The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. 플라이 라인 세대 <ol><li> 두 개의 서로 다른 구조를 생성합니다. 첫 번째 구조에서, RpL10A의 cDNA (리보솜 단백질 서브 유닛 L10A)는 pUASP-PL-GFP - Nter 플라스미드에 GFP의 다운 스트림 복제됩니다 (32에서 수정 된 버전). 생식선 촉진제의 사용은 형질 전환 라인의 더 다가 사용을 허용한다. 참고 : pPTGAL4 플라스미드를 사용 GAL4 (TF)의 상류 능력있는 유전자의 조직 특이 적 발현을 구동 조절 서열을 복제하여 두 번째 구조를 얻습니다. </li><li> 1118 파리 승에 별도로 플라스미드를 주입하고 33 (표준 절차에 따라) P-요소의 삽입에 의해 파리의 게놈에 구조를 삽입합니다. </li><li> 순서대로 선택 형질 전환은 두 개의 서로 다른 염색체에 구조 플라이 라인을 복구 할 수 있습니다. 마지막 트랩 라인은 한 두 번 형질 전환 안정적인 라인을 얻기 위해이 두 라인 (유전 십자가)를 결합하여 생성됩니다. F0 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU; 슬러 GAL4 / TM6B. F1 : W-; CYO, UAS EGFP :: RpL10A; 능력있는 GAL4 / TM6B. 대규모이 줄을 증폭하고 원하는 스테이지 배아를 수집합니다. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 <ol><li> 케이지 당 젊은 파리의 약 40 g의 8 큰 원통형 인구 케이지를 준비 (180,000 파리 / 케이지 정도). </li><li> 파리가 난관에서 개발 배아를 취소 할 수 있도록 소위 사전 낳는다 진행합니다. 이를 위해, 응고 한천 포도 주스의 혼합물을 포함하는 두 11cm 직경 페트리 접시에 1 시간 동안 파리를 놓고 갓 만든 효모 페이스트 표면의 ⅓을 커버합니다. 포도의 3 교환 후 주스 판은 유사한 갓 만든 접시에 실제 배아를 수집합니다. 참고 : 배양 시간은 연구 개발 시간 창에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 케이지에서 플레이트를 제거하고 되어온 (예, 알을 낳는 3 시간 + 10 시간 정확한 발달 단계를 얻기 위해 필요한 시간 동안 동일 온도에서이를두고하는 ional 배양은 10 ~ 13 시간 계란 부설 (AEL)) 후 단계에서 배아를 제공합니다. 브러시를 사용하여 물 50 ㎖와 함께 접시 콘텐츠 (배아, 효모 붙여 넣기, 죽은 파리를) 재현 탁. </li><li> 죽은 파리에서 배아와 나머지 신체 부위를 분리하고 작은 직경의 체에 보유 배아를 수집 한 후 탈 이온수에 간단히 씻어 체 (700 μm의, 355 μm의 112 μm의)의 시리즈를 통해 이동합니다. 그것 자체를 방해 할 수있는 컬렉션 당 18 개 이상의 플레이트를 사용하지 마십시오. </li><li> 탈 이온수에서 4.5 % 표백제에 Dechorionate 배아 2 분 동안 30 ~ 60 초 동안 탈 이온수로 철저히 씻어. 교반하면서 실온에서 5 ~ 10 분 동안, PBS 0.01 % 트윈 20, 100 μg의 / ㎖ 사이클로 헥시 미드의 배아를 품어. </li><li> 셀룰로오스 흡수 시트에 건조 배아 및 마이크로 원심 튜브로 전송. 튜브를 달아 액체 질소에 침지하여 배아를 플래시 동결. 이 단계에서 건조 된 배아는 -80 ° C에서 수개월 동안 저장 될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. GFP 항체에 결합 자석 구슬의 준비 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반에 의해 원래의 병에 단백질 G에게 자기 구슬을 재현 탁. </li><li> 전송 (90)의 RNase없는 튜브에 구슬의 μL 및 자석 (30 ~ 60 초)에 그들을 수집합니다. 비드의 90 μL 60-80 ㎎ / ㎖의 단백질을 함유하는 1 ml의 용 해물로 면역 침전 (IP)을 수행 할 필요가있다. 