The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Generation линия <ol><li> Создать два разных конструкций. В первом конструкции, RpL10A кДНК (рибосомной субъединицы белка L10A) клонировали ниже GFP в pUASP-PL-GFP-Гюнтер плазмиды (модифицированный вариант из 32). Использование зародышевой линии промотора позволяет более поливалентного использование трансгенной линии. ПРИМЕЧАНИЕ: Получить второй конструкцию путем клонирования регуляторную последовательность вождения тканеспецифичную экспрессию гена сутулиться вверх по течению GAL4 (TF), используя pPTGAL4 плазмиды. </li><li> Вводите плазмиды отдельно в ж 1118 мух и вставьте конструкции в лету генома путем введения Р-элемента (в соответствии со стандартной процедурой) 33. </li><li> Выберите трансформантов для того, чтобы восстановить летать линии с конструкциями на двух разных хромосомах. Последняя строка ловушка создается путем объединения этих двух линий (генетические кресты) для того, чтобы получить один двойной трансгенной стабильной линии. F0: W; Суо, БАС EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bх мас; суо / SCU; сутулиться Gal4 / TM6B. F1: W-; Суо, БАС EGFP :: RpL10A; Сутулиться Gal4 / TM6B. Массово усилить этот линии и собирать желании, постановочные эмбрионов. </li></ol> 2. эмбрионов <ol><li> Подготовка 8 больших клетки цилиндрическая населения, содержащие около 40 г молодых мух в клетку (около 180,000 мух / клетку). </li><li> Продолжайте так называемых предварительных скрутки, которые позволяют мухи, чтобы очистить развивающиеся эмбрионы из их яйцеводы. Для этого, лежала мух в течение 1 часа на двух 11 см диаметр чашки Петри, содержащие смесь затвердевшего агара и виноградного сока и покрывают ⅓ поверхности с свежеприготовленные дрожжевой пасты. После 3 обменов виноградного сока пластины собирать реальные эмбрионов на подобных свежеприготовленные пластин. ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации будет варьироваться в зависимости от развития временного окна учился. </li><li> Удалить пластины из клеток и оставить их при той же температуре в течение времени, необходимого для получения правильной стадии развития (например, 3 ч кладки + 10 ч AdditРациональная Инкубационный дает эмбрионы из стадии 10-13 ч после откладки яиц (AEL)). Ресуспендируют содержание плита (эмбрионы, дрожжи пасты, Мертвые мухи) с 50 мл воды, используя кисти. </li><li> Пройти через серию сит (700 мкм, 355 мкм, 112 мкм), чтобы отделить эмбрионы из мертвых мух и остальные части тела, и собирают эмбрионов удерживается на меньшего диаметра сито, затем кратковременно мыть в деионизированной воде. Не следует использовать более чем 18 пластин в сборе, как это может засорить сита. </li><li> Dechorionate эмбрионов в 4,5% хлорной в деионизированной воде в течение 2 мин и тщательно промойте деионизированной водой в течение 30-60 сек. Инкубируйте эмбрионов в PBS 0,01% Tween 20, 100 мкг / мл циклогексимида, в течение 5-10 мин при комнатной температуре при перемешивании. </li><li> Сухие эмбрионы на целлюлозных абсорбирующих листов и передавать их на микроцентрифужных труб. Взвесьте трубы и флэш-заморозить эмбрионы путем погружения в жидкий азот. На этой стадии высушенные эмбрионы могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при температуре -80 ° С. </li></ol><pкласс = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Подготовка магнитных шариков, соединенных с GFP антитела <ol><li> Тщательно ресуспендирования белка G магнитных шариков в оригинальной бутылке нежный агитации. </li><li> Передача 90 мкл из бисера в РНКазы без трубки и собирать их на магнит (30-60 сек). 90 мкл шариков необходимо выполнить иммунопреципитации (IP) 1 мл лизата, содержащие 60-80 мг / мл протеинов. Уважайте отношения для предотвращения насыщения шарик. Используйте несколько трубок в соответствии с количеством белка. </li><li> Бисер Вымойте с 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 мкл) и собирать шарики на магните, чтобы отбросить супернатант. Добавить 30 мкг GFP антител в 350 мкл PBS 0,01% Tween 20 с шариками и инкубируют при медленном конце над конца смесительной в течение 30 мин при комнатной температуре. </li><li> Сбор шарики на магните (30-60 сек), отбросить супернатант и промыть в 500 мкл буфера для