The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Linha Geração <ol><li> Gerar duas construções diferentes. Na primeira construção, RpL10A ADNc (subunidade ribossomal proteína L10A) é clonado a jusante da GFP em UPAEP-PL-GFP-nter plasmídeo (versão modificada a partir de 32). A utilização de um promotor de linha germinal permite um uso mais polivalente da linha transgénica. NOTA: Obter a segunda construção através da clonagem da sequência reguladora conduzir a expressão específica de tecido do gene de GAL4 a montante desleixo (TF) usando pPTGAL4 plasmídeo. </li><li> Injecte separadamente em plasmídeos moscas W 1118 e inserir as construções no genoma da mosca por P-elemento de inserção (de acordo com o procedimento padrão) 33. </li><li> Seleccione transformantes, a fim de recuperar linhas de voar com construções em dois cromossomas diferentes. A linha de TRAP final é criado pela combinação destas duas linhas (cruzes genéticos), a fim de obter uma linha estável double-transgênico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Desleixo Gal4 / TM6B. Massively ampliar esta linha e coletar os embriões desejar-encenadas. </li></ol> Coleção 2. Embryo <ol><li> Prepare 8 grandes gaiolas população cilíndrico contendo cerca de 40 g de jovens moscas por gaiola (cerca de 180 mil moscas / gaiola). </li><li> Prossiga com os chamados pré-Lays que permitem moscas para limpar embriões em desenvolvimento a partir de suas tubas uterinas. Para isso, coloque as moscas para 1 hr em dois pratos de petri de 11 cm de diâmetro, contendo uma mistura de suco de uva e agar solidificado e cobrir ⅓ da superfície com recém-feitos pasta de levedura. Após 3 trocas de placas de uva suco coletar os embriões reais em placas semelhantes feitas na hora. NOTA: O tempo de incubação irão variar de acordo com a janela de tempo de desenvolvimento estudado. </li><li> Remover placas de gaiolas e deixá-los na mesma temperatura, durante o tempo necessário para obter estágio de desenvolvimento correto (por exemplo, 3 horas de postura de ovos + 10 hr de additional incubação dá embriões de fase 10-13 horas após colocação de ovo (AEL)). Ressuspender o conteúdo placa (embriões, levedura pasta, moscas mortas) com 50 ml de água usando um pincel. </li><li> Passar por uma série de peneiras (700 mm, 355 mm, 112 mm) para separar embriões de moscas mortas e restantes partes do corpo e coletar embriões retidos na peneira de menor diâmetro, em seguida, lavar brevemente em água deionizada. Não use mais de 18 placas por coleção, pois pode entupir as peneiras. </li><li> Dechorionate embriões em 4,5% de alvejante em água deionizada para 2 minutos e enxaguar abundantemente com água deionizada por 30-60 seg. Incubar os embriões em PBS 0,01% de Tween 20, 100 ug / ml de ciclo-heximida, durante 5-10 min à temperatura ambiente sob agitação. </li><li> Embriões secos em folhas absorventes de celulose e transferi-los para novos microtubos. Pesar os tubos de flash e congelar os embriões por imersão em azoto líquido. Nesta fase, os embriões secos podem ser armazenados durante vários meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparação de esferas magnéticas acopladas a GFP Anticorpo <ol><li> Completamente ressuspender a Proteína G esferas magnéticas no frasco de origem por agitação suave. </li><li> Transferência de 90 ul de pérolas para um tubo livre de RNase e coletá-los em um ímã (30-60 seg). 90 ul de pérolas é necessária a realização de imunoprecipitação (IP) com 1 ml de lisado contendo 60-80 mg / mL de proteínas. Respeitar rácios para evitar a saturação do grânulo. Use vários tubos de acordo com a quantidade de proteína. </li><li> Grânulos de lavagem com 1 × PBS 0,01% de Tween 20 (500 mL) e coletar pérolas no ímã para descartar sobrenadante. Adicionar 30 g de anticorpo GFP em 350 ul de PBS, 0,01% de Tween 20 para os grânulos e incubar com extremidade lento sobre a extremidade de mistura durante 30 min à TA. </li><li> Coletar pérolas no ímã (30-60 seg), elimine o sobrenadante e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton a 1%, Cicloheximida 100 mg / ml , Protease inibidor 1 ×, inibidor de RNase L 100). </li><li> Recolhe grânulos sobre o íman