비드 포화를 방지하기 위해 비를 존중한다. 단백질의 양에 따라 여러 개의 튜브를 사용합니다. </li><li> 자석에 씻어 1 × PBS 0.01 % 트윈 20 (500 μL)와 구슬과 수집 비즈 상층 액을 버린다합니다. 구슬에 PBS 0.01 % 트윈 20의 350 μL에 GFP 항체의 30 μg의를 추가하고 실온에서 30 분 동안 혼합 끝 이상 느린 끝으로 품어. </li><li> 자석 (30 ~ 60 초)에 구슬을 수집 상층 액을 버리고 polysome 추출 버퍼 500 μL에 씻어 (헤 페스 10 밀리미터, KCl을 150 밀리미터,의 MgCl 2 5 밀리미터, DTT 0.5 mm의 트리톤 1 %, 사이클로 헥시 미드 100 ㎍ / ㎖의 홍보otease 1 × 억제제의 RNase 억제제 100 U). </li><li> 자석 구슬을 수집하고 버퍼를 차단의 500 μL 추가 (BSA 0.1 μg의 / μL, 효모 tRNA는 0.1 μg의 / μL를 polysom​​e 추출 버퍼에서 0.1 μg의 / μL를 글리코겐). </li><li> 실온에서 30 분 동안 품어 신선한 차단 버퍼에 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 다음 구슬을 회상하고 immunopurification 단계 (제 6 조)에 즉시 진행, 자석 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 500 μL에 헹군다. </li></ol> 4. 해​​물 준비 <ol><li> 시작하기 전에, 다 방향 빠른 속도 비즈 분쇄기에 프로그램을 설정 : 2 × 10 초 RPM 5000에서, 15 초 일시 정지를. 15 ㎖의 튜브에 전사 건조 배아 (1.5 g)을 polysom​​e 추출 완충액을 함유하는 얼음에 예냉, 즉시 균질화. polysom​​e 추출 완충액 4 mL에 1.5 g의 배아 균질화. </li><li> 이 확산 균질화 배아는 2 mL의 튜브를 미리 냉각 및 엠브리 갈기균질 프로그램을 실행하여 OS. 얼음에 신선한 미리 냉각의 microcentrifuge 튜브에 해물을 전송하고 2,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 postnuclear 상층 액을 준비합니다. </li><li> 얼음에 신선한 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송 상층 액 (최종 농도 = 0.1 %)로 10 % Nonidet P-40의 1/100 샘플 볼륨을 추가하고 튜브를 반전 가볍게 섞는다. </li><li> 펄스 원심 minifuge의 샘플은 튜브의 바닥에서 액체를 수집하는 300 mM의 1,2- Diheptanoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DHPC) (최종 농도의 1/9 샘플 량 = 30 mm로 추가 )), 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합, 배양하는 동안 여러 번 반전 (5 분 동안 혼합 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 20,000g에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심 분리 후 미토콘드리아 상층 액을 준비합니다. 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다 : 파쇄물의 농도가 60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 사이 여야한다. 티신선한 새로운 미리 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 AKE 및 예비 흡수 단계 (5 장)에 바로 진행합니다. </li></ol> 5. 