The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Hattı Üretimi <ol><li> İki farklı yapıları oluşturmak. İlk yapıda, RpL10A cDNA&#39;sı (ribozomal protein alt-birim L10a) pUASP-PL-GFP-nter plazmidi içine GFP alt klonlanır (32&#39;den versiyonu değiştirilmiş). Bir germ promoterinin kullanılması transgenik hattı daha polivalan tüketimine olanak sağlar. Not: pPTGAL4 plasmidi kullanılarak GAL4 (TF) yukarı sarkma geninin doku spesifik ifade sürüş düzenleyici sekansı klonlanmasıyla ikinci yapı elde edilir. </li><li> 1118 sinekler w içine ayrı ayrı plazmidler enjekte edilir ve 33 (standart prosedüre göre) P-eleman yerleştirilmesi ile sinek genomuna yapıları yerleştirin. </li><li> Sırayla seçin transformants iki farklı kromozomlar üzerinde yapılarla sinek hatlarını kurtarmak için. Nihai TRAP satır bir çift transgenik istikrarlı bir çizgi elde etmek için bu iki satır (genetik haçlar) birleştirilerek oluşturulur. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX w; cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Devasa bu çizgiyi yükseltmek ve istenen aşamalı embriyolar toplamak. </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Kafes başına genç sineklerin yaklaşık 40 gr içeren 8 büyük silindirik nüfus kafesleri hazırlayın (180,000 sinekler / kafes civarında). </li><li> Sinekler onların yumurta kanalına gelişmekte embriyolar temizlemek için izin sözde öncesi duracak şekilde devam edin. Bunun için, katılaşmış agar ve üzüm suyu bir karışımını içeren iki 11 cm-çapında petri çanakları üzerine, 1 saat boyunca sinekler koymak ve taze yapılmış maya hamurlu yüzeyinin ⅓ kapsamaktadır. Üzüm 3 borsalarında sonra suyu plakalar benzer taze yapılmış plakalar üzerinde gerçek embriyolar toplamak. NOT: İnkübasyon süresi çalışılan gelişimsel zaman pencereye göre değişecektir. </li><li> Kafeslerden plakaları çıkarın ve addit (ör: Yumurtlama 3 saat + 10 saat, doğru gelişim aşamasını elde etmek için gerekli süre aynı sıcaklıkta onları terkional inkübasyon 10-13 saat yumurtlama (AEL)) sonra sahneye gelen embriyolar verir. Bir fırça kullanarak 50 ml su ile plaka içeriği (embriyolar, maya salçası, ölü sinekler) süspanse edin. </li><li> Ölü sinek embriyolar ve kalan vücut parçaları ayırmak ve daha küçük çaplı elek üzerinde kalan embriyolar toplamak, daha sonra deiyonize su kısaca yıkamak için elekler (700 mikron, 355 mikron, 112 um) bir dizi üzerinden gidin. Bu elekler yapışmasına neden olabilir olarak koleksiyon başına en fazla 18 plakları kullanmayın. </li><li> Deiyonize su içinde% 4.5 çamaşır suyu Dechorionate embriyolar, 2 dakika ve 30-60 saniye boyunca iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın. Çalkalama altında oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca PBS% 0.01 Tween 20, 100 ug / ml sikloheksimid embriyolar inkübe edin. </li><li> Selüloz emici yaprak Kuru embriyolar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz. Tüpleri tartılır ve sıvı azot içine daldırma ile embriyolar flaş dondurma. Bu aşamada, kurutuldu, embriyolar, -80 ° C&#39;de birkaç ay boyunca saklanabilir. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. GFP Antikor için Coupled Manyetik Boncuk hazırlanması <ol><li> İyice hafif çalkalama orijinal şişesinde protein G manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Transferi 90 bir RNaz ücretsiz tüp boncuk ul ve bir mıknatıs (30-60 saniye) onları toplamak. Boncukların 90 ul 60-80 mg / ml proteinlerini içeren lizat 1 ml immünopresipitasyon (İP) gerçekleştirmek için gereklidir. Boncuk doygunluğu önlemek için oranları uyun. Protein miktarına göre birkaç tüpleri kullanın. </li><li> Mıknatıs üzerinde Wash 1 × PBS% 0.01 Tween 20 (500 ul) ile boncuk ve boncuk toplamak süpernatant atmak için. Tanelere PBS% 0.01 Tween 20 350 ul GFP antikorun 30 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırma sonunda boyunca yavaş ucu ile inkübe edin. </li><li> Mıknatısın (30-60 saniye) ile ilgili boncuk toplayın süpernatan atılır ve polisom ekstraksiyon tampon 500 ul yıkayın (Hepes, 10 mM, KCI, 150 mM, MgCI2, 5 mM DTT, 