نظام GAL4-UAS ثنائي الأطراف هو أداة متعددة الاستخدامات للتحليل الجيني الوظيفي في أنوفيليس غامبيا من خلال التعديل الوراثي للتعبير الجيني بطريقة محكومة بالفضفضة. النظام الثنائي يتيح المرونة في النهج التجريبية لتوصيف phenotypic التعبير transgene حتى لو تم تحريض تكاليف اللياقة البدنية الشديدة. يمكن استخدام هذا النظام في التوصيف الظاهري للجينات التي يحتمل أن تشارك في مقاومة المبيدات الحشرية أو انتقال مسببات الأمراض أو تلك التي لها استخدامات في أساليب التحكم الجيني.
فريزر كولمان، فني أبحاث، سوف تساعد على إظهار هذا الإجراء تبدأ عن طريق جمع الخوخ باستخدام ماصة باستور البلاستيك ثلاثة ملليلتر مع قطع نهاية قبالة على طبق مسطح واضحة مناسبة للاستخدام مع المجهر ستيريو. إزالة بعناية معظم المياه حول الخوخ. بدوره على لمبة الفلورسنت والسماح لها الاحماء.
النظر في أنماط اللون spatiotemporal من التعبير ونسبة الأنماط الظاهرية المختلفة التي من المتوقع عند فحص لعلامة الفلورسنت. حدد الفلتر المطلوب على مجسمة الفلورسينس وتحقق من وجود شعاع ملون من الضوء المرئي موجه إلى وسط لوحة المسرح. تحت الضوء الأبيض، مركز الخوادر في مجال الرؤية وجعلها في التركيز.
قم بإيقاف تشغيل الضوء الأبيض واستخدم التركيز الدقيق لجعل منطقة الخوادر تحمل النمط الظاهري للاهتمام مع نمط فلوري مرئي في التركيز. استخدام فرشاة الطلاء تفاصيل دقيقة لتحويل بلطف الخوادر وتحريك المجاذيف الشرجية بحيث يمكن التعرف على الأعضاء التناسلية الخارجية. جروة منفصلة على أساس الأعضاء التناسلية الخارجية المميزة.
الذكور لديهم أنبوب طويل أن ينقذم من الجزء الظهري النهائي ما يقرب من نصف طول المجاذيف الشرجية. الأعضاء التناسلية الخارجية للجرو الأنثوي أقصر بكثير وbifurcate. فصل الخوادر جنس إلى مجموعات من 10 أو أقل في أنابيب واضحة 20 ملليلتر مع الماء، وختم الأنابيب مع كرة من القطن والصوف.
يستنشق العدد المطلوب من البالغين الذكور والإناث من الأنابيب إلى قفص أو دلو صغير ، مع الحرص على عدم إلحاق الضرر بالبالغين أثناء هذا النقل. الحفاظ على الصليب لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل تغذية الدم. في اليوم التالي، يمكن جمع البويضات لدراسة نمو الجنين.
تجميع غرفة oviposition وإدخال بعناية 10 إلى 15 الإناث التي تغذيها الدم في ذلك. تغطية غرفة oviposition وترك لمدة 20 دقيقة. فصل بعناية أنبوب البولي بروبلين 50 ملليلتر من وعاء oviposition، مع التأكد من عدم الإفراج عن البعوض.
يغطى القدر ويترك البيض ينضج إلى مرحلة النمو من الاهتمام. التقاط البيض من وعاء باستخدام فرشاة الطلاء تفاصيل دقيقة ووضعها على الماء في كتلة الزجاج حفر 40 ملليمتر مربع. إزالة المياه بعناية من كتلة الزجاج مع micropipette وتغطية البيض في 500 ميكرولتر من FAA.
تذبذب بلطف على شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شطف البيض جيدا 15 مرة مع الماء المقطر لإزالة جميع آثار حل FAA. باستخدام 1000 ميكرولتر micropipette إضافة ثم إزالة ملليلتر واحد من الماء المقطر في وقت واحد مع الحرص على عدم الإضرار البيض أثناء القيام بذلك.
يغطى البيض الثابت بميليلتر واحد من محلول Trpis ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. سيبدأ البيض في تطوير بقع شاحبة بعد خمس دقائق من الحضانة التي تصل في نهاية المطاف إلى لون أبيض حليبي بمجرد مسحه. شطف البيض جيدا 15 مرات مع الماء المقطر لإزالة جميع آثار محلول Trpis.
ويلاحظ التعبير عن علامات الفلورسنت التي يقودها المروج 3xP3 في العينين والعصابات البطنية من الخوخ غامبي Anopheles. باستخدام علامات الفلورسنت الملونة المختلفة يسمح اختيار وفحص الأفراد المعدلة تحمل مختلف GAL4 ومكونات UAS. عند العمل مع نظام GAL4-UAS ثنائي الأطراف ، من الضروري عبور الذكور والإناث من سلالات مختلفة للحصول على ذرية تحمل مكونات GAL4 و UAS.
يستخدم المورفولوجيا التفاضلية التي لوحظت في الأعضاء التناسلية الخارجية للذكور والإناث من الخوادر لممارسة الجنس. يتم تسليط الضوء هنا على مثال لجروة لا يمكن التعرف عليها. إزالة جميع المياه من الخوادر ، كما هو مبين على اليمين ، يزيد من صعوبة الجنس حيث تحجب المجاذيف الشرجية تصور الأعضاء التناسلية.
يسمح نظام GAL4-UAS ثنائي الأطراف بتعديل التعبير الجيني بطريقة ندواتية متحكم فيها. ويمكن تصور هذا عن طريق عبور oenocyte وGAL4 في كل مكان أربعة التعبير عن خطوط السائق مع خط المستجيب UAS-mCherry. فائدة رئيسية لاستخدام نظام GAL4-UAS ثنائي الأطراف هي سهولة دراسة الأنماط الظاهرية القاتلة حتى في المرحلة الجنينية.
للقيام بذلك ، من الضروري تصور مورفولوجيا الداخلية للأجنة. يمكن رؤية الخصائص المورفولوجية الطبيعية التي لوحظت في مراحل مختلفة من النمو الجنيني في 12 و 24 و 36 ساعة بعد الولادة بعد الانتهاء من بروتوكول إزالة الأجنة. من الضروري طوال هذا الإجراء عدم السماح للجراء والبيض بالجفف.
لذلك، من المهم العمل بسرعة عند إزالة السوائل. وقد سمحت لنا طريقة GAL4-UAS بالتوصيف الوظيفي للجينات المشاركة في مقاومة المبيدات الحشرية وتلك التي لها استخدامات محتملة في أساليب التحكم في محركات الجينات.