사전 흡수 <ol><li> 철저하게 부드러운 교반 자석 구슬을 재현 탁하고 실온에서 microcentrifuge 관에 (비즈 / 1 ml의 배아 해물 30 μl를) 구슬의 30 μl를 전송합니다. </li><li> 뜨는 오프, 자석에 피펫을 구슬을 수집하고 polysom​​e 추출 버퍼 (500 μL)에 구슬을 재현 탁. 자석에 구슬을 수집 배아 해물을 추가하고, 회 전자에 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. <ol><li> 구슬을 제거하고 immunopurification 단계 얼음에 뜨는을 유지. immunopurification 전에, 예를 들어 RT-qPCR에 의해 수집 된 후 immunopurification RNA 샘플과 글로벌 RNA 샘플을 비교하는 상등액 100 ㎕ (입력)을 유지한다. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol><li> 의 (60 ~ 80 ㎎ / ㎖ 단백질에 해당) 1 ML을 추가GFP 항체에 결합 차단 된 비드의 90 μl를 함유 된 RNase가없는 튜브로 파쇄물을 미리 흡수. 튜브 회전에서 부드러운 말을 통해 엔드 혼합 2 시간 동안 4 ° C에서 샘플을 품어. 또한, 4 ° C에서 배양 O / N을 수행합니다. </li><li> 배양 후, 자석 구슬을 수집합니다. 0.5 mm의 사이클로 헥시 미드 100 μg의 / ㎖,의 RNase 억제제 (100) U 세척 버퍼 500 μL (헤 페스 10 mM이, KCl을 350 ㎜,의 MgCl 2 5mM의, Nonidet P-40 1 %, DTT에서 그들을 재현 탁, 구슬을 스핀 다운 minifuge를 사용하여 ) 및 자석에 그들을 수집합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 새로운 미리 냉각 된 RNase없는 관에 구슬을 변경하고 두 번 씻는다. 자석 구슬을 수집하고 구슬 트리 졸 직접 1 ml에 첨가하여 RNA 추출을 진행하고 제조업체의 지침을 따릅니다. </li></ol> 7. RNA 정리 및 품질 평가 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라하고, RNeasy 마이크로 키트를 사용합니다. 완료시, 엘 루트(X) μL의 RNase없는 물과 전자 RNA. 2 60 ° C에서 분 및 저장을위한 따뜻한 스냅 냉동 샘플을 -80 ° C에서. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인 (제조업체의 지침에 따라). </li><li> TRAPed RNA의 특이성을 테스트하려면, 제조업체의 지침 (첨자 III)에 따라 정제 RNA (입력 및 IP)의 3 NG에 역전사를 수행합니다. 유전자 특이 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 얻은 cDNA를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 논문은 초파리 배아에서 희귀 세포 집단의 연구에 전념 수정 번역 리보솜 선호도 정화 프로토콜 (별명 &#39;TRAP-RC&#39;)를 설명합니다. 정보는 마이크로 어레이 또는 RNA-서열 분석, 배아 용해 및 polysome 추출을위한 즉, 1) 필요한 생물학적 물질의 수량 및 최적화 과정에 적합한 수율 특정 RNA의 성공적인 분리를위한 주요 단계에 제공된다; 2) 비즈 / 항체 - 투 - 해물 최적의 면역에 대한 비율; 높은 특이성과 민감도와 TRAP-RC 실험을 실행하기 위해 3) 세척 버퍼 조성물을 포함하는 배경의 감소를 허용하는 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 쉽게 임의의 다른 세포 유형에 적용하게 재현 데이터를 산출한다. 이 기술은 활발-mRNA의 번역 수준에서 차등 유전자 발현을 분석하고, 따라서 사양의 단백질 발현을 이해하는 방법을 포장하는 것을 가능하게<html> 특정 시간 윈도우에서 IFIC 셀형. 단백질 풍부 번역 및 분해 과정의 속도에 따라 달라집니다하지만 있습니다. TRAP 방법의 중요한 한계는 정확한 정량적 인 방법으로 단백질 함량을 측정 또는 번역 후 변형을 감지하는 없다는 것이다. 세포 - 유형 특이 적 방식으로, 그렇게함으로써, mRNA의 리보솜 본체 따라 밀도를 측정하여 정량을 개선하여 리보솜이 매우 강력한 도구 TRAP footprinting에 결합을 할 수있다. 최근의 논문 (34)에,이 조합은 인간 배아 신장 293 세포에서 수행 하였다. 저자는 스트렙 타비 딘 비즈를 사용하여 RpL10A의 유도 비오틴 형태의 친 화성 정제 다음에 뉴 클레아 배출량 측정을 달렸다. 이는 제한이 목적에 필요한 생체 물질의 양이 되, 특정 세포 유형에 타겟팅하는 동안 전체 유기체 리보솜 배출량 측정을 수행 할 수 있다는 원칙의 증명이다. &quot;&gt; 글로벌 transcriptomic 분석과 병행하여 트랩 실험을 수행하는 것은 가능 새로 전사와 RNA를 번역 actively-.이 특정 발달 상황 또는 특정 세포 집단에서 발생하는 잠재적 인 전사 후 메커니즘의 깊이 정보가 될 것입니다 사이의 비율을 추적 할 것 예를 들어 의하여 - 마이크로 RNA. 결론적으로, 트랩은 셀 특정 방식으로 적극적으로-번역 리보솜에 바인딩의 RNA를 식별하기위한 매우 효율적인 특정 민감한 방법이다. 이 방법은 미생물 및 조직 유형의 광범위하게 사용될 수있다. 여기에 설명 된 새로운 TRAP-RC 프로토콜은 희귀 세포 집단 (총 세포 수의 1 % 미만)과 전체 게놈 수준에서의 후속 분석을위한 충분한 최종 재료의 양에 대해 최적화되었다. 이러한 방법의 한계는 COMP 가능하기에 충분한 양으로 리보솜 태그를 생성하는 강한 운전자의 요구 인대상 세포 유형에 내생 태그가없는 사람과 죽어 야지. 최근의 연구 (25)에서, 저자 10-30 %로 태그가 지정되지 않은 리보솜 대 태그의 비율을 추정했다. 상당히이 균형을 개선해야 UAS-RpL10A-EGFP 복사 수를 늘려이 문제를 해결하려면. 대안 적으로, 설명 된 유전 배경 UAS-GAL4 트랜스 추가 GAL4 단백질의 생산을 증폭하며 간접적 RpL10A-EGFP의 발현을 증가시킨다. 이 mRNA의에 태그 리보솜의 더 나은 점유를 선호한다. 이 이미 효율적인 접근법은 훨씬 더 강력한 양적 측면을 가지고 또는 발견 및 유전자 발현 조절에 필수적인 분자 메커니즘을 해명하기 위해 보완적인 방법을 채택하여 제조 될 수 있습니다.

세포가 개발 과정에서 특정 속성을 취득하는 방법을 이해하는 것은 기관의 복잡성과 병리학 적 조건에 대한 그들의 잠재적 인 진화를 감사하기 위해 매우 중요하다. unrevealing 글로벌 유전자 발현 프로파일에 의해 세포 사양과 차별화를 underly 유전자 조절 네트워크를 해독 할 수있는 큰 연구 푸시가있다, 폴 II 결합 상태, 조절 서열 또는 히스톤의 번역 후 변형에 전사 인자의 점유. 글로벌 수준의 마이크로 어레이에서 유전자 발현을 평가하고 RNA-서열 방식이 사용된다. 마이크로 어레이는 RNA-서열이 코딩을 포함하고 마이크로 RNA, lncRNAs 또는 snRNAs 등의 RNA를 비 암호화 RNA를 다른 유형에 알리는에 더 기어드 반면, mRNA의 풍요 로움을 감지 할 수 있습니다. 그러나, 이들 기술이 활발히-전사 구별 할 수, 정상 상태의 mRNA는 mRNA의 번역을 적극적-하고는 mRNA를 분해 공정에 진입. 정상 성을 측정mRNA 수준을 먹은 것은 프로테옴 구성 1-3의 가난한 추정 것으로 알려져있다. 반대로에서의 mRNA를 적극적으로-번역 식별하는 단백질 생산의보다 정확한 사진을 제공합니다. 그러나, 연구는 주로 transcriptomic 야생형 조건 4-7 또는 해부 조직에 이득 또는 특정 인자의 기능의 상실을 비교 해석 유전자 발현 프로파일을 어렵게하여 전체 유기체 레벨 주도되어왔다. 세포 표적 도구, 친화력 정화 및 감도 향상의 최근 발전은 이제 게놈 전체의 살아있는 유기체의 작은 세포 집단 또는 단일 세포 분석을 수행 할 수 있습니다. 초파리에서 유전자 변형 라인의 큰 컬렉션은 세포의 기능에 필요한 분자 메커니즘의보다 정확한 정량을 산출 GAL4 / UAS 시스템 8-10를 통해 다른 조직과 세포 개체군의 특정 시간과 공간 타겟팅을 할 수 있습니다. (11) 적극적으로-번역 캡처하는 방법으로 기술되었다 polysome. 