экстракции полисом (HEPES 10 мМ, KCl 150 мМ, MgCl 2 5 мм, 0,5 мм DTT, 1% Тритон, циклогексимид 100 мкг / мл , Protease ингибитор 1 ×, РНКазы ингибитор 100 U). </li><li> Соберите бусы на магните и добавить 500 мкл блокирующего буфера (BSA 0,1 мкг / мкл дрожжевой тРНК, 0,1 мкг / мкл, гликоген 0,1 мкг / мкл в буфере для экстракции полисом). </li><li> Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре и повторить этот шаг один раз свежей блокирующем буфере. </li><li> Соберите бусы на магните и промыть в 500 мкл буфера для экстракции полисом, то вспомните шарики и немедленно приступить к шагу иммуноочистки (раздел 6). </li></ol> 4. Подготовка лизата <ol><li> Перед началом установки программы на разнонаправленного быстрая скорость бисером мясорубку: 2 × 10 сек при 5000 оборотов в минуту, 15 секунд паузы. Передача высушенные зародыши (1,5 г) в 15 мл пробирки prechilled на льду, содержащей полисом экстракционного буфера, и гомогенизируют немедленно. Однородный 1,5 г зародышей в 4 мл буфера для экстракции полисом. </li><li> Распространение гомогенизировали эмбрионов в двух prechilled 2 мл пробирки и растереть ЭмбриОС, запустив программу гомогенизатора. Передача лизата в чистые prechilled микроцентрифужных пробирках на льду и подготовить postnuclear супернатант центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 г. </li><li> Передача супернатант на свежий prechilled микроцентрифужных трубки на льду, добавление 1/100 объема пробы 10% Nonidet P-40 в супернатанте (конечная концентрация = 0,1%), и смешать его осторожно переворачивая пробирку. </li><li> Пульс-центрифуги образец в minifuge для сбора жидкости на дне пробирки, добавить 1/9 объема пробы 300 мм 1,2-Diheptanoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DHPC) (конечная концентрация = 30 мм ), смешать его осторожно переворачивая пробирку, и инкубируют смесь на льду в течение 5 мин (смесь путем обращения в несколько раз во время инкубации). </li><li> Подготовьте после митохондриальной супернатант центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 20000 г. Измерение концентрации белка по методу Брэдфорда: концентрация в лизате должна быть в пределах 60-80 мг / мл. ТАке супернатант в свежий prechilled микроцентрифужных трубки и немедленно приступить к стадии предварительного поглощения (раздел 5). </li></ol> 5. Предварительно поглощения <ol><li> Тщательно ресуспендирования магнитных шариков от осторожном перемешивании и передачи 30 мкл гранул, в микроцентрифужных трубки при комнатной температуре (30 мкл бисер / 1 мл лизата) эмбриональных. </li><li> Сбор шарики на магните, пипетки от надосадочной жидкости и ресуспендирования бисером в полисом экстракционного буфера (500 мкл). Сбор шарики на магните, добавить эмбриональных лизата и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° С на ротатора. <ol><li> Удалить шарики и держать супернатант на льду в течение стадии иммуноочистки. Перед иммуноочистки, держать 100 мкл супернатанта (входные), чтобы сравнить глобальной образец РНК с РНК образца собранной после иммуноочистки, по RT-КПЦР например. </li></ol></li></ol> 6. Иммуноочистка <ol><li> Добавить 1 мл (что соответствует 60-80 мг / мл белка) изпредварительно абсорбируют лизата к РНКазы пробирку, содержащую 90 мкл блокированных бусин, соединенных с GFP антитела. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 2 ч при осторожном конец поверх конца перемешивания в трубчатой ​​ротатора. Кроме того, выполнение инкубации o / n при 4 ° С. </li><li> После инкубации, собирать шарики на магните. Использование minifuge вращаться вниз шарики, то ресуспендирования их в 500 мкл промывочного буфера (Hepes 10 мМ, KCl 350, MgCl 2 5 мм, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 ммоль, циклогексимид 100 мкг / мл, РНКазы ингибитор 100 ед ) и собрать их на магните. Повторите этот шаг еще два раза. </li><li> Изменить шарики на новый prechilled РНКазы трубки и мыть два раза. Соберите бусы на магнит, и приступить к добыче РНК, добавив 1 мл TRIzol непосредственно с шариками и следуйте инструкциям изготовителя. </li></ol> 7. РНК Очистка и оценка качества <ol><li> Используйте комплект RNeasy Micro в соответствии с инструкциями изготовителя. По завершении, Elutе РНК с (х) мкл РНКазы свободной воды. Теплый течение 2 мин при 60 ° С, и магазин быстро замораживали образцы при -80 ° С. Проверьте качество РНК с помощью Bioanalyzer (следуйте инструкциям производителя). </li><li> Чтобы проверить специфичность TRAPed РНК, выполнять обратную транскрипцию 3 нг очищенной РНК (вход и IP) в соответствии с инструкциями изготовителя (надстрочными III). Используйте кДНК, полученной для количественной ПЦР с использованием геноспецифических наборы праймеров. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Эта статья описывает модифицированный протокол Переводы рибосом аффинной очистки (название «Ловушка-RC&quot;), посвященный изучению редких клеточных популяций в эмбрионах дрозофилы. Информация предоставляется на основных этапов для успешного выделения специфической РНК с выходом пригодных для микрочипов или РНК-SEQ анализа, т.е., 1) количество биологического материала, необходимого и оптимизированной процедуры эмбриона лизиса и экстракции полисом; 2) бисер / антитело к лизатов соотношениях для оптимального иммунопреципитацией; 3) шаги, позволяющий уменьшить фона в том числе буферной композиции стирки таким образом, чтобы работать TRAP-RC эксперименты с высокой специфичностью и чувствительностью. Этот протокол дает воспроизводимые данные делает его легко применены к другим типам клеток. Эта методика дает возможность проанализировать дифференциального экспрессию генов на уровне активно-переводе мРНК и, следовательно, проложить дорогу к пониманию экспрессию белка в спецификации<html> БР типа клеток на определенном временном окне. Заметим, однако, что белок обилие будет зависеть от скорости процессов перевода и деградации. Основным ограничением метода TRAP является невозможность для измерения содержания белка в точном количественном выражении или обнаружить посттрансляционную модификации. Улучшение количественного путем измерения плотности рибосом вдоль тела мРНК и, тем самым, в ячейки типа-специфическим образом можно сделать TRAP в сочетании с рибосома Footprinting очень мощный инструмент. В недавней работе 34, эта комбинация была выполнена в человеческих эмбриональных почек 293 клеток. Авторы побежал нуклеазную Footprinting затем с помощью аффинной очистки индуцибельного биотинилированной виде RpL10A использованием стрептавидином шарики. Это доказательство принципа, что можно выполнить с рибосомами Footprinting в целом организме, а нацелены на конкретную тип клеток, ограничение быть количество биологического материала, необходимого для этой цели. &quot;&gt; Выполнение TRAP эксперименты параллельно с глобальными транскриптомных анализов позволит отслеживать пропорции между вновь транскрипции и actively- перевод РНК. Это будет глубоко информативным потенциальных посттранскрипционных механизмов, происходящих в конкретных контекстах развития или конкретных клеточных популяций -по микроРНК, например. В заключение, ловушка является высокоэффективным, специфичным и чувствительным методом для выявления РНК, связанные с активно-переводе рибосом в порядке клеточно-специфической. Этот метод может быть использован в самых разнообразных организмов и типов тканей. Новый протокол TRAP-RC описано здесь был оптимизирован для редких клеточных популяций (менее 1% от общего числа клеток) и на количество конечного материала, достаточного для последующих анализов на уровне целого генома. Возможное ограничение этого метода является требование сильной водителя, чтобы произвести отмеченных рибосомы в количестве, достаточном для компете с эндогенными нетегированных них в адресной типа клеток. В недавнем исследовании 25, авторы оценкам 10-30% соотношение меченых против нетегированных рибосом. Чтобы преодолеть эту проблему растущего БАС-RpL10A-EGFP количество копий должно значительно улучшить этот баланс. Кроме того, добавление к описанным генетического фона в UAS-GAL4 трансген будет усиливать выработку белка GAL4 и косвенно повышать экспрессию RpL10A-EGFP. Это должно способствовать более заполняемость меченых рибосом на мРНК. Обратите внимание, что это уже эффективный подход может быть даже более мощным, адаптации дополнительные методы, чтобы принести больше количественный аспект или, чтобы обнаружить и распутать молекулярные механизмы, которые необходимы для контроля экспрессии генов.