0.5 mM, Triton% 1, Sikloheksimit 100 ug / ml , Protease 1 x inhibitörü, RNaz inhibitör 100 U). </li><li> Mıknatıs üzerine boncuk toplayın ve engelleme tampon 500 ul ekleyin (BSA 0.1 ug / ul, maya tRNA 0.1 ug / ul, Polizom ekstraksiyon tamponu içinde 0.1 ug / ul glikojen). </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ve taze bloke edici tampon ile bir kez bu adımı tekrarlanır. </li><li> Daha sonra boncuk hatırlamak ve immünolojik saflaştırma adım (bölüm 6) hemen geçin, mıknatıs üzerinde boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu 500 ul durulayın. </li></ol> 4. Lizat Hazırlama <ol><li> Başlamadan önce, çok yönlü hızlı hızlı boncuk değirmeni programı kurmak: 2 × 10 sn rpm 5.000, 15 saniye duraklama. 15 ml tüpler transfer kurutuldu embriyolar (1.5 g) polisom ekstraksiyon tamponu ihtiva eden buzda önceden soğutulmuş ve hemen homojen hale getirilir. Polizom ekstraksiyon tamponu 4 ml embriyoların 1,5 g örnek. </li><li> Iki Yayılması homojenize embriyolar 2 ml tüpler önceden soğutulmuş ve Embry öğütmekhomojenleştirici programını çalıştırarak os. Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpleri içine lizat aktarın ve 2000 g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile Postnükleer süpernatant hazırlar. </li><li> Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın süpernatant (son konsantrasyon =% 0.1)% 10 Nonidet P-40 1/100 numune hacmi ekleyin ve tüp tersini hafifçe karıştırın. </li><li> Darbe santrifüj minifuge örnek tüpün altındaki sıvıyı toplamak 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DHPC) (nihai konsantrasyon 1/9 numune hacmi = 30 mM eklemek )), tüp tersini hafifçe karıştırın ve inkübasyon sırasında birkaç kez tersini (5 dakika karışımı buz karışımı kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 20.000 g&#39;de 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de santrifüj ile sonrası mitokondriyal süpernatant hazırlayın. Bradford metodu ile protein konsantrasyonu ölçülür: lizat konsantrasyonu 60-80 mg / ml arasında olması gerekir. Tyepyeni bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatantı ake ve ön emilim aşamasında (bölüm 5) hemen geçin. </li></ol> 5. Ön emilim <ol><li> İyice hafif çalkalama ile manyetik boncuklar tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj tüpüne (boncuk / 1 mi, embriyonik lizat 30 ul) boncuk 30 ul transfer. </li><li> Süpernatant kapalı, mıknatıs üzerinde pipet boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu (500 ul) boncuklar tekrar süspansiyon. Mıknatısa boncuk toplayın embriyonik lizat ekleyin ve bir döndürücüde 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. <ol><li> Boncuk çıkarın ve immünolojik saflaştırma adımı için buz üzerinde supernatant tutun. Immün-önce, örneğin, RT-qPCR immün-sonra toplanan RNA numunesinin, küresel RNA örneği karşılaştırma süpernatan 100 ul (giriş) tutun. </li></ol></li></ol> 6. immün- <ol><li> Ve (60-80 mg / ml protein tekabül eder) 1 mi eklemeGFP antikora bağlanmış bloke boncukların 90 ul ihtiva eden bir RNaz içermeyen tüpe lizat önceden absorbe edildi. Tüp rotator nazik ucu-üzerinde uç karıştırma ile 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. Alternatif olarak, 4 ° C &#39;de inkübasyon O / N gerçekleştirin. </li><li> Kuluçkadan sonra, mıknatıs üzerinde boncuk toplamak. Daha sonra 0.5 mM, sikloheksimid 100 ug / ml, RNaz inhibitör 100 U yıkama tamponu 500 ul (Hepes, 10 mM, KCl 350 mm, MgCI2, 5 mM, Nonidet P-40,% 1 DTT bunları tekrar süspansiyon boncuk aşağı döndürmek için bir minifuge kullanın ) ve mıknatıs bunları toplamak. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Yeni önceden soğutulmuş RNaz ücretsiz tüp boncuk değiştirin ve iki kez yıkayın. Boncukların bir mıknatıs üzerinde toplayın ve boncuk TRIZOL doğrudan 1 ml ekleyerek RNA ekstraksiyon geçin ve üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol> 7. RNA Temizlik-up ve Kalite Değerlendirmesi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Micro Kiti kullanın. Tamamlandığında, elut(x) ul RNaz içermeyen su ile e RNA. 2 60 ° C&#39;de dakikada, ve mağaza sıcak hızlı bir şekilde dondurulup örnekleri -80 ° C&#39;de. Bioanalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin (üreticinin talimatlarına uyun). </li><li> Traped RNA özgüllüğünü test etmek için, üreticinin talimatlarına (üstsimge III) &#39;e göre, saflaştırılmış RNA (giriş ve IP) 3 ng ters transkripsiyon gerçekleştirmek. Gene-özgü primer setleri kullanılarak qPCR cDNA kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda Drosophila embriyolar nadir hücre popülasyonlarının araştırmaya adanmış bir modifiye Tercüme Ribozom Affinity Arıtma protokolü (dublaj &#39;TRAP-rc&#39;) da açıklamaktadır. Bilgi mikrodizi ya da RNA seq analizi, embriyo lizizi ve polisom çıkarılması için, yani, 1) gerekli olan biyolojik maddenin miktarı ve optimize edilmiş prosedür için uygun olan bir verim ile spesifik RNA izolasyonu için başarılı bir şekilde önemli adımlar sağlanır; 2) Taneler, / antikor-to-lisat uygun immüno-çökeltilmesi oranları; Yüksek özgüllük ve duyarlılık ile TUZAK-rc deneyler çalıştırmak üzere 3) yıkama tamponu kompozisyonu da dahil olmak üzere arka azaltılması izin yineleyin. Bu protokol, hali hazırda herhangi bir başka hücre türlerine de uygulanabilir hale tekrarlanabilir verileri elde edilir. Bu teknik, aktif-çeviri mRNA düzeyinde farklı gen ekspresyonunu analiz etmek ve böylece spec protein ifadesini anlamak için yolunu açmak için mümkün kılar<html> Belirli bir zaman penceresinde IFIC hücre tipi. Protein bolluk çeviri ve bozunma süreçlerinin hızına bağlıdır olacağı unutulmamalıdır. TRAP yöntemin önemli bir sınırlama, doğru bir kantitatif olarak protein içeriğini ölçmek ya da çeviri sonrası bir modifikasyonu algılamak için yetersizliğidir. Bir hücre tipi özel bir şekilde, bu sayede, mRNA gövdesi boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesiyle miktarının iyileştirilmesi ve ribozom çok güçlü bir araçtır içi izi ile birlikte TRAP yapabilir. Yeni bir kağıt 34, bu kombine, insan embriyonik böbrek 293 hücreleri içinde yapıldı. Yazarlar, streptavidin boncuk kullanılarak RpL10A bir uyarılabilir biyotinilat edilmiş form biçiminde afinite saflaştırma ile nükleaz ayak izi bitti. Bu sınırlama amaç için gerekli biyolojik malzeme miktarı olan belirli bir hücre tipi hedefleme yaparken bütün organizmanın ribozom footprinting gerçekleştirmek mümkün olduğu ilkesine bir kanıtıdır. &quot;&gt; Küresel transkriptomik analizler paralel TUZAK deneyler yapılması mümkün yeni transkripsiyonu ve RNA tercüme de aktif. Bu özel gelişimsel bağlamlarda veya belirli hücre popülasyonlarının yer alan potansiyel transkripsiyon sonrası mekanizmalar derinden bilgilendirici olacak arasındaki oranlar izlemek yapacak Örneğin tarafından- mikroRNAlar. Sonuç olarak, TRAP hücreye özel bir şekilde aktif-çeviri ribozom bağlı RNA belirlenmesi için yüksek verimli, spesifik ve hassas bir yöntem olup. Bu yöntem, organizmalar ve doku tiplerinin geniş bir yelpazede kullanılabilir. Burada tarif edilen yeni TRAP-rc protokolü nadir bir hücre popülasyonlarının (toplam hücre sayısının% 1&#39;den daha az) ve tam genom düzeyinde daha sonraki analizler için yeterli bir son malzemenin miktarı için optimize edilmiştir. Bu yöntemin olası bir sınırlama kompozisyonu için yeterli miktarda isim levhası ribozomları üretilmesi için güçlü bir sürücünün bir gerekliliktirHedeflenen hücre tipinde endojen etiketsiz olanlar ile ete. Yeni bir çalışmada 25, yazarlar% 10-30 kadar etiketsiz ribozom karşı etiketlenmiş oranını tahmin. Ölçüde bu dengeyi geliştirmek gerekir UAS-RpL10A EGFP kopya sayısını artırarak bu sorunu aşmak için. Seçenek olarak ise, anlatılan genetik arka plan bir UAS GAL4 transgeni eklenmesi GAL4 proteininin üretimini yükseltmek ve dolaylı RpL10A-EGFP ifadesini arttırır. Bu mRNA üzerinde etiketli ribozomların daha iyi bir doluluk lehine olmalıdır. Bu zaten verimli bir yaklaşım daha güçlü, daha nicel yönünü getirmek veya keşfetmek ve gen ifadesi kontrolü için gerekli olan moleküler mekanizmaları çözülmeye tamamlayıcı yöntemler adapte yapılabilir unutmayın.