자당 기울기 원심 분리에 따라이 방법은 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱 분석 할 때 polysom​​e 분율의 mRNA의 결정의 선택이 게놈 전체의 번역 할 수 있습니다. Polysome 격리 번역 프로세스 (12) 동안 보호 리보솜 RNA 단편에 대응 리보솜 발자국을 식별하는 뉴 클레아 제 소화에 결합 될 수있다. 배출량 측정은 리보솜 RNA의 번역 및 RNA 서열 수준의 해상도와 정량화의 리보솜 위치의 정밀도가, 번역 속도를 측정하는 것을 가능하게 증가한다. 그러나, 주로 리보솜 배출량 측정 프로세스의 끝에서 얻은 RNA 수율 강한 감소로, translatomes 셀 고유의 분리에 적용되지 않은 날짜. RNA의 크기 선택은 잠재적 인 거짓 페이지를 생성 할 수 있음을 감안할 때또한 유사한 방식으로 RNA를 보호 할 수있는 다른 RNP들로부터 ositives는, 상기 발전은 리보좀 배출량 측정을 개선하고 셀 특정 접근법에 적응하기 위해 필요하다. 이러한 방법 중 하나는 번역 리보솜 선호도 그래피 (TRAP)이 Heiman 등에 의해 2008 년에 설명 된 호출. 및 마우스에서 뉴런의 서브셋으로부터 translatome을 분리하기 위해 적용. 으로 세포 유형 특정 방식으로 리보솜 단백질을 항원 - 태그, polysom​​es 선택적으로 세포 분리 및 분류의 힘든 단계없이 정제 할 수있다. 이 경우, 리보솜의 표면에서의 60S 리보솜 단백질 L10A은 eGFP는 13로 태그되었습니다. 2008 년부터 여러 연구는 X와 14-19 쥐에서, 다른 종에이 방법을 사용했다 24 장대 20, 21, 22, 23 제브라 피쉬와 애기 장대를 laevis의. TRAP 방법은 또한 초파리 모델 적응 및 푸리에 사용되고회계 연도 세포 유형 특정 신경 세포 (25)와 성상 세포 (26)에서의 mRNA. 다목적 진 GAL4 / UAS 시스템은 조직 - 특이 적 방식으로 태그 된 RpL10A GFP를 발현하기 위해 사용되었다. 성인 파리의 머리는 서열되었다 (팬 신경 Elav-GAL4 드라이버 대상) 신경 세포 고립의 RNA에서 polysom​​e 선택을 수행하기 위해 해부했다. 상향 조절 된 유전자의 상당수 초파리 배아 개발 (이하 1 세포의 %) 본를 접근 좋은 특이성을 갖는 것을 나타내는 희귀 세포 집단에 적응하도록 우리를 자극하는 신경 조직에서 발현되는 것으로 알려진 것에 대응 . 분자 배우와 형태 형성 운동이 진화 적으로 보존되는 것과 초파리 모델 내에서 배아 단계는 발달 과정의 연구를위한 선택의 모델입니다. 이 모델에서 지금까지 수행 만 조직 - 특이 적 접근법 transcriptomic 정도로 세포 핵을 사용하여 수행되어왔다rting 만 플라이 배아에서 조직 / 세포 특이 translatome 프로파일에 전념 방법에 대한 필요성을 생성, 정상 상태의 사체 27-31을 연구 할 수 있었다. 여기에서 우리는 초파리 배아에 전념 최초의 트랩 프로토콜을보고합니다. 이 방법으로, 결합-mRNA의 번역에 배아 당 약 100 근육 세포의 매우 한정된 세포 집단에서 성공적 고품질와 특이 단리 하였다. 이진 GAL4 / UAS 시스템은 어떤 독성없이 근육의 모집단에서 GFP - 태그 RpL10A의 발현을 구동하는 데 사용됩니다, 명백한 표현형 또는 발달 지연은 이전에 보여주지로 (25). 초파리 배아 근육을 야기 할 것이다 hemisegment 30 근육을 가지고 유충의. 아이디로 처지 유전자의 주변에서 발견 조절 영역을 이용하여, 30 멀티 유핵 근육 중 6 타겟팅. 이 분석에서, 리보솜들은 번역을 사용하여 신장에서 mRNA를 고정화사이클로 헥시 미드를 억제제. 세포질 추출물을 GFP 항체 - 코팅 된 자성 비드와의 친 화성 정제를 위해 사용된다. 정제 RNA의 품질 bioanalyzer를 사용하여 검증 하였다. 정량 역전사 PCR (RT-qPCR에)는 특이 mRNA의 분리의 감도를 결정하는 데 사용하고 최적화 된 프로토콜은 매우 효율적인 것으로 입증되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