Понимание того, как клетки приобретают специфические свойства во время разработки является решающим для того, чтобы оценить сложность органов и их потенциальной эволюции в сторону патологических условиях. Существует большой толчок исследование, чтобы расшифровать генные регуляторных сетей которые усиливают спецификацию и дифференцировку клеток по unrevealing глобальных профилей экспрессии генов, связывающий статус Поль II, размещение транскрипции фактором регуляторных последовательностей или пост-трансляционных модификаций гистонов. Для оценки экспрессии генов на глобальном уровне микрочипов и РНК-след подходы используются. Микромножества позволяют обнаруживать мРНК изобилие, тогда как РНК-SEQ лучше приспособленным информирования о различных типах РНК, включая кодирование и некодирующих РНК, как микроРНК, lncRNAs или snRNAs. Тем не менее, эти методы не могут отличить активно транскрипции, стационарное мРНК, активно-перевод мРНК, и мРНК ввода процесс деградации. Измерение установившегося улели уровни мРНК, как известно, плохой оценка протеома композиции 1-3. Наоборот, выявление активно-перевод мРНК дает более точную картину производства белка. Тем не менее, транскриптомных исследования в основном велись на уровне организма в целом, сравнивая прибыль или потерю функций специфического фактора дикого типа состояния 4-7 или рассеченной ткани, что делает профили экспрессии гена трудно интерпретировать. Последние достижения в области ориентированных на инструменты клеток, аффинной очистки и улучшения чувствительности в настоящее время позволяют выполнять генома анализы на небольших популяций клеток или даже отдельных клеток в живом организме. У Drosophila, большие коллекции трансгенных линий позволяют конкретную временную и пространственную ориентацию различных тканей и клеточных субпопуляций с помощью системы GAL4 / UAS 8-10, дающий более точные количественное молекулярные механизмы, необходимые для функционирования клеток. 11. Этот метод основан на градиенте сахарозы центрифугирования позволяет выбор полисом фракции и определения мРНК переводится генома при анализе с микрочипов или глубокой последовательности. Полисом изоляция может быть соединен с нуклеазой для идентификации рибосомных следы, соответствующие фрагментам РНК защищенных рибосом в процессе перевода 12. Рибосомальная футпринтинга увеличивает точность количественного перевода РНК и разрешения последовательность уровня РНК рибосом и позиционирования, позволяет измерить скорость перевода. Тем не менее, на сегодняшний день она не применяется к изоляции клеток, специфической translatomes, в основном из-за сильного снижения доходности РНК, полученной в конце рибосомы процесса Footprinting. Учитывая, что выбор размера РНК может генерировать ложные потенциальную р-ositives из различных РНП, которые также могут быть защитными РНК аналогичным образом, дальнейшее развитие необходимы для улучшения рибосомальной Footprinting и адаптировать его к клеточно-специфической подходов. Одним из таких методов, называемый Перевод Рибосомы Аффинная очистка (TRAP) был описан в 2008 году Heiman др. и прикладной для изоляции translatome из подмножества нейронов у мышей. По эпитоп пометки рибосомного белка в клетки типа-специфическим образом, полисом может быть выборочно очищен без кропотливой этапе клеток диссоциации и сортировки. В этом случае, 60S рибосомных белков L10A на поверхности рибосомы был помечен EGFP 13. С 2008 года несколько исследований использовали этот метод у разных видов, от мышей 14-19 в X. Laevis 20,21, 22,23 и данио арабидопсиса THALIANA 24. Метод TRAP также была адаптирована к модели Drosophila и используется для PuriFY типа клеток-специфических мРНК из нейронов и астроцитов 25 26. Универсальный двоичная система GAL4 / UAS был использован, чтобы выразить GFP-тегами RpL10A в ткани-специфическим образом. Главы взрослых мух рассекали выполнять выбор полисом от нервных клеток (мишенью пан-нейронных водителя Elav-Gal4) и изолированных РНК секвенировали. Большое количество повышающей регуляции генов соответствовали группам, указанным как известно, выражается в нервной системе, что свидетельствует о том, что подход имеет хорошую специфичность и побуждая нас, чтобы приспособить его к редким клеточных популяций (менее 1% клеток) присутствует в развивающихся эмбрионах Drosophila , В рамках модели дрозофилы, эмбриональная стадия является модель выбора для изучения процессов развития, как молекулярные актеры и морфогенетические движения эволюционно консервативны. Единственный тканеспецифические транскриптомных подходы, проведенные до сих пор в этой модели были выполнены с помощью мобильного или ядерная такrting и только смогли изучить стационарный транскриптом 27-31, создавая потребность в методах, посвященных ткани / клеток конкретных профилирования translatome в летучей эмбриона. Здесь мы сообщаем первый протокол TRAP, посвященный эмбрионов дрозофилы. С помощью этого метода, занимается-в-трансляции мРНК в очень ограниченной популяции клеток около 100 клеток на мышечные эмбриона успешно выделен с высоким качеством и специфичности. Двоичный GAL4 / система БАС используется для управления экспрессией GFP-тегами RpL10A в субпопуляции мышц без токсичности, не очевидные фенотипы или задержка развития, как показано ранее 25. Эмбрионы Drosophila обладают 30 мышцы за hemisegment, что приведет к мускулатуре личинки. При использовании регуляторную область обнаруженную в непосредственной близости от гена идентичности сутулость, 6 из 30 мульти-дро мышц ориентированы. В этом анализе, рибосомы, иммобилизованного на мРНК с помощью перевода удлинениеингибитора циклогексимид. Цитозольные экстракты затем используется для аффинной очистки с GFP покрытых антителами магнитных шариков. Качество очищенной РНК проверены с использованием Bioanalyzer. Количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-КПЦР) был использован для определения специфичности и чувствительности изоляции мРНК и показали, что наш оптимизированный протокол является высокоэффективным.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Дрозофилы эмбриональных соматических мышечная система состоит из 30 мышц в hemisegment, и каждая мышца имеет определенный набор свойств: код генов, удостоверяющих личность, должность, номер событий термоядерных, местах прикрепления и иннервации. Определение перевод мРНК в определенном мышц подмножества даст информацию о белках, необходимых для формирования этих специфических характеристик мышц. Использование метода TRAP основе, РНК из субпопуляции мышц экспрессировать ген идентичность сутулость очищали (1А-В). Одной из основных проблем этого подхода является качество и специфичность выделенной РНК. Оптимизированный протокол сообщили здесь включен систематическое восстановление высококачественной РНК оценивается с анализом Bioanalyzer. Полученный профиль показывает не деградация РНК (рис. 1в) В других исследованиях, разработанных по методу ловушка, были подняты вопросы по специфике данных. Здесь мы яmprove метод для подавления фона, связанного с неспецифического связывания РНК с гранулами или трубок и оптимизации промывочным буфером. Для того чтобы оценить уровень фонового и эффективность изоляции сутулость-экспрессирующих клеток, мы привели RT-КПЦР испытания на 3 повторов одного и того же эмбриональной стадии. Сложите-обогащения 4 различных генов (Mef2, сутулятся, Просперо, soxNeuro) были рассчитаны по сравнению с входом и нормализуется против гена RpL32 (рис 1D). Эти результаты показали, 2.3-кратное обогащение пан-мышечных MEF2 генных и 5,6-кратным обогащением гена сутулиться. В противоположность этому, эти два гена, выраженные в нервной системы были истощены сравнению с входом. Очень похожие значения кратные изменения наблюдались на 3 биологических повторяет, демонстрируя, что протокол является надежной. С водителем сутулиться-Gal4 и, начиная с 1,5 г, около 1.5x10 ^ 6 эмбрионов были получены, которые содержат 100 GFP клеток эмбриона / (в общей сложности 150 × 10 ^ 6 положительнымклетки). После запуска эксперимента ловушка, выход составляет около 25-45 нг специфической РНК в зависимости от стадии-на-интерес. Этот материал достаточно, чтобы запустить анализ микрочипов или РНК-SEQ, используя протокол усиления построить РНК-след библиотеку. Эффективность будет сильно зависеть от прочности используемого драйвера, чтобы выразить RpL10A-EGFP. <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Рисунок 1. Качество и оценка специфика TRAP-изолированными РНК из сутулиться-GAL4&gt; эмбрионов UASRpL10A-EGFP. (АВ) Конфокальные образы этап-16 эмбриона, показывая выражение RpL10A-EGFP в частности, в шести сутулиться мышечных клеток на hemisegment (A). Со-локализация RpL10A-EGFP с общей мышечной маркера Beta3tubulin наблюдается на картинке слияния (B). (С) Контроль качества TRAPed РНК РАн на Bioanalyzer показывая целостности и рРНК 18S и 28S. Анализ (D), РТ-КПЦР показывая высокую специфичность ловушки-изолированные экспериментов мРНК на 3 биологических повторяет сценических-16 эмбрионов. Сложите изменение рассчитывается по сравнению с входом и нормализуется против гена RpL32. Mef2 стенограммы присутствующие во всех мышечных линий являются 2,3 раза обогащенного по сравнению с входом в то время как более ограниченные сутулиться транскрипты 5,6 раза обогащенного. Нервные клетки, экспрессирующие Просперо и soxN гены истощены в 2,2 раза и 5,5 раза соответственно,. Усы представляют стандартное отклонение (п = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Ловушка-RC, переводя рибосом Affinity Очистка от редких клеточных популяций<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Вертикальная съемка Drosophila Эмбрионы

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Очистка стенограммы и метаболитов из<em&gt; Drosophila</em&gt; Главы

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...