Hücreler gelişme sırasında, belirli özellikleri nasıl edindikleri anlama organlarının karmaşıklığı ve patolojik durumların karşı potansiyel evrim takdir etmek için çok önemlidir. Sonuç vermediği genel gen ekspresyon profillerinin hücre özellikleri ve farklılaşmasını altında yatan gen düzenleme ağları deşifre büyük araştırma itekleme mevcuttur, Pol II bağlama durumu, düzenleyici diziler ya da histon post-translasyonel modifikasyonlar transkripsiyon faktörü doluluk. Küresel düzeyde mikrodiziler gen ifadesini değerlendirmek için ve RNA-seq yaklaşımlar kullanılmaktadır. Mikrodiziler RNA seq kodlama dahil mikroRNAlar lncRNAs veya snRNAs gibi RNA&#39;lar kodlamayan RNA&#39;ların farklı türlerde bilgilendirme daha dişli ise, mRNA bolluk algılamasını sağlar. Ancak, bu teknikler aktif-transkripsiyonu ayırt edemez, kararlı hal mRNA, mRNA&#39;nın aktif-çeviri ve mRNA yıkımı sürecinin girerek. Kararlı st ÖlçmemRNA düzeylerini yedi proteome bileşimin 1-3 kötü bir tahmin olarak bilinmektedir. Aksine olarak, mRNA&#39;nın etkin-çeviri tespit protein üretiminin daha doğru bir görüntü sağlar. Bununla birlikte, transkriptomik çalışmaları, asıl olarak doğal tipte bir durumda 07/04 ya da parçalara doku kazancı ya da belirli bir faktör fonksiyon kaybı karşılaştırarak yorumlama geni ekspresyonunun zorlaştırarak tüm organizma seviyesinde neden olmuştur. Hücre hedef araçları, afinite saflaştırma ve hassasiyet gelişmeler son gelişmeler genom çapında canlı bir organizmada, küçük hücre popülasyonlarının ya da hatta tek hücreler üzerinde analiz gerçekleştirmek için izin verir. Drosophila, transgenik hatlarının büyük koleksiyonları hücre fonksiyonu için gerekli olan moleküler mekanizmaların daha doğru kantifikasyon verimli GAL4 / UAS sistemi 8-10 aracılığıyla farklı doku ve hücre alt spesifik zamansal ve mekansal hedefleme sağlar. 11 aktif-çeviri yakalamak için bir yol olarak tarif edilmiştir polisom. Sukroz gradyanlı santrifüjleme temeline dayanan bu yöntem mikrodiziler veya derin dizilemesi ile analiz edildiğinde polisom fraksiyonu ve mRNA tespiti seçimi tüm genom çevrilmiştir sağlar. Polizom yalıtım için işlemi sırasında 12 ribozomlar tarafından korunan RNA fragmanları mukabil ribozomal ayak izleri tespit etmek nükleaz sindiriminden ile akuple edilebilir. Ribozomal footprinting RNA çeviri ve RNA dizisi düzey çözünürlük ve ribozom konumlandırma miktarının doğruluğu, çeviri hızını ölçmek mümkün kılar artar. Bununla birlikte, esas olarak ribozom ayak izi işleminin sonunda elde edilen RNA verimle güçlü bir azalmaya, translatomes arasında hücreye özel izolasyon uygulanmamıştır bugüne kadar. RNA boyutu seçimi potansiyel yalancı p oluşturabilir göz önüne alındığındaAyrıca, benzer bir şekilde, RNA koruma olabilir, farklı RNP gelen ositives, daha fazla geliştirme ribozomal ayak izi artırmak ve hücreye özel yaklaşımlara uyarlamak için ihtiyaç vardır. Bu yöntemlerden biri, Tercüme ribozom Affinity saflaştırma (TRAP) Heiman ve arkadaşları tarafından, 2008 de tarif edilmiştir olarak adlandırılan. ve farelerde nöronların bir alt gruptan alınan translatome izole etmek için uygulanan. Tarafından, bir hücre türüne özgü bir şekilde, bir ribozomal protein epitopa etiketleme, polisomlann seçici hücre ayrılma ve sıralama zahmetli aşaması olmaksızın saflaştırılabilir. Bu durumda, ribozom yüzeyinde 60S ribozomal protein L10a eGFP 13 ile etiketlendi. 