초파리 배아 체세포 근육 시스템은 hemisegment 30 근육으로 구성되어, 각각의 근육은 속성의 특정 세트가 있습니다 : 신원 유전자, 위치, 융합 이벤트, 부착 사이트와 신경 분포의 수의 코드입니다. 특정 근육 mRNA의 서브 세트의 번역을 식별하는 것은 이들 특정 근육의 특징을 형성하기 위해 필요한 단백질에 대한 정보를 제공 할 것이다. 아이디로 처지 유전자를 발현하는 근육의 모집단에서 TRAP 기반 방법을 이용하여 RNA는 (도 1A-B)로 정제 하였다. 이 접근법의 주요 관심사는 절연 RNA의 품질 및 특이성이다. 여기에보고 최적화 프로토콜은 bioanalyzer 분석으로 평가 고품질 RNA의 체계적인 복구 할 수 있었다. 프로필을 얻을 쇼 RNA의 저하없이 (그림 1C). 트랩 방법 주위에 개발 된 다른 연구에서, 질문은 데이터의 특이성을 통해 제기되었다. 여기에 우리 전비드 또는 튜브 RNA의 비특이적 결합 및 세척 완충액의 최적화에 의해 연결된 배경을 억제하는 방법을 mProve는. 배경 수준과 처지 발현 세포를 분리의 효율을 평가하기 위해, 우리는 같은 배아 단계의 3 복제에 RT-qPCR에 시험을했다. 4 가지 유전자의-부화를 접어 (mef2, 능력있는, 프로스페로, soxNeuro)가 RpL32 유전자 (그림 1D)에 대한 입력 및 표준화에 비해 계산 하였다. 이러한 결과는 범 근육 유전자 mef2하고 능력있는 유전자의 5.6 배 농축의 2.3 배 농축을 보였다. 대조적으로, 신경계에서 발현 유전자는 두 입력 고갈 비교 하​​였다. 매우 유사한 배 변화 값은 프로토콜이 강력임을 보여주는 3 생물학적 복제에 관찰되었다. 150 × 10 ^ 6 개의 긍정적 인의 (총 100 GFP 세포 / 배아를 포함 얻었다 1.5 × ^ 6 배아 주위에, 1.5 g을 시작 슬러-GAL4 드라이버와세포). 트랩 실험을 실행 한 후, 수율은 무대의 이익에 따라 특정 RNA의 약 25 ~ 45 NG입니다. 이 물질을 마이크로 어레이 분석 또는 RNA-SEQ 라이브러리를 구축하는 증폭 프로토콜을 이용하여 RNA-SEQ을 실행하기에 충분하다. 효율 RpL10A-EGFP를 표현하기 위해 사용 드라이버의 강도에 크게 의존 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> 그림 1. 품질과 슬러-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP 배아에서 트랩 절연 RNA의 특이성 평가. (AB) hemisegment (A) 당 여섯 슬러 근육 세포에 특이 RpL10A-EGFP 발현을 나타내는 단계 16 배아 공 촛점 이미지. 일반적으로 근육 마커 Beta3tubulin와 RpL10A-EGFP의 공동 현지화 병합 사진 (B)에서 관찰된다. (C) TRAPed RNA 라의 품질 관리N bioanalyzer에 rRNA의 18S와 28S의 완벽한 무결성을 표시합니다. (D) RT-qPCR에 분석 단계-16 배아의 3 생물 복제 함정 절연 mRNA의 실험의 높은 특이성을 보여주는. 접어 변화는 입력과 RpL32 유전자에 대한 표준화에 비해 계산됩니다. 모든 근육 계통에 존재하는 Mef2 성적은 더 제한된 능력있는 성적이 5.6 배 풍부한 반면 입력에 비해 2.3 배 강화된다. 신경 프로스페로를 발현하는 세포와 soxN 유전자는 2.2 배 각각 5.5 배 고갈된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (N = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K 조회수.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

비디오: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...