The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Linha Geração <ol><li> Gerar duas construções diferentes. Na primeira construção, RpL10A ADNc (subunidade ribossomal proteína L10A) é clonado a jusante da GFP em UPAEP-PL-GFP-nter plasmídeo (versão modificada a partir de 32). A utilização de um promotor de linha germinal permite um uso mais polivalente da linha transgénica. NOTA: Obter a segunda construção através da clonagem da sequência reguladora conduzir a expressão específica de tecido do gene de GAL4 a montante desleixo (TF) usando pPTGAL4 plasmídeo. </li><li> Injecte separadamente em plasmídeos moscas W 1118 e inserir as construções no genoma da mosca por P-elemento de inserção (de acordo com o procedimento padrão) 33. </li><li> Seleccione transformantes, a fim de recuperar linhas de voar com construções em dois cromossomas diferentes. A linha de TRAP final é criado pela combinação destas duas linhas (cruzes genéticos), a fim de obter uma linha estável double-transgênico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Desleixo Gal4 / TM6B. Massively ampliar esta linha e coletar os embriões desejar-encenadas. </li></ol> Coleção 2. Embryo <ol><li> Prepare 8 grandes gaiolas população cilíndrico contendo cerca de 40 g de jovens moscas por gaiola (cerca de 180 mil moscas / gaiola). </li><li> Prossiga com os chamados pré-Lays que permitem moscas para limpar embriões em desenvolvimento a partir de suas tubas uterinas. Para isso, coloque as moscas para 1 hr em dois pratos de petri de 11 cm de diâmetro, contendo uma mistura de suco de uva e agar solidificado e cobrir ⅓ da superfície com recém-feitos pasta de levedura. Após 3 trocas de placas de uva suco coletar os embriões reais em placas semelhantes feitas na hora. NOTA: O tempo de incubação irão variar de acordo com a janela de tempo de desenvolvimento estudado. </li><li> Remover placas de gaiolas e deixá-los na mesma temperatura, durante o tempo necessário para obter estágio de desenvolvimento correto (por exemplo, 3 horas de postura de ovos + 10 hr de additional incubação dá embriões de fase 10-13 horas após colocação de ovo (AEL)). Ressuspender o conteúdo placa (embriões, levedura pasta, moscas mortas) com 50 ml de água usando um pincel. </li><li> Passar por uma série de peneiras (700 mm, 355 mm, 112 mm) para separar embriões de moscas mortas e restantes partes do corpo e coletar embriões retidos na peneira de menor diâmetro, em seguida, lavar brevemente em água deionizada. Não use mais de 18 placas por coleção, pois pode entupir as peneiras. </li><li> Dechorionate embriões em 4,5% de alvejante em água deionizada para 2 minutos e enxaguar abundantemente com água deionizada por 30-60 seg. Incubar os embriões em PBS 0,01% de Tween 20, 100 ug / ml de ciclo-heximida, durante 5-10 min à temperatura ambiente sob agitação. </li><li> Embriões secos em folhas absorventes de celulose e transferi-los para novos microtubos. Pesar os tubos de flash e congelar os embriões por imersão em azoto líquido. Nesta fase, os embriões secos podem ser armazenados durante vários meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparação de esferas magnéticas acopladas a GFP Anticorpo <ol><li> Completamente ressuspender a Proteína G esferas magnéticas no frasco de origem por agitação suave. </li><li> Transferência de 90 ul de pérolas para um tubo livre de RNase e coletá-los em um ímã (30-60 seg). 90 ul de pérolas é necessária a realização de imunoprecipitação (IP) com 1 ml de lisado contendo 60-80 mg / mL de proteínas. Respeitar rácios para evitar a saturação do grânulo. Use vários tubos de acordo com a quantidade de proteína. </li><li> Grânulos de lavagem com 1 × PBS 0,01% de Tween 20 (500 mL) e coletar pérolas no ímã para descartar sobrenadante. Adicionar 30 g de anticorpo GFP em 350 ul de PBS, 0,01% de Tween 20 para os grânulos e incubar com extremidade lento sobre a extremidade de mistura durante 30 min à TA. </li><li> Coletar pérolas no ímã (30-60 seg), elimine o sobrenadante e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton a 1%, Cicloheximida 100 mg / ml , Protease inibidor 1 ×, inibidor de RNase L 100). </li><li> Recolhe grânulos sobre o íman e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,1 mg / mL, ARNt de levedura a 0,1 mg / mL, glicogénio 0,1 mg / mL em tampão de extracção polissoma). </li><li> Incubar durante 30 min à TA e repetir este passo uma vez com tampão de bloqueio fresco. </li><li> Coletar pérolas no ímã e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome, em seguida, lembrar pérolas e proceder imediatamente à etapa imunopurificação (secção 6). </li></ol> 4. Preparação Lysate <ol><li> Antes de começar, configure o programa no multi-direcional contas de velocidade rápida moedor: 2 × 10 segundos a 5.000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferência de embriões secos (1,5 g) para tubos de 15 ml pré-arrefecido em gelo que contém tampão de extracção em polissoma, e homogeneizar imediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriões em 4 ml de tampão de extracção polissoma. </li><li> Espalhe homogeneizada embriões em duas pré-arrefecido 2 tubos mL e moer o EmbryOS executando o programa de homogeneizador. Transferir o lisado para tubos de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo e preparar um sobrenadante pós-nuclear por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo, adicionar 1/100 volume de amostra de 10% de Nonidet P-40 ao sobrenadante (concentração final = 0,1%), e misturá-lo suavemente por inversão do tubo. </li><li> Pulso-centrifugar a amostra num minifuge para recolher o líquido na parte inferior do tubo, adicionar 1/9 de volume de amostra de 300 mM de 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentração final = 30 mM ), misturá-lo suavemente por inversão do tubo, e incuba-se a mistura em gelo durante 5 min (mistura invertendo várias vezes durante a incubação). </li><li> Prepara-se o sobrenadante pós-mitocondrial por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir a concentração de proteína pelo método de Bradford: concentração no ligado deve estar entre 60-80 mg / ml. Take o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga prechilled fresco e avança imediatamente para a etapa de pré-absorção (seção 5). </li></ol> 5. Pré-absorção <ol><li> Completamente ressuspender as esferas magnéticas, por agitação suave e transferir 30 ul de pérolas para um tubo de microcentrífuga à TA (30 ul de contas / 1 mL de ligado embrionária). </li><li> Coletar pérolas no ímã, pipeta fora o sobrenadante e ressuspender as contas em tampão de extração polysome (500 mL). Recolhe grânulos sobre o íman, adicionar lisado embrionário, e incubar durante 1 hora a 4 ° C num rotor. <ol><li> Remover grânulos e manter sobrenadante em gelo durante o passo imunopurificação. Antes imunopurificação, manter 100 l de sobrenadante (entrada) para comparar amostras RNA global com a amostra de RNA coletadas após imunopurificação, RT-qPCR por, por exemplo. </li></ol></li></ol> 6. imunopurificação <ol><li> Adicionar 1 ml (correspondendo a 60-80 mg / ml de proteína) depré-absorvido ligado a um tubo contendo RNase livre de 90 ul de contas bloqueadas acopladas ao anticorpo GFP. Incubar as amostras a 4 ° C durante 2 h com agitação suave a-extremidade sobre extremidade numa rotador tubo. Alternativamente, realizar a incubação O / N a 4 ° C. </li><li> Após a incubação, coletar pérolas no ímã. Usar um minifuge a girar para baixo os grânulos, em seguida ressuspender-los em 500 ul de tampão de lavagem (HEPES 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 a 1%, DTT 0,5 mM, ciclo-heximida 100 ug / mL, RNase inibidor de 100 L ) e recolhê-las sobre o ímã. Repita este passo mais duas vezes. </li><li> Mudar as esferas para um novo tubo livre de RNase previamente arrefecido e lavar duas vezes. Colete contas em um ímã e proceder à extração de RNA, adicionando 1 ml TRIZOL diretamente para as contas e siga as instruções do fabricante. </li></ol> 7. RNA Clean-up e Avaliação da Qualidade <ol><li> Use um Kit RNeasy Micro, conforme as instruções do fabricante. Em conclusão, elute RNA com (x) ul de água sem RNase. Quente durante 2 min a 60 ° C, e armazenar amostras snap-congelados a -80 ° C. Verifique a qualidade da RNA usando Bioanalyzer (siga as instruções do fabricante). </li><li> Para testar a especificidade do Traped ARN, realizar a transcrição reversa em 3 ng de RNA purificado (de entrada e de IP) de acordo com as instruções do fabricante (sobrescritos III). Utilizar o cDNA obtido por qPCR utilizando conjuntos de iniciadores específicos para o gene. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um Traduzindo Ribossomo Affinity protocolo de purificação modificado (apelidado de &quot;TRAP-rc&quot;) dedicada ao estudo de populações de células raras em embriões de Drosophila. A informação é fornecida sobre os passos principais para o isolamento bem sucedido de ARN específico com um rendimento adequados para análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ, ou seja, 1) quantidade de material biológico necessário e procedimento otimizado para a lise embrião e extracção polissoma; 2) contas / anticorpo-a-imunoprecipitação de lisados ​​de rácios para óptima; 3) as etapas permitindo a redução de fundo incluindo a composição tampão de lavagem, de modo a executar experimentos TRAP-rc com alta especificidade e sensibilidade. Este protocolo produz dados reprodutíveis tornando-se facilmente aplicado a quaisquer outros tipos de células. Esta técnica torna possível analisar a expressão diferencial de genes em nível de mRNA ativamente traduzindo-e, assim, preparar o caminho para a compreensão da expressão da proteína em uma especificação<html> ific tipo de célula a uma janela de tempo específico. De notar contudo que a abundância da proteína vai depender da taxa de conversão e os processos de degradação. Uma das principais limitações do método TRAP é a sua incapacidade de medir o teor de proteína de uma forma exacta ou quantitativa para detectar a modificação pós-translacional. Melhorar a quantificação medindo a densidade ribossomo ao longo do corpo mRNA e, ao fazê-lo, de uma maneira específica do tipo celular pode fazer-TRAP combinado com ribossomo footprinting uma ferramenta muito poderosa. Em um recente artigo 34, esta combinação foi realizada em células embrionárias de rim 293 humanos. Os autores correu footprinting nuclease, seguido por purificação por afinidade de uma forma biotinilada indutível de RpL10A usando esferas de estreptavidina. Esta é uma prova do princípio de que é possível realizar a pegada de ribossoma em um organismo inteiro, enquanto alvo um tipo específico de célula, sendo a limitação da quantidade de material biológico necessário para a finalidade. &quot;&gt; Performing experimentos TRAP em paralelo com as análises transcriptomic globais tornará possível para rastrear proporções entre recém-transcritas e actively- traduzindo RNA. Este será profundamente informativo dos potenciais mecanismos de pós-transcrição que ocorrem em contextos de desenvolvimento específicos ou populações de células específicas microRNAs -por por exemplo. Em conclusão, a TRAP é um método altamente eficiente, sensível e específico para a identificação de RNAs ligados para activamente traduzindo-ribossomas de uma maneira especifica para a célula. Este método pode ser usado numa ampla variedade de organismos e tipos de tecidos. O novo protocolo TRAP-rc aqui descrito foi otimizado para populações de células raras (menos de 1% do número total de células) e para uma quantidade de material final suficiente para análises subsequentes a nível de todo o genoma. Uma possível limitação deste método é a exigência de um driver forte para produzir ribossomos marcados em quantidade suficiente para compete com os não marcados endógenas do tipo de célula alvo. Num estudo recente 25, os autores estimado para 10-30% do rácio de ribossomas contra etiquetado não marcados. Para superar este problema crescente UAS-RpL10A-EGFP número de cópias deve melhorar consideravelmente este equilíbrio. Alternativamente, a adição ao fundo genético descrito um transgene UAS-GAL4 vai amplificar a produção da proteína GAL4 e indirectamente aumentar a expressão de RpL10A-EGFP. Isso deve favorecer uma melhor ocupação dos ribossomos marcados em mRNA. Note-se que esta abordagem já eficiente pode ser feita ainda mais poderoso, adaptando métodos complementares para trazer um aspecto mais quantitativa ou para descobrir e desvendar os mecanismos moleculares que são essenciais para o controle da expressão gênica.

A compreensão de como as células adquirem propriedades específicas durante o desenvolvimento é crucial, a fim de apreciar a complexidade de órgãos e do seu potencial evolutivo em direção a condições patológicas. Há um grande esforço de investigação para decifrar as redes reguladoras de genes que underly especificação e diferenciação celular por perfis unrevealing globais de expressão do gene, o estado de ligação de pol II, factor de transcrição-ocupação em sequências reguladoras ou modificações pós-traducionais de histonas. Para avaliar a expressão gênica em um microarrays nível mundial e abordagens RNA-seq são usados. Microarrays permitem detectar abundância mRNA, enquanto RNA-seq é melhor do que vise informar sobre os diferentes tipos de RNAs, incluindo codificação e noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs ou snRNAs. No entanto, estas técnicas não podem diferenciar-activamente transcritas, ARNm em estado estacionário, activa-traduzir ARNm, e o ARNm de entrar no processo de degradação. Medindo steady-stComeram níveis de ARNm é conhecida por ser uma estimativa baixa de composição proteoma 1-3. Ao contrário, identificando ativamente traduzir-mRNA dá uma imagem mais precisa da produção de proteína. No entanto, estudos transcriptomic foram principalmente dirigida, no plano todo-organismo, comparando o ganho ou a perda de função de um factor específico para o tipo selvagem condição 4-7 ou no tecido dissecado, fazendo com que os perfis de expressão de gene de difícil interpretação. Recentes avanços em ferramentas de segmentação de células, purificação por afinidade e melhorias de sensibilidade permitem agora a realizar a nível genoma análises sobre as populações de células pequenas ou até mesmo células individuais em um organismo vivo. Em Drosophila, grandes colecções de linhas transgénicas permitir direccionamento temporal e espacial específica de diferentes tecidos e subpopulações de células através do sistema de GAL4 / UAS 8-10 originando quantificação mais precisa dos mecanismos moleculares necessários para a função celular. 11. Este método baseado na centrifugação em gradiente de sacarose permite a selecção da fracção de polissoma e determinação de ARNm traduzido à escala genoma quando analisados ​​com microarrays ou sequenciação de profundidade. Polissoma isolamento pode ser acoplado com a digestão da nuclease para identificar pegadas ribossomais correspondentes a fragmentos de ARN protegidas pelos ribossomas durante o processo de tradução 12. Footprinting Ribosomal aumenta a precisão da quantificação do RNA e tradução resolução RNA de nível sequência e posicionamento ribossomo, torna possível medir a taxa de tradução. No entanto, até à data não tem sido aplicado para o isolamento específico de células de translatomes, principalmente devido à forte redução no rendimento de ARN obtido no final do processo de footprinting ribossoma. Dado que a seleção de tamanho de RNA pode gerar potencial falso-positives de diferentes RNP que também poderia ser protectores de ARN de um modo semelhante, são necessários novos desenvolvimentos para melhorar ribossomal footprinting e adaptá-lo às abordagens específicos de células. Um desses métodos, o chamado Traduzindo Ribossoma A purificação por afinidade (TRAP) foi descrita em 2008 por Heiman et ai. e aplicado para isolar o translatome partir de um subconjunto de neurónios em ratos. Por epitopo de marcação de uma proteína ribossómica de uma forma específica do tipo de células-, polissomas pode ser purificado selectivamente sem o passo de dissociação de células trabalhoso e triagem. Neste caso, os ribossomal 60S da proteína L10A na superfície do ribossoma foi marcado com eGFP 13. Desde 2008, vários estudos têm utilizado este método em diferentes espécies, de ratos 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e peixe-zebra Arabidopsis thaliana 24. O método TRAP também foi adaptada para o modelo de Drosophila e utilizado para purimRNAs de células neuronais e astrócitos 26 25 FY-específicos de células-tipo. O sistema de GAL4 / UAS binário versátil foi utilizado para expressar RpL10A GFP marcadas de um modo específico do tecido. Chefes de moscas adultas foram dissecados para realizar a seleção polysome a partir de células neuronais (alvo de pan-neural motorista elav-Gal4) e RNAs isolados foram sequenciados. O grande número de genes regulados positivamente correspondeu aos conhecidos a ser expresso no sistema nervoso, o que indica que a abordagem tem boa especificidade e levando-nos para adaptá-lo às populações de células raros (menos de 1% das células) presente no desenvolvimento de embriões de Drosophila . Dentro do modelo de Drosophila, a fase embrionária é um modelo de escolha para o estudo de processos de desenvolvimento, como os actores moleculares e movimentos morfogenéticas são evolutivamente conservados. As abordagens transcriptomic apenas específicos de tecidos conduzidos até agora neste modelo foram realizados utilizando células ou então nuclearrting e só foram capazes de estudar transcriptoma de estado estacionário 27-31, criando uma necessidade de métodos dedicados ao tecido / específico de células translatome profiling no embrião da mosca. Aqui nós relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado a embriões de Drosophila. Com este método, envolvidos-em-tradução de mRNA numa população de células muito restrita de cerca de 100 células musculares por embrião foi isolado com sucesso com alta qualidade e especificidade. O sistema / UAS GAL4 binário é usado para conduzir a expressão de RpL10A marcadas com GFP na subpopulação de músculos sem qualquer toxicidade, há fenótipos aparentes ou atraso de desenvolvimento, como mostrado anteriormente 25. Embriões de Drosophila possuem 30 músculos por hemisegmento que darão origem à musculatura da larva. Ao utilizar uma região reguladora descoberta na proximidade do gene identidade desleixo, 6 dos 30 músculos multi-nucleadas são segmentados. Neste ensaio, os ribossomas são imobilizados sobre o ARNm utilizando o alongamento traduçãoinibidor cicloheximida. Os extractos citossólicos são então utilizados para a purificação por afinidade com esferas magnéticas revestidas com anticorpo GFP. Qualidade do RNA purificado foi validado utilizando Bioanalyzer. Quantitative PCR de transcrição inversa (RT-qPCR) foi usada para determinar a especificidade e sensibilidade de isolamento de ARNm e demonstraram que o protocolo optimizado é altamente eficiente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

O sistema muscular somática embrionária Drosophila é composta por 30 músculos por hemisegmento, e cada músculo tem um conjunto específico de propriedades: Código de genes de identidade, posição, número de eventos de fusão, locais de fixação e inervação. Identificando ARNm traduzido em um subconjunto específico do músculo dará informação sobre as proteínas necessárias para formar estas características específicos do músculo. Utilizando o método à base de TRAP, o ARN a partir de uma subpopulação de músculos que expressam o gene de desleixo identidade foi purificado (Figura 1A-B). Uma preocupação importante desta abordagem é a qualidade e especificidade do RNA isolado. O protocolo otimizado relatado aqui habilitado recuperação sistemática de RNA de alta qualidade avaliada com análise Bioanalyzer. Os perfil mostra obtidos nenhuma degradação do RNA (Figura 1C). Em outros estudos desenvolvidos em torno do método TRAP, questões foram levantadas sobre a especificidade dos dados. Aqui nós improve método para suprimir o fundo ligada para a ligação não específica de ARN para os grânulos ou os tubos e pela optimização do tampão de lavagem. De modo a avaliar o nível de fundo e a eficiência de isolamento de células que expressam desleixo, que conduziu os ensaios de RT-qPCR em 3 repetições do mesmo estágio embrionário. Dobre-enriquecimentos de 4 genes diferentes (MEF2, desleixo, prospero, soxNeuro) foram calculados em relação a entrada e normalizado contra o gene RpL32 (Figura 1D). Estes resultados demonstraram enriquecimento de 2,3 vezes de MEF2 gene pan-musculares e enriquecimento de 5,6 vezes o gene de desleixo. Em contraste, os dois genes expressos no sistema neural foram reduzidos em comparação com a entrada. Valores muito similares foram observadas mudanças de dobragem em 3 réplicas biológicas, o que demonstra que o protocolo é robusta. Com desleixo-Gal4 condutor e começando com 1,5 g, cerca de 1,5x10 ^ 6 embriões foram obtidos que contêm 100 células de GFP / embrião (total de 150 x 10 ^ 6 positivacélulas). Depois de executar o experimento TRAP, o rendimento é de cerca de 25-45 ng de RNA específico dependendo do estágio de interesse. Este material é suficiente para executar a análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ usando um protocolo de amplificação para construir uma biblioteca de ARN-SEQ. Eficiência dependerá fortemente a força do piloto usada para expressar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Qualidade e avaliação especificidade do RNA isolado-TRAP de Slouch-GAL4&gt; embriões UASRpL10A-EGFP. (AB) imagens confocais de uma fase de embrião-16 que mostra a expressão RpL10A-EGFP especificamente nas células musculares seis Slouch por hemisegmento (A). Co-localização de RpL10A-EGFP com o general marcador músculo Beta3tubulin é observado na foto merge (B). (C) Controle de qualidade de Traped RNA ran no Bioanalyzer mostrando perfeita integridade de rRNA 18S e 28S. Análise (D) RT-qPCR mostrando alta especificidade das experiências de mRNA isolado armadilha em 3 repetições biológicas do estágio-16 embriões. Dobre mudança é calculada em comparação com entrada e normalizado contra o gene RpL32. Transcrições Mef2 presentes em todas as linhagens musculares são 2,3 vezes enriquecido em comparação com entrada Considerando transcrições desleixo mais restritos são-5.6-fold enriquecido. Células neurais que expressam prospero e genes soxN estão esgotados 2,2 vezes e 5,5 vezes, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K visualizações.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Vídeo: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissecação de discos imaginais de 3 larvas Drosophila Instar

Biologia

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...