2008 yılından bu yana, çeşitli çalışmalar X&#39;te 14-19 farelerin, farklı türlerde bu yöntemi kullanmış 24 thaliana 20,21, 22,23 ve zebra balığı Arabidopsis laevis. TRAP yöntemi de Drosophila modeli uyarlanmıştır ve arındırma için kullanılmıştırfy hücre türüne özgü nöronal hücrelerin 25 ve astrositlerden 26 den mRNA. Yönlü, ikili GAL4 / UAS sistemi, bir doku-spesifik bir şekilde GFP-etiketli RpL10A ifade etmek için kullanılmıştır. Yetişkin sineklerin Başkanları dizildi (pan-nöral Elav-Gal4 sürücüsü tarafından hedeflenen) nöronal hücrelerin ve izole RNA&#39;lar gelen Polizom seçimini gerçekleştirmek için disseke edildi. Yukarı regüle genlerin sayıda Drosophila embriyolar geliştirilmesinde (az 1 hücrelerinin% &#39;si), bu yaklaşım, iyi bir spesifisiteye belirten ve seyrek hücre popülasyonlarına adapte bize isteyen, sinir sisteminde eksprese edildiği bilinen karşılık gelen . Moleküler aktörler ve morfogenetik hareketler evrimsel korunmuş olarak Drosophila modeli içinde, embriyonik aşama, gelişim süreçleri çalışma için seçim modelidir. Bu modelde, şimdiye kadar yapılan, sadece doku spesifik transkriptomik yaklaşımlar, böylece hücre ya da nükleer kullanılarak gerçekleştirilmiştirrting ve sadece sinek embriyo doku / hücre spesifik translatome profilleme adanmış yöntemlere ihtiyaç yaratarak, kararlı durum transcriptome 27-31 incelemek mümkün olmuştur. Burada Drosophila embriyolar adanmış ilk TRAP protokolü sunduk. Bu yöntem ile, devreye-için mRNA embriyo başına yaklaşık 100 kas hücrelerinin çok kısıtlı bir hücre popülasyonunda başarılı bir şekilde yüksek kalitede ve özgüllük ile izole edilmiştir. İkili GAL4 / UAS sistemi herhangi bir toksisite olmaksızın kasların alt popülasyonunda GFP etiketli RpL10A ifadesini sürmek için kullanılan, hiçbir belirgin fenotipleri veya gelişimsel gecikme önce gösterildiği gibi 25. Drosophila embriyolar kas sebebiyet verecek hemisegment başına 30 kasları sahip larva. Beceriksiz kimlik geninin yakınında keşfedilen bir düzenleyici bölge kullanarak, 30 çoklu çekirdekli kasların: 6 hedeflenir. Bu deneyde, ribozomlar için uzama kullanılarak mRNA üzerinde immobilize edilirsikloheksimid inhibitörü. Sitosolik ekstraktlar daha sonra GFP antikor kaplı manyetik boncuklar ile afinite temizliği için kullanılır. Saflaştınldı RNA kalitesi Bioanalyzer kullanılarak doğrulandı. Kantitatif PCR, ters transkripsiyon (RT-qPCR) özgüllüğü ve mRNA izole duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir ve optimum protokolü çok etkili olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Drosophila Embriyonik somatik kas sistemi hemisegment başına 30 kas oluşmaktadır ve her kas özellikleri belirli bir kümesi vardır: kimlik genleri pozisyon, füzyon olayları, bağlanma siteleri ve innervasyonunu sayısının kodu. Belirli bir kas alt kümesi tercüme mRNA belirlenmesi, bu özel kas özelliklerini oluşturmak için gerekli proteinler hakkında bilgi verecektir. Kimlik geni eksprese eden bir sarkma kaslarının alt-popülasyonundan TRAP göre bir yöntem, RNA kullanılarak (Şekil 1A-B) ile