e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,1 mg / mL, ARNt de levedura a 0,1 mg / mL, glicogénio 0,1 mg / mL em tampão de extracção polissoma). </li><li> Incubar durante 30 min à TA e repetir este passo uma vez com tampão de bloqueio fresco. </li><li> Coletar pérolas no ímã e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome, em seguida, lembrar pérolas e proceder imediatamente à etapa imunopurificação (secção 6). </li></ol> 4. Preparação Lysate <ol><li> Antes de começar, configure o programa no multi-direcional contas de velocidade rápida moedor: 2 × 10 segundos a 5.000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferência de embriões secos (1,5 g) para tubos de 15 ml pré-arrefecido em gelo que contém tampão de extracção em polissoma, e homogeneizar imediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriões em 4 ml de tampão de extracção polissoma. </li><li> Espalhe homogeneizada embriões em duas pré-arrefecido 2 tubos mL e moer o EmbryOS executando o programa de homogeneizador. Transferir o lisado para tubos de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo e preparar um sobrenadante pós-nuclear por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo, adicionar 1/100 volume de amostra de 10% de Nonidet P-40 ao sobrenadante (concentração final = 0,1%), e misturá-lo suavemente por inversão do tubo. </li><li> Pulso-centrifugar a amostra num minifuge para recolher o líquido na parte inferior do tubo, adicionar 1/9 de volume de amostra de 300 mM de 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentração final = 30 mM ), misturá-lo suavemente por inversão do tubo, e incuba-se a mistura em gelo durante 5 min (mistura invertendo várias vezes durante a incubação). </li><li> Prepara-se o sobrenadante pós-mitocondrial por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir a concentração de proteína pelo método de Bradford: concentração no ligado deve estar entre 60-80 mg / ml. Take o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga prechilled fresco e avança imediatamente para a etapa de pré-absorção (seção 5). </li></ol> 5. Pré-absorção <ol><li> Completamente ressuspender as esferas magnéticas, por agitação suave e transferir 30 ul de pérolas para um tubo de microcentrífuga à TA (30 ul de contas / 1 mL de ligado embrionária). </li><li> Coletar pérolas no ímã, pipeta fora o sobrenadante e ressuspender as contas em tampão de extração polysome (500 mL). Recolhe grânulos sobre o íman, adicionar lisado embrionário, e incubar durante 1 hora a 4 ° C num rotor. <ol><li> Remover grânulos e manter sobrenadante em gelo durante o passo imunopurificação. Antes imunopurificação, manter 100 l de sobrenadante (entrada) para comparar amostras RNA global com a amostra de RNA coletadas após imunopurificação, RT-qPCR por, por exemplo. </li></ol></li></ol> 6. imunopurificação <ol><li> Adicionar 1 ml (correspondendo a 60-80 mg / ml de proteína) depré-absorvido ligado a um tubo contendo RNase livre de 90 ul de contas bloqueadas acopladas ao anticorpo GFP. Incubar as amostras a 4 ° C durante 2 h com agitação suave a-extremidade sobre extremidade numa rotador tubo. Alternativamente, realizar a incubação O / N a 4 ° C. </li><li> Após a incubação, coletar pérolas no ímã. Usar um minifuge a girar para baixo os grânulos, em seguida ressuspender-los em 500 ul de tampão de lavagem (HEPES 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 a 1%, DTT 0,5 mM, ciclo-heximida 100 ug / mL, RNase inibidor de 100 L ) e recolhê-las sobre o ímã. Repita este passo mais duas vezes. </li><li> Mudar as esferas para um novo tubo livre de RNase previamente arrefecido e lavar duas vezes. Colete contas em um ímã e proceder à extração de RNA, adicionando 1 ml TRIZOL diretamente para as contas e siga as instruções do fabricante. </li></ol> 7. RNA Clean-up e Avaliação da Qualidade <ol><li> Use um Kit RNeasy Micro, conforme as instruções do fabricante. Em conclusão, elute RNA com (x) ul de água sem RNase. Quente durante 2 min a 60 ° C, e armazenar amostras snap-congelados a -80 ° C. Verifique a qualidade da RNA usando Bioanalyzer (siga as instruções do fabricante). </li><li> Para testar a especificidade do Traped ARN, realizar a transcrição reversa em 3 ng de RNA purificado (de entrada e de IP) de acordo com as instruções do fabricante (sobrescritos III). Utilizar o cDNA obtido por qPCR utilizando conjuntos de iniciadores específicos para o gene. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um Traduzindo Ribossomo Affinity protocolo de purificação modificado (apelidado de &quot;TRAP-rc&quot;) dedicada ao estudo de populações de células raras em embriões de Drosophila. A informação é fornecida sobre os passos principais para o isolamento bem sucedido de ARN específico com um rendimento adequados para análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ, ou seja, 1) quantidade de material biológico necessário e procedimento otimizado para a lise embrião e extracção polissoma; 2) contas / anticorpo-a-imunoprecipitação de lisados ​​de rácios para óptima; 3) as etapas permitindo a redução de fundo incluindo a composição tampão de lavagem, de modo a executar experimentos TRAP-rc com alta especificidade e sensibilidade. Este protocolo produz dados reprodutíveis tornando-se facilmente aplicado a quaisquer outros tipos de células. Esta técnica torna possível analisar a expressão diferencial de genes em nível de mRNA ativamente traduzindo-e, assim, preparar o caminho para a compreensão da expressão da proteína em uma especificação<html> ific tipo de célula a uma janela de tempo específico. De notar contudo que a abundância da proteína vai depender da taxa de conversão e os processos de degradação. Uma das principais limitações do método TRAP é a sua incapacidade de medir o teor de proteína de uma forma exacta ou quantitativa para detectar a modificação pós-translacional. Melhorar a quantificação medindo a densidade ribossomo ao longo do corpo mRNA e, ao fazê-lo, de uma maneira específica do tipo celular pode fazer-TRAP combinado com ribossomo footprinting uma ferramenta muito poderosa. Em um recente artigo 34, esta combinação foi realizada em células embrionárias de rim 293 humanos. Os autores correu footprinting nuclease, seguido por purificação por afinidade de uma forma biotinilada indutível de RpL10A usando esferas de estreptavidina. Esta é uma prova do princípio de que é possível realizar a pegada de ribossoma em um organismo inteiro, enquanto alvo um tipo específico de célula, sendo a limitação da quantidade de material biológico necessário para a finalidade. &quot;&gt; Performing experimentos TRAP em paralelo com as análises transcriptomic globais tornará possível para rastrear proporções entre recém-transcritas e actively- traduzindo RNA. Este será profundamente informativo dos potenciais mecanismos de pós-transcrição que ocorrem em contextos de desenvolvimento específicos ou populações de células específicas microRNAs -por por exemplo. Em conclusão, a TRAP é um método altamente eficiente, sensível e específico para a identificação de RNAs ligados para activamente traduzindo-ribossomas de uma maneira especifica para a célula. Este método pode ser usado numa ampla variedade de organismos e tipos de tecidos. O novo protocolo TRAP-rc aqui descrito foi otimizado para populações de células raras (menos de 1% do número total de células) e para uma quantidade de material final suficiente para análises subsequentes a nível de todo o genoma. Uma possível limitação deste método é a exigência de um driver forte para produzir ribossomos marcados em quantidade suficiente para compete com os não marcados endógenas do tipo de célula alvo. Num estudo recente 25, os autores estimado para 10-30% do rácio de ribossomas contra etiquetado não marcados. Para superar este problema crescente UAS-RpL10A-EGFP número de cópias deve melhorar consideravelmente este equilíbrio. Alternativamente, a adição ao fundo genético descrito um transgene UAS-GAL4 vai amplificar a produção da proteína GAL4 e indirectamente aumentar a expressão de RpL10A-EGFP. Isso deve favorecer uma melhor ocupação dos ribossomos marcados em mRNA. Note-se que esta abordagem já eficiente pode ser feita ainda mais poderoso, adaptando métodos complementares para trazer um aspecto mais quantitativa ou para descobrir e desvendar os mecanismos moleculares que são essenciais para o controle da expressão gênica.

A compreensão de como as células adquirem propriedades específicas durante o desenvolvimento é crucial, a fim de apreciar a complexidade de órgãos e do seu potencial evolutivo em direção a condições patológicas. Há um grande esforço de investigação para decifrar as redes reguladoras de genes que underly especificação e diferenciação celular por perfis unrevealing globais de expressão do gene, o estado de ligação de pol II, factor de transcrição-ocupação em sequências reguladoras ou modificações pós-traducionais de histonas. Para avaliar a expressão gênica em um microarrays nível mundial e abordagens RNA-seq são usados. Microarrays permitem detectar abundância mRNA, enquanto RNA-seq é melhor do que vise informar sobre os diferentes tipos de RNAs, incluindo codificação e noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs ou snRNAs. No entanto, estas técnicas não podem diferenciar-activamente transcritas, ARNm em estado estacionário, activa-traduzir ARNm, e o ARNm de entrar no processo de degradação. Medindo steady-stComeram níveis de ARNm é conhecida por ser uma estimativa baixa de composição proteoma 1-3. Ao contrário, identificando ativamente traduzir-mRNA dá uma imagem mais precisa da produção de proteína. No entanto, estudos transcriptomic foram principalmente dirigida, no plano todo-organismo, comparando o ganho ou a perda de função de um factor específico para o tipo selvagem condição 4-7 ou no tecido dissecado, fazendo com que os perfis de expressão de gene de difícil interpretação. Recentes avanços em ferramentas de segmentação de células, purificação por afinidade e melhorias de sensibilidade permitem agora a realizar a nível genoma análises sobre as populações de células pequenas ou até mesmo células individuais em um organismo vivo. Em Drosophila, grandes colecções de linhas transgénicas permitir direccionamento temporal e espacial específica de diferentes tecidos e subpopulações de células através do sistema de GAL4 / UAS 8-10 originando quantificação mais precisa dos mecanismos moleculares necessários para a função celular. 11. Este método baseado na centrifugação em gradiente de sacarose permite a selecção da fracção de polissoma e determinação de ARNm traduzido à escala genoma quando analisados ​​com microarrays ou sequenciação de profundidade. Polissoma isolamento pode ser acoplado com a digestão da nuclease para identificar pegadas ribossomais correspondentes a fragmentos de ARN protegidas pelos ribossomas durante o processo de tradução 12. Footprinting Ribosomal aumenta a precisão da quantificação do RNA e tradução resolução RNA de nível sequência e posicionamento ribossomo, torna possível medir a taxa de tradução. No entanto, até à data não tem sido aplicado para o isolamento específico de células de translatomes, principalmente devido à forte redução no rendimento de ARN obtido no final do processo de footprinting ribossoma. Dado que a seleção de tamanho de RNA pode gerar potencial falso-positives de diferentes RNP que também poderia ser protectores de ARN de um modo semelhante, são necessários novos desenvolvimentos para melhorar ribossomal footprinting e adaptá-lo às abordagens específicos de células. Um desses métodos, o chamado Traduzindo Ribossoma A purificação por afinidade (TRAP) foi descrita em 2008 por Heiman et ai. e aplicado para isolar o translatome partir de um subconjunto de neurónios em ratos. Por epitopo de marcação de uma proteína ribossómica de uma forma específica do tipo de células-, polissomas pode ser purificado selectivamente sem o passo de dissociação de células trabalhoso e triagem. Neste caso, os ribossomal 60S da proteína L10A na superfície do ribossoma foi marcado com eGFP 13. Desde 2008, vários estudos têm utilizado este método em diferentes espécies, de ratos 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e peixe-zebra Arabidopsis thaliana 24. O método TRAP também foi adaptada para o modelo de Drosophila e utilizado para purimRNAs de células neuronais e astrócitos 26 25 FY-específicos de células-tipo. O sistema de GAL4 / UAS binário versátil foi utilizado para expressar RpL10A GFP marcadas de um modo específico do tecido. Chefes de moscas adultas foram dissecados para realizar a seleção polysome a partir de células neuronais (alvo de pan-neural motorista elav-Gal4) e RNAs isolados foram sequenciados. O grande número de genes regulados positivamente correspondeu aos conhecidos a ser expresso no sistema nervoso, o que indica que a abordagem tem boa especificidade e levando-nos para adaptá-lo às populações de células raros (menos de 1% das células) presente no desenvolvimento de embriões de Drosophila . Dentro do modelo de Drosophila, a fase embrionária é um modelo de escolha para o estudo de processos de desenvolvimento, como os actores moleculares e movimentos morfogenéticas são evolutivamente conservados. As abordagens transcriptomic apenas específicos de tecidos conduzidos até agora neste modelo foram realizados utilizando células ou então nuclearrting e só foram capazes de estudar transcriptoma de estado estacionário 27-31, criando uma necessidade de métodos dedicados ao tecido / específico de células translatome profiling no embrião da mosca. Aqui nós relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado a embriões de Drosophila. Com este método, envolvidos-em-tradução de mRNA numa população de células muito restrita de cerca de 100 células musculares por embrião foi isolado com sucesso com alta qualidade e especificidade. O sistema / UAS GAL4 binário é usado para conduzir a expressão de RpL10A marcadas com GFP na subpopulação de músculos sem qualquer toxicidade, há fenótipos aparentes ou atraso de desenvolvimento, como mostrado anteriormente 25. Embriões de Drosophila possuem 30 músculos por hemisegmento que darão origem à musculatura da larva. Ao utilizar uma região reguladora descoberta na proximidade do gene identidade desleixo, 6 dos 30 músculos multi-nucleadas são segmentados. Neste ensaio, os ribossomas são imobilizados sobre o ARNm utilizando o alongamento traduçãoinibidor cicloheximida. Os extractos citossólicos são então utilizados para a purificação por afinidade com esferas magnéticas revestidas com anticorpo GFP. Qualidade do RNA purificado foi validado utilizando Bioanalyzer. Quantitative PCR de transcrição inversa (RT-qPCR) foi usada para determinar a especificidade e sensibilidade de isolamento de ARNm e demonstraram que o protocolo optimizado é altamente eficiente.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

O sistema muscular somática embrionária Drosophila é composta por 30 músculos por hemisegmento, e cada músculo tem um conjunto específico de propriedades: Código de genes de identidade, posição, número de eventos de fusão, locais de fixação e inervação. Identificando ARNm traduzido em um subconjunto específico do músculo dará informação sobre as proteínas necessárias para formar estas características específicos do músculo. Utilizando o método à base de TRAP, o ARN a partir de uma subpopulação de músculos que expressam o gene de desleixo identidade foi purificado (Figura 1A-B). Uma preocupação importante desta abordagem é a qualidade e especificidade do RNA isolado. O protocolo otimizado relatado aqui habilitado recuperação sistemática de RNA de alta qualidade avaliada com análise Bioanalyzer. Os perfil mostra obtidos nenhuma degradação do RNA (Figura 1C). Em outros estudos desenvolvidos em torno do método TRAP, questões foram levantadas sobre a especificidade dos dados. Aqui nós improve método para suprimir o fundo ligada para a ligação não específica de ARN para os grânulos ou os tubos e pela optimização do tampão de lavagem. De modo a avaliar o nível de fundo e a eficiência de isolamento de células que expressam desleixo, que conduziu os ensaios de RT-qPCR em 3 repetições do mesmo estágio embrionário. Dobre-enriquecimentos de 4 genes diferentes (MEF2, desleixo, prospero, soxNeuro) foram calculados em relação a entrada e normalizado contra o gene RpL32 (Figura 1D). Estes resultados demonstraram enriquecimento de 2,3 vezes de MEF2 gene pan-musculares e enriquecimento de 5,6 vezes o gene de desleixo. Em contraste, os dois genes expressos no sistema neural foram reduzidos em comparação com a entrada. Valores muito similares foram observadas mudanças de dobragem em 3 réplicas biológicas, o que demonstra que o protocolo é robusta. Com desleixo-Gal4 condutor e começando com 1,5 g, cerca de 1,5x10 ^ 6 embriões foram obtidos que contêm 100 células de GFP / embrião (total de 150 x 10 ^ 6 positivacélulas). Depois de executar o experimento TRAP, o rendimento é de cerca de 25-45 ng de RNA específico dependendo do estágio de interesse. Este material é suficiente para executar a análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ usando um protocolo de amplificação para construir uma biblioteca de ARN-SEQ. Eficiência dependerá fortemente a força do piloto usada para expressar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Qualidade e avaliação especificidade do RNA isolado-TRAP de Slouch-GAL4&gt; embriões UASRpL10A-EGFP. (AB) imagens confocais de uma fase de embrião-16 que mostra a expressão RpL10A-EGFP especificamente nas células musculares seis Slouch por hemisegmento (A). Co-localização de RpL10A-EGFP com o general marcador músculo Beta3tubulin é observado na foto merge (B). (C) Controle de qualidade de Traped RNA ran no Bioanalyzer mostrando perfeita integridade de rRNA 18S e 28S. Análise (D) RT-qPCR mostrando alta especificidade das experiências de mRNA isolado armadilha em 3 repetições biológicas do estágio-16 embriões. Dobre mudança é calculada em comparação com entrada e normalizado contra o gene RpL32. Transcrições Mef2 presentes em todas as linhagens musculares são 2,3 vezes enriquecido em comparação com entrada Considerando transcrições desleixo mais restritos são-5.6-fold enriquecido. Células neurais que expressam prospero e genes soxN estão esgotados 2,2 vezes e 5,5 vezes, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K visualizações.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

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Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Genética

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Bioquímica

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Biologia do Desenvolvimento

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Biologia

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras

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Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de