسن حساسية تسمح الآن لإجراء تحليلات واسعة الجينوم على السكان خلية أو خلايا صغيرة حتى واحدة في الكائن الحي. في ذبابة الفاكهة، مجموعات كبيرة من خطوط المعدلة وراثيا تمكن محددة تستهدف الزمني والمكاني من الأنسجة المختلفة والفئات السكانية الخلية عن طريق نظام GAL4 / UAS 10/08 العائد الكمي أكثر دقة من الآليات الجزيئية المطلوبة لوظيفة الخلية. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; ومن بين المناهج المطورة حديثا polysome وقد وصفت التنميط التي كتبها تجزئة كوسيلة لالتقاط بنشاط-ترجمة RNA 11. هذا الأسلوب يعتمد على السكروز التدرج الطرد المركزي يسمح اختيار جزء polysome وتحديد مرنا ترجمت على نطاق الجينوم عند تحليلها مع ميكروأرس أو التسلسل عميق. ويمكن أن يقترن Polysome العزلة مع نوكلياز الهضم لتحديد آثار أقدام الريباسي المقابلة لشظايا الحمض النووي الريبي التي يحميها ريبوسوم خلال عملية الترجمة 12. البصمة الريباسي يزيد من دقة التحديد الكمي للترجمة RNA وقرار RNA على مستوى تسلسل وتحديد المواقع الريبوسوم، يجعل من الممكن لقياس معدل الترجمة. إلا أنه حتى اليوم لم يتم تطبيقه على عزل خلية محددة من translatomes، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض قوي في الغلة RNA التي تم الحصول عليها في نهاية عملية البصمة الريبوسوم. وبالنظر إلى أن اختيار حجم RNA قد تولد المحتملين كاذبة صositives من RNPs المختلفة التي يمكن أيضا حماية RNA بطريقة مماثلة، وهناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الريباسي البصمة وتكييفها مع النهج خلية محددة. واحد من هذه الأساليب، ودعا وصفت في ترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) في عام 2008 من قبل هيمان وآخرون. وتطبق على عزل translatome من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الفئران. قبل حاتمة العنونة بروتين الريباسي بطريقة الخلية من نوع معين، polysomes يمكن تنقيته بشكل انتقائي دون خطوة شاقة من التفكك الخلية والفرز. في هذه الحالة، 60S البروتين الريباسي L10a على سطح الريبوسوم كانت المعلمة مع EGFP 13. منذ عام 2008، وقد استخدمت العديد من الدراسات هذه الطريقة في أنواع مختلفة من الفئران 14-19 إلى العاشرة المورق 20،21، 22،23 الزرد ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 24. كما تم تكييف طريقة TRAP للنموذج ذبابة الفاكهة وتستخدم لبوريمن mRNAs من الخلايا العصبية 25 و 26 النجمية السنة المالية المحددة من نوع الخلية. تم استخدام ثنائي نظام GAL4 / UAS متعددة للتعبير عن RpL10A GFP الموسومة بطريقة الأنسجة محددة. تم تشريح رؤساء الذباب الكبار لأداء اختيار polysome من الخلايا العصبية (التي تستهدفها عموم العصبي سائق Elav-GAL4) والرنا المعزولة والتسلسل. يتفق عدد كبير من الجينات تنظم يصل إلى أن يعرف أن يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي، مشيرا إلى أن النهج خصوصية جيدة ودفع لنا لتكييفه مع السكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا) الحاضر في وضع الأجنة ذبابة الفاكهة . ضمن نموذج ذبابة الفاكهة، والمرحلة الجنينية هي نموذج للاختيار لدراسة العمليات التنموية، والجهات الفاعلة الجزيئية والحركات التخلق يتم حفظها التطورية. وقد تم تنفيذ النهج transcriptomic الوحيدة الأنسجة محددة التي أجريت حتى الآن في هذا النموذج باستخدام خلايا أو حتى النوويةrting وكانت فقط قادرة على دراسة Transcriptome على الحالة المستقرة 27-31، وخلق الحاجة إلى طرق مخصصة لالأنسجة / خلية محددة translatome التنميط في الجنين الطاير. نحن هنا تقرير أول بروتوكول TRAP مخصصة لأجنة ذبابة الفاكهة. مع هذا الأسلوب، وتشارك في الترجمة مرنا في السكان الخلية محدودة جدا من حوالي 100 خلايا العضلات في جنين تم عزل بنجاح مع جودة عالية وخصوصية. يتم استخدام GAL4 / نظام UAS ثنائي لدفع التعبير عن RpL10A الموسومة GFP في حيوانية من العضلات دون أي سمية، لا الظواهر الواضحة أو تأخر في النمو كما هو موضح سابقا 25. أجنة ذبابة الفاكهة تمتلك 30 العضلات في hemisegment التي من شأنها أن تؤدي إلى الجهاز العضلي من اليرقة. باستخدام المنطقة التنظيمية التي اكتشفت في المنطقة المجاورة للهوية الجينات ترهل، 6 من 30 العضلات متعددة الأنوية هي المستهدفة. في هذا الاختبار، وثبتوا ريبوسوم على مرنا باستخدام استطالة الترجمةالمانع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم استخدام مقتطفات عصاري خلوي لتنقية تقارب مع حبات مغناطيسية المغلفة الأجسام المضادة GFP. تم التحقق نوعية RNA تنقيته باستخدام bioanalyzer. وقد استخدم الكمي عكس النسخ PCR (RT-QPCR) لتحديد خصوصية وحساسية مرنا العزلة وأثبتت أن لدينا بروتوكول الأمثل هو كفاءة عالية.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

ويتكون نظام العضلات الجسدية الجنينية ذبابة الفاكهة من 30 العضلات في hemisegment، وكل العضلات لديها مجموعة محددة من خصائص: كود الجينات الهوية، والموقف، وعدد من الفعاليات الانصهار، ومواقع الحجز وتعصيب. وتحديد ترجم مرنا في مجموعة فرعية محددة من العضلات إعطاء معلومات عن البروتينات اللازمة لتشكيل هذه الخصائص محددة من العضلات. باستخدام طريقة القائم على TRAP، RNA من جزء من السكان من عضلات التعبير عن ترهل الجينات الهوية وتنقيته (الشكل 1A-B). ومصدر القلق الرئيسي لهذا النهج هو نوعية وخصوصية الحمض النووي الريبي معزولة. بروتوكول الأمثل ذكرت هنا مكن انتعاش منهجية عالية الجودة RNA المقررة مع التحليل bioanalyzer. وتظهر الصورة التي تم الحصول عليها أي تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 1C). في الدراسات التي وضعت حول طريقة TRAP، أثيرت تساؤلات بشأن خصوصية البيانات. هنا نحن طmprove طريقة لقمع الخلفية المرتبطة ملزم من الحمض النووي الريبي لحبات أو أنابيب غير محددة والاستفادة المثلى من غسل العازلة. من أجل تقييم مستوى الخلفية وكفاءة عزل الخلايا، معربا عن ترهل، ونحن أدت التجارب RT-QPCR على 3 مكررات من نفس المرحلة الجنينية. أضعاف التخصيب من 4 جينات مختلفة (mef2، ترهل، بروسبيرو، soxNeuro) حسبت مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32 (1D الشكل). وأظهرت هذه النتائج تخصيب 2.3 أضعاف من mef2 الجينات عموم العضلات وتخصيب 5.6 أضعاف من الجين ترهل. في المقابل، الجينين أعرب في النظام العصبي وقد المنضب مقارنة المدخلات. لوحظ تغيير القيم أضعاف مشابهة جدا على 3 مكررات البيولوجية، مما يدل على أن البروتوكول هو القوي. مع سائق التهدل-GAL4 وبدءا من 1.5 غرام، حول 1.5x10 ^ 6 أجنة تم الحصول عليها التي تحتوي على 100 خلية GFP / جنين (ما مجموعه 150 × 10 ^ 6 إيجابيةالخلايا). بعد تشغيل التجربة TRAP، العائد حوالي 25-45 نانوغرام من الحمض النووي الريبي محدد اعتمادا على مرحلة من الفائدة. هذه المواد هي كافية لتشغيل تحليل ميكروأري أو RNA وما يليها باستخدام بروتوكول التضخيم لبناء مكتبة RNA وما يليها. سوف الكفاءة تعتمد بشدة على قوة السائق تستخدم للتعبير عن RpL10A-EGFP. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> الشكل 1. الجودة وتقييم نوعية من الحمض النووي الريبي معزولة TRAP من التهدل-GAL4&gt; الأجنة UASRpL10A-EGFP. (AB) صور متحد البؤر لمرحلة 16 الجنين تظهر RpL10A-EGFP التعبير على وجه التحديد في ست خلايا العضلات التهدل في hemisegment (A). لوحظ شارك في توطين RpL10A-EGFP مع الجنرال علامة العضلات Beta3tubulin على الصورة دمج (B). (C) مراقبة الجودة من TRAPed RNA ران على bioanalyzer تبين سلامة مثالية للالريباسي 18S 28S و. تحليل (D) RT-QPCR يظهر نوعية عالية من التجارب مرنا معزولة TRAP في 3 مكررات البيولوجية المرحلة 16 الأجنة. ويتم احتساب تغيير أضعاف مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32. Mef2 النصوص موجودة في كل الأنساب العضلات هي إثراء 2.3 أضعاف مقارنة لإدخال النصوص في حين ترهل أكثر تقييدا ​​هي المخصب 5.6 أضعاف. تنضب الخلايا العصبية معربا عن بروسبيرو والجينات soxN 2.2 أضعاف و 5.5 أضعاف على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Genetics

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochemistry

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

الترسيب المناعي للريبوسوتاغ في الخلايا الجرثومية للفأر الذكر

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

إعداد على نطاق متوسط من

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

الترسيب المناعي للريبوسوتاغ في الخلايا الجرثومية للفأر الذكر

كله جبل RNA نيون

تحديد البروتين البروتين التفاعل في

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

إعداد على نطاق متوسط ​​من

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

الترسيب المناعي للريبوسوتاغ في الخلايا الجرثومية للفأر الذكر

كله جبل RNA نيون

تحديد البروتين البروتين التفاعل في

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من

إعداد على نطاق متوسط من