saflaştırılmıştır. Bu yaklaşımın önemli bir endişe izole RNA kalitesi ve özgünlüğü olduğunu. Burada bildirilen optimize protokol Bioanalyzer analizi ile değerlendirildi yüksek kaliteli RNA sistematik iyileşme sağladı. Profil elde gösterileri RNA hiçbir bozulma (Şekil 1C). TRAP yönteminin etrafında geliştirilen diğer çalışmalarda, sorular verilerin özgüllüğü üzerine yetiştirildik. Burada bentanecikler veya tüpler RNA bağlama spesifik olmayan ve yıkama tamponu optimizasyonu ile bağlantılı arka bastırmak için bir yöntem mprove. Arka plan düzeyi ve sarkma-ifade eden hücreleri izole edilmesi etkinliğini değerlendirmek amacıyla, aynı embriyon aşaması 3 kez tekrarlanmış RT-qPCR denemeler olmuştur. 4 farklı genlerin-zenginleşme katlayın (MEF2, sarkıtmak, Prospero&#39;ya soxNeuro) RpL32 geninin (Şekil 1D) karşı giriş ve normalize göre hesaplanmıştır. Bu sonuçlar pan-kas gen MEF2 ve beceriksiz geninin 5.6 kat zenginleşme 2.3 kat zenginleştirme gösterdi. Bunun aksine, sinir sisteminde ifade iki gen tükenmiş girişine karşılaştırıldı. Çok benzer kıvrım değişim değerleri protokol sağlam olduğunu gösteren, 3 biyolojik çoğaltır gözlendi. 150 × 10 ^ 6 pozitif (toplam 100 GFP hücre / embriyoyu ihtiva elde edilmiştir 1.5x10 ^ 6 embriyoların yaklaşık 1.5 g ile başlayan Fötr-Gal4 sürücüsü ile vehücreleri) içerir. TRAP deneyi çalıştırdıktan sonra, verim aşamasında-faiz bağlı belirli RNA civarında 25-45 ng olduğunu. Bu malzeme mikroarray analizi veya bir RNA-seq kitaplığı oluşturmak için bir yükseltme protokolü kullanılarak RNA seq çalıştırmak için yeterlidir. Verimlilik RpL10A-EGFP ifade etmek için kullanılan sürücünün gücüne kuvvetle bağlı olacaktır. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Şekil 1. Kalite ve Fötr-GAL4&gt; UASRpL10A EGFP embriyolar TUZAK izole RNA özgünlüğü değerlendirilmesi. (AB) hemisegment (A) başına altı Fötr kas hücrelerinde, özellikle RpL10A EGFP ifadesini gösteren bir sahne 16 embriyo Konfokal görüntüler. Genel kas işaretleyici Beta3tubulin ile RpL10A-EGFP Co-lokalizasyon birleştirme resim (B) görülmektedir. (C) traped RNA ra kalite kontrolün Bioanalyzer üzerinde rRNA 18S ve 28S mükemmel bütünlüğünü gösteren. (D) RT-qPCR analizi aşaması-16 embriyoların 3 biyolojik çoğaltır üzerinde TUZAK izole mRNA deneylerinin yüksek spesifite gösteren. Fold değişim girişi ve RpL32 genine karşı normalize göre hesaplanır. Tüm kas soy mevcut MEF2 transkript daha kısıtlı sarkma transkript 5.6 kat zenginleştirilmiş iken girişine oranla 2.3 kat zenginleştirilmiş bulunmaktadır. Nöral Prospero ifade hücreleri ve soxN genleri 2.2 kat ve sırasıyla 5.5 kat tükenmiş. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K Görüntüleme.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Genetik

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biyokimya

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Gelişim Biyolojisi

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Biyoloji

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Orta Ölçekli Hazırlanışı

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Tüm Dağı RNA Floresan